способ определения детергента в пробе

Формула изобретения

Способ определения детергента в пробе, включающий регистрацию скорости гемолиза в изотоническом водном растворе, содержащем стандартную взвесь эритроцитов, в присутствии пробы и без нее, отличающийся тем, что предварительно в раствор добавляют глициновый буфер с рН 2-2,5, индуцирующий кислотный гемолиз, и определяют детергент по увеличению скорости кислотного гемолиза в присутствии пробы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в травматологии и стоматологии для оценки токсичности костного цемента и пластмасс по выходу из них мономеров, в биохимии для определения детергентов в биологических жидкостях и тканях, в области санитарии и гигиены для обнаружения детергентов в водных средах, в фармакологии для тестирования гемолитической активности лекарственных препаратов.

Токсичность детергентов, как поверхностно-активных веществ, заключается в их способности разрушать биологические мембраны путем дезорганизации липидного бислоя. Эту способность детергентов используют для их выявления и количественного определения в водных растворах.

Известен общепринятый способ определения детергента в пробе по регистрации скорости гемолиза в изотоническом водном растворе (Калер Г.В., Рачковский Л.И., Окунь И.М. Гемолиз эритроцитов детергентами - математическая модель и анализ концентрационных и кинетических кривых. // Цитология. - 1986. - Т.28. - № 9. - С.954).

Недостатком способа является его низкая чувствительность. Низкая чувствительность способа обусловлена тем, что зарегистрировать скорость гемолиза, индуцированного детергентом, возможно только при достижении определенной пороговой концентрации детергента в пробе.

Задачей изобретения является повышение чувствительности способа определения детергента в пробе при низких концентрациях детергента.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе определения детергента в пробе, включающем регистрацию скорости гемолиза в изотоническом водном растворе, содержащем стандартную взвесь эритроцитов, в присутствии пробы и без нее, согласно изобретению предварительно в раствор добавляют глициновый буфер с рН 2-2,5, индуцирующий кислотный гемолиз, и определяют детергент по увеличению скорости кислотного гемолиза в присутствии пробы.

Заявляемый способ основан на впервые обнаруженном эффекте ускорения детергентом кислотного гемолиза. Для индукции кислотного гемолиза в изотонический водный раствор, содержащий стандартную взвесь эритроцитов, добавляют глициновый буфер со значением рН 2-2,5. Буфер используют с целью предотвращения возможного влияния пробы, содержащей детергент, на кислотность среды. Способ обладает большей чувствительностью по сравнению с прототипом, так как увеличение скорости кислотного гемолиза в присутствии детергента удается зарегистрировать при более низких концентрациях детергента в пробе по сравнению с прототипом, где в присутствии детергента регистрируют скорость детергентного гемолиза (см. табл.1).

Возможна количественная оценка содержания детергента в пробе по следующей формуле:

Х=К(V₀-V_к), где

К - коэффициент пересчета, мкМ/dЕ 800/мин.

V₀ - скорость гемолиза в присутствии пробы, dЕ 800/мин.

V_к - скорость кислотного гемолиза без пробы, dЕ 800/мин.

Способ может быть осуществлен, например, следующим образом.

Получают примерно 1 мл цитратной крови лабораторного кролика. Кровь трижды отмывают физиологическим раствором. Для этого ее центрифугируют в течение 5 минут при скорости 1500 об./мин, сливают плазму и к эритроцитам добавляют 10-15 мл физиологического раствора; после перемешивания взвесь центрифугируют в течение 5 минут при скорости 1500 об/мин, сливают надосадок и процедуру повторяют еще два раза. К взвеси отмытых эритроцитов добавляют физиологический раствор до получения стандартной взвеси эритроцитов: оптическая плотность стандартной взвеси при длине волны 700-800 нм должна равняться 0,560±0,010 после ее разбавления в 8 раз физиологическим раствором. В термостатированную при 37°С кювету спектрофотометра вносят 0,6 мл физиологического раствора, прогревают кювету в течение 3 минут, после чего в нее последовательно вносят 0,1 мл стандартной взвеси эритроцитов и 0,1 мл 0,1 М глицинового буфера со значением рН 2-2,5 (общий объем инкубационной смеси составляет 0,8 мл). Скорость кислотного гемолиза регистрируют каждые 5 секунд инкубации по убыли оптической плотности при длине волны 700-800 нм. Максимальная разность значений оптической плотности, рассчитанная на единицу времени, соответствует контрольной скорости гемолиза (скорость гемолиза без пробы) - Vк (dE 800/мин). В другую термостатированную при 37°С кювету спектрофотометра вносят изотонический водный раствор детергента (пробу) до объема 0,6 мл. Кювету прогревают в течение 3 минут, после чего в нее последовательно вносят 0,1 мл стандартной взвеси эритроцитов и 0,1 мл 0,1 М глицинового буфера со значением рН 2-2,5 (общий объем инкубационной смеси составляет 0,8 мл). Скорость кислотного гемолиза регистрируют каждые 5 секунд инкубации по убыли оптической плотности при длине волны 700-800 нм.

Максимальная разность значений оптической плотности, рассчитанная на единицу времени, соответствует опытной скорости гемолиза (скорости гемолиза в присутствии пробы) - Vo (dE 800/мин).

Способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.

Пример 1. Определение метилметакрилата (токсический компонент костного цемента и некоторых пластмасс). Для определения метилметакрилата по предлагаемому способу были использованы различные концентрации 1%-ного раствора метилметакрилата в физиологическом растворе (пробы). Результаты представлены в табл.1.

Таблица 1 Результаты определения метилметакрилата в пробе
Концентрация метилметакрилата (мкМ)	Скорость гемолиза по заявляемому способу (dЕ800/мин)		Скорость гемолиза по прототипу (dЕ800/мин)
	Vк	Vo
1,2	0,020	0,031	0
2,4	0,020	0,040	0
3.6	0,020	0,053	0
4.8	0,020	0,065	0

Из табл.1 видно, что по заявляемому способу во всех пробах при малых концентрациях метилметакрилата регистрируется повышение скорости кислотного гемолиза в присутствии детергента (V _o выше V_к). По способу - прототипу скорость гемолиза в присутствии пробы не регистрируется. Следовательно, чувствительность предлагаемого способа выше по сравнению с прототипом.

Возможно количественное определение метилметакрилата в пробе. Измельченный образец пластмассы - 0,5 г полиметилметакрилата инкубировали в течение трех часов в 2 мл физиологического раствора при постоянном перемешивании для извлечения несвязавшегося мономера в изотонический водный раствор. Количественное определение монометилметакрилата в пробе осуществляли путем регистрации Vo в присутствии надосадочной жидкости (пробы) и Vк без пробы. Получены следующие значения: Vo=0,031 dЕ 800/мин; Vк=0,020 dE 800/мин (см. табл.1). По экспериментальным данным, представленным в табл.1, коэффициент пересчета К=111 мкМ/dЕ 800/мин. В соответствии с расчетной формулой содержание метилметакрилата (Х) в пробе составляет:

Х=111(0,031-0,020)=1,2 (мкМ)

Пример 2. Определение сапонина в пробе.

Пороговая концентрация гемолитического действия сапонина фирмы “Merk” определена экспериментально и составляет 7 мкг/мл. Для исследования выбрана подпороговая концентрация сапонина - 3 мкг/мл. Результаты определения сапонина в пробе (0,125% изотонический раствор сапонина (“Merk”)) по заявляемому способу и по прототипу представлены в табл.2.

Таблица 2 Результаты определения сапонина в пробе
Концентрация сапонина (мкг/мл)	Скорость гемолиза по заявляемому способу (dЕ 800/мин)		Скорость гемолиза по прототипу (dЕ 800/мин)
	Vк	Vo
3	0,020	0,053	0

Из табл.2 видно, что при концентрации детергента (сапонина) меньше пороговой, в присутствии пробы регистрируется только повышение скорости кислотного гемолиза по заявляемому способу. Скорость детергентного гемолиза по способу - прототипу не регистрируется, то есть детергент не выявляется. Это еще раз подтверждает более высокую чувствительность заявляемого способа.

Заявляемый способ позволяет не только повысить чувствительность определения детергента в пробе, но и уменьшить трудозатраты для проведения анализа. Так в прототипе требуется длительная инкубация (1-6 часов) детергента с эритроцитами и по ходу инкубации отбор контрольной и опытной проб, их центрифугирование и определение оптической плотности. В предлагаемом способе регистрация динамики гемолиза может быть компьютеризирована и продолжается от 10 до 30 минут.