композиции, предназначенные для улучшения фертильности

Формула изобретения

1. Применение ингибитора дипептидилпептидазы IV при получении терапевтической композиции для усиления фертильности.

2. Применение по п. 1 для лечения бесплодия или для содействия оплодотворению.

3. Применение по п. 1 или 2, где терапевтическая композиция предназначена для лечения бесплодия в результате наличия синдрома поликистоза яичников.

4. Применение по пп. 1, 2 или 3, где ингибитор дипептидилпептидазы IV содержит аминоацилпирролидин-нитрил.

5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где терапевтическая композиция составлена для перорального введения.

6. Применение по п. 5, где терапевтическая композиция составлена в виде таблеток или капсул.

7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где один или более ингибиторов дипептидилпептидазы IV представляет собой единственный компонент терапевтической композиции, которая является активной в отношении указанного предписания.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к химическим агентам и композициям, предназначенным для улучшения фертильности животных, особенно женских особей, обычно человека.

Ингибиторы DP-IV

Дипептидилпептидаза IV (DP-IV, а также дипептидиламинопептидаза IV, DPP-IV, DAP-IV, ЕС 3.4.14.5) представляет собой сериновую пептидазу, которая отщепляет аминоконцевой дипептид от пептидов и протеинов. Она распознает субстраты, в которых N-терминальная последовательность представляет собой Х-Рrо или Х-АIа. Ингибиторы DP-IV были предложены для использования в качестве терапевтических агентов, предназначенных для лечения воспалительных заболеваний и синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Обычно известные ингибиторы DP-IV представляют собой аналоги субстрата. Примерами ингибиторов DP-IV могут служить вещества, раскрытые в DD 296075 А5 (Neubert с сотр., ноябрь 1991), WO 91/16339 (Bachovchin с сотр., октябрь 1991), WO 93/08259 (Bachovchin с сотр., апрель 1993), WO 95/15309 (Jenkins с сотр., июнь 1995), WO 98/19998 (Villhauer, май 1998), WO 99/46272 (Scharpe с сотр., сентябрь 1999) и WO 99/61431 (Demuth с сотр., декабрь 1999). Пролекарства некоторых из указанных ингибиторов описаны также в WO 99/67278 и WO 99/67279 (обе заявки Demuth с сотр., декабрь 1999).

В следующих ниже схемах представлены основные типы соединений, являющихся ингибиторами DP-IV, а также конкретные примеры тех соединений, которые являются предпочтительными веществами настоящего изобретения; в схемах также даны ссылки на патентные документы, в которых раскрыт обширный ряд соединений, из которых выбраны указанные выше типы и примеры. Следует отметить, что все ингибиторы DP-IV, раскрытые в описаниях цитированных DD и WO заявок, могут использоваться в настоящем изобретении, и ссылки на указанные известные патентные документы приведены для полной информации, касающейся общих и более конкретных формул и рассматриваемых индивидуальных соединений. Так, например, указанные в следующей ниже таблице пирролидиновые и тиазолидиновые кольца могут быть заменены большим числом других гетероциклов с различными размерами кольца и/или, как отмечается в упомянутых публикациях, указанные аминоацильные фрагменты могут быть заменены на большое число других групп, с получением других ингибиторов DP-IV, предназначенных для использования в настоящем изобретении.

Аминоацилпирролидиды и тиазолидиды (см. DD 296075 А5), например

Аминоацил пирролидинальдегиды (см. DD 296075 А5 и WO 95/15309), например

Аминоацилпирролидинбороновые кислоты (см. WO 91/16339 и

WO 93/08259), например

нитрилы аминоацилпирролидина (см. WO 95/15309 и WO 98/19998), например

Синдром поликистоза яичников

Синдром поликистоза яичников (PCOS, синдром Штейна Левенталя) представляет собой болезненное состояние, характеризующееся уплотнением овариальной капсулы и образованием множественных фолликулярных кист. Указанное заболевание может приводить к бесплодию и аменорее. В результате нарушаются уровни циркуляции гормонов - повышается количество лютеинизирующего гормона (LH) и стероидов и понижается содержание фолликулостимулирующего гормона. Хотя предполагается, что это явление есть следствие аномальной секреции гонадотропинвысвобождающего гормона (GnRH) из гипоталамуса, физиологический дефект, лежащий в основе PCOS, остается предметом обсуждения. Применение лечебных схем, регулирующих уровни содержания LH и FSH, может приводить к успешно завершаемому оплодотворению, однако такие схемы достаточно сложны и дорогостоящи. Авторы настоящего изобретения установили, что ингибиторы DP-IV могут применятьсядля лечения PCOS.

Первый аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, предназначенной для лечения бесплодия, причем рассматриваемая композиция отличается тем, что она включает в себя ингибитор DP-IV. Второй аспект настоящего изобретения относится к новому применению ингибиторов DP-IV для лечения бесплодия, особенно женского бесплодия, связанного с PCOS. Третий аспект настоящего изобретения относится к улучшенной схеме, обеспечивающей оплодотворение у субъектов с PCOS, причем такая схема включает в себя прием указанным субъектом композиции, содержащей ингибитор DP-IV.

Такой способ применения ингибиторов DP-IV обладает многими преимуществами над традиционными схемами лечения, включающими в себя применение агонистов GnRH, а также FSH и LH. LH и FSH представляют собой крупные пептиды, которые выделяют из природных источников (обычно из женской мочи в постклимактерический период) или готовят в культурной среде с использованием рекомбинантных клеток. При выделении из мочи необходимо обращать внимание на опасность передачи заболевания и наличие антигенных белковых примесей. В случае рекомбинантных гормонов вероятность передачи человеческих патогенов уменьшается, однако такие материалы все еще могут быть загрязнены антигенным белком, и они существенно более дорогостоящие, чем мочевые белки. Кроме этого, рекомбинантные пептиды обычно не дают картину полностью “очеловеченного” гликозилирования, что должно приводить к антигенности и пониженной эффективности. GnRH-агонисты обычно представляют собой декапептиды, получение которых требует многостадийного синтеза. В отличие от указанных выше материалов, ингибиторы DP-IV представляют собой небольшие молекулы, которые легко доступны с помощью стандартных синтетических методов. Рассматриваемые материалы не являются антигенными, их легко очищать и они характеризуются низкой стоимостью.

Другое преимущество состоит в том, что во многих случаях ингибиторы DP-IV являются биологически активными веществами при пероральном применении. Это отличает их от агонистов GnRH, FSH и LH, которые следует применять путем инъекций. Следовательно, применение ингибиторов DP-IV может осуществляться по менее инвазивной схеме, вызывающей меньший стресс у пациента.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению особенно эффективна для лечения женского бесплодия. Предпочтительно, чтобы причиной указанного бесплодия служил синдром поликистоза яичников. Указанная композиция характеризуется тем, что она включает в себя ингибитор DP-IV. Кроме этого, рассматриваемая композиция может включать в себя такие известные в данной области фармацевтически применимые эксципиенты, как разбавители, носители, наполнители, связующие вещества, диспергаторы, стабилизаторы и т.д.

В контексте настоящего изобретения соединение считаетсяингибитором DP-IV, если оно ингибирует действие фермента при концентрации 1 мкм. Предпочтительно, когда рассматриваемое соединение ингибирует действие DP-IV при концентрации ниже 100 нМ и не ингибирует другие ферменты при концентрации ниже 1 мкМ. В следующих ниже схемах представлены основные типы ингибиторов DP-IV, а также их конкретные примеры, которые предпочтительно применять в настоящем изобретении; в схемах также приведены ссылки на патентные источники, из широкой сферы которых, касающейся раскрытых соединений, взяты указанные типы и примеры. Следует подчеркнуть, что ингибиторы DP-IV, раскрытые в описаниях цитированных DD и WO заявок, могут применяться в настоящем изобретении, и на эти документы непосредственно ссылаются для полной информации по общим и более конкретным вопросам, касающимся формул и рассматриваемых индивидуальных соединений. Так, например, в представленных ниже схемах указанные пирролидиновые и тиазолидиновые кольца могут быть заменены большим числом других гетероциклов с различными размерами кольца и/или указанные аминоацильные фрагменты, в соответствии с указанными публикациями, могут быть заменены большим числом других групп, с получением других ингибиторов DP-IV, предназначенных для использования в настоящем изобретении.

Аминоацилпирролидиды и тиазолидиды (см. DD 296075 А5), например

Аминоацилпирролидинальдегиды (см. DD 296075 А5 и WO 95/15309), например

Аминоацилпирролидинбороновые кислоты (см. WO 91/16339 и

WO 93/08259), например

Нитрилы аминоацилпирролидина (см. WO 95/15309 и WO 98/19998), например

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения, ингибитор DP-IV представляет собой нитрил аминоацилпирролидина. Особенно предпочтительными веществами такого типа могут служить нитрилы аминоацилпирролидина, раскрытые в WO 95/15309 и WO 98/19998.

Композиции настоящего изобретения могут быть сформированы для применения на человеке любым известным методом, включая пероральное применение, введение через слизистые оболочки (например, трансбуккальное, сублингвальное, интраназальное,вагинальное и ректальное применение), трансдермальное применение или применение в виде инъекций (включая внутривенную, внутримышечную и подкожную инъекции). Предпочтительным путем применения является пероральный прием. В этом случае композицию формируют в виде таблетки или капсулы.

Настоящее изобретение предусматривает новое применение соединений, являющихся известными ингибиторами DP-IV, в качестве терапевтических агентов для лечения бесплодия, особенно женского бесплодия, связанного с синдромом поликистоза яичников.

Настоящее изобретение предусматривает улучшенный способ лечения бесплодия, особенно женского бесплодия, связанного с PCOS, согласно которому на пациенте применяют фармацевтическую композицию, включающую в себя терапевтически эффективное количество ингибитора DP-IV. Рассматриваемое лечение может включать в себя индивидуальное применение указанных соединений или их совместное применение с упомянутыми выше другими агентами. Применение может проводиться в виде разовой дозы, или в виде раздельных доз с интервалом, например, в 2-6 часов. Курс лечения может составлять один день или несколько дней или недель до достижения требуемого клинического эффекта. Примерами подходящих конечных показателей лечения могут служить оплодотворение яйцеклетки (в случае естественного оплодотворения), а также успешное образование неоплодотворенных яйцеклеток или успешная имплантация эмбриона(в случае искусственного оплодотворения). Детали, касающиеся дозировки и длительности лечения, будут определяться лечащим врачом.

Примеры

Пример 1. Приготовление ингибиторов.

Ингибиторы DP-IV могут быть получены с использованием методов, описанных в литературе. Синтез нитрилов аминоацилпирролидина описан в WO 95/15309 и WO 98/19998. Ниже описан способ, служащий иллюстрацией указанных методов.

Пример 1А - Синтез (2S)-N-изолейцилпирролидин-2-карбонитрила.

(а) трет-Бутилоксикарбонил-изолейцилпролинамид

К перемешиваемой суспензии гидрохлорида пролинамида (225 мг, 1,50 ммоля) в сухом дихлорметане (15 мл) добавляли диизопропилэтиламин с получением прозрачного основного (рН 9) раствора. В систему в виде одной порции добавляли N-(трет-бутилоксикарбонилизолейцилокси)сукцинимид (328 мг, 1,0 ммоль), и полученную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре в атмосфере азота. Растворитель выпаривали в вакууме, и полученный остаток распределяли между этилацетатом и 0,3 н раствором бисульфата калия. Органический слой промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия, водой и рассолом, сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Полученный остаток очищали фильтрацией через тонкий слой силикагеля, проводя элюирование сначала смесью гексан/этилацетат (10:90) и затем этилацетатом. В результате концентрирования элюата, содержащего продукт, получали целевое соединение в виде бесцветной вспененной стеклообразной массы; 301 мг (92%).

Спектр ¹ H ЯМР (СDСl₃): 6,90(1Н, шир.с); 5,51(1Н, шир. с); 5,18(1H,d, J=9,6 Гц); 4,62(1Н,дд, J=2,6 и 7,0 Гц); 4,29(1Н,дд, J=8,4 и 9,2 Гц); 3,79-3,58 (2Н, м); 2,36(1Н,м); 2,09-1,57(5Н,м); 1,43(9Н,с); 1,17(1Н,м); 0,95(3Н,д, J=6,6 Гц); 0,90(3Н,т, J=7,3 Гц) ч/млн.

(b) (2S)-N-(трет-Бутилоксикарбонилизолейцил)пирролидин-2-карбонитрил.

К перемешиваемому раствору амида, полученного в разделе (а) (203 мг, 0,62 ммоля), в сухом пиридине (10 мл) и в атмосфере азота добавляли имидазол (84 мг, 1,24 ммоля). Полученную смесь охлаждали до -35°С, после чего прикапывали оксихлорид фосфора (0,25 мл, 2,48 ммоля). Полученную смесь перемешивали в течение 1 часа, при этом температуре давали повышаться до -20°С, после чего растворитель удаляли в вакууме. Остаток очищали методом хроматографии на силикагеле с получением целевого соединения в виде бесцветного масла; выход 180 мг (94%).

Спектр ¹H ЯМР (СDСl₃): 5,14 (1Н, д, J=9,2 Гц); 4,80 (1Н, дд, J=2,6 и 7,1 Гц); 4,22 (1Н, дд, J=7,9 и 9,1 Гц); 3,81 (1Н, м); 3,71 (1Н, м); 2,30-2,12 (4Н, м); 1,75 (1Н, м); 1,60 (1Н, м); 1,42 (9Н, с); 1,19 (1Н, м); 0,97 (3Н, д, J=6,9 Гц); 0,91 (3H, т, J=7,3 Гц) ч/млн.

Спектр ¹³С ЯМР (CDCl₃): 171,7; 155,6; 118,0; 79,6; 56,0; 46,5; 46,0; 37,8; 29,6; 28,1; 25,0; 24,2; 15,2; 10,9 ч/млн.

(с) Трифторацетат (2S)-N-(изолейцил)пирролидин-2-карбонитрила

Нитрил из раздела (b) растворяли в трифторуксусной кислоте, и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель выпаривали в вакууме, и остаток растворяли в воде. Полученный раствор лиофилизировали с получением целевого соединения в виде белого пушистого твердого вещества; выход 60 мг.

Масс-спектр FAB: вычислено m/е 209,3; найдено 210,2 (M+H)⁺

Спектр ¹H ЯМР (D ₂O): 4,3 (1Н, м); 3,64 (1H, д, J=5,6 Гц), 3,16 (2Н, м), 1,86-1,48 (5Н, м); 0,98 (1Н, м), 0,68 (1Н, м), 0,51 (3Н, д, J=6,9 Гц); 0,38 (3Н, т, J=7,3 Гц) ч/млн.

Спектр ¹³С ЯМР (D₂O): 169,7; 119,7; 57,3; 48,6; 48,1; 36,9; 30,2; 25,8; 24,5; 15,4; 11,5; ч/млн.

Пример 1В - Синтез (2S)-N-((2’S)-2’-амино-3’,3’-диметил-бутаноил)пирролидин-2-карбонитрила

Указанное вещество получали, следуя методике, описанной в примере 1А, в результате замены производного изолейцина на соответствующее производное трет-бутилглицина.

Спектр ¹H ЯМР (CD₃OD): 4,86-4,81 (1Н, м); 4,04 (1Н, с); 3,77-3,71 (2Н, м); 3,34 (2Н, с); 2,34-2,08 (4Н, м); 1,14(9Н, с) ч/млн.

Спектр ¹³ С ЯМР (СD₃ОD): 167,40, 117,99, 58,78, 46,53, 34,21, 29,54, 25,22, 25,03 ч/млн.

Пример 2. Животная модель человеческого бесплодия

Диабетические жирные крысы Zucker (ZDF) считаются подходящей моделью для демонстрации потенциальной применимости терапевтических агентов в области человеческой фертильности, особенно в том, что касается PCOS. Гормональный статус рассматриваемых животных изменяется по мере того, как они начинают страдать от ожирения, что аналогично человеческим заболеваниям, в которых предполагается взаимосвязь между ожирением и PCOS.

Животные

Самцов и самок, страдающих от ожирения диабетических крыс Zucker, а также фертильных тощих самок и самцов крыс помещали в индивидуальные клетки и кормили Purina 5008 (6,5% жира). Ожиревших крыс в возрасте 6,5 недель рандомизировали на три группы:

1. Контрольная группа - страдающие ожирением крысы ZDF (n=8), получавшие носитель.

2. Лечебная группа с ежедневным приемом лекарства, страдающие ожирением крысы ZDF (n=8), получавшие перорально один раз в день соединение примера 1В (10 мг/кг/день).

3. Лечебная группа с двукратным ежедневным приемом лекарства - страдающие ожирением крысы ZDF (n=8), получавшие перорально дважды в день соединение примера 1В (10 мг/кг/день).

Методы

К концу исследования собирали образцы крови и гипофиза тощих и страдающих от ожирения крыс. Методом радиоиммунологического анализа измеряли концентрации гипофизарного LH и тестостерона в плазме крови. Эстральную цикличность оценивали исследованием вагинального мазка.

2.1 - Гипофизарный LH

Гипофизы крыс, страдающих от ожирения, содержали большее количество LH, чем гипофизы худых крыс (8,1±0,6 мг/гипофиз против 6,3±0,6 мг/гипофиз, для ожиревших и худых крыс, соответственно; р<0,05). Применение соединения Примера 1В на крысах, страдающих ожирением, нормализует содержание гипофизарного LH до значения, характерного для тощих крыс (8,1±0,6 мг/гипофиз против 5,2±0,4 мг/гипофиз для контрольных и обработанных ожиревших крыс, соответственно, р<0,05).

2.2 - Тестостерон плазмы

Уровни содержания тестостерона в плазме самцов крыс с ожирением были ниже, чем у самцов худых крыс (1145+328 нг/мл против 2410+239 нг/мл, для крыс с ожирением и худых крыс, соответственно; р<0,05). Обработка крыс с ожирением соединением примера 1В нормализует уровни тестостерона в плазме до значений, наблюдаемых у худых крыс (2410±239 нг/мл против 2392±759 нг/мл, для худых крыс и крыс, страдающих ожирением, соответственно, NS).

2.3 - Цикличность

Самки крыс, страдающих ожирением, имели аномальную эстральную цикличность в сравнении с худыми крысами. Обработка соединением примера 1В нормализует эстральную цикличность у самок крыс, страдающих ожирением.

Представленные выше результаты показывают, что ингибиторы DP-IV являются полезными веществами для лечения бесплодия у объектов как мужского, так и женского полов, в особенности при симптомах PCOS.

Пример 3. Фармацевтическая рецептура

3А - 50 мг таблетка

Таблетки, содержащие эквивалент, соответствующий 50 мг соединения примера 1А, в качестве активного агента, готовили из следующих ингредиентов:

Соединение Примера 1А (в виде соли трифторуксусной кислоты) 154,5 г

Пшеничный крахмал 53,5 г

Гидроксипропилцеллюлоза 13,5 г

Карбоксиметилцеллюлоза кальция 11,0 г

Стеарат магния 2,0 г

Лактоза 165

Всего 400,0 г

Указанные материалы смешивали и затем прессовали с получением 2000 таблеток по 200 мг, каждая из которых содержала эквивалент, соответствующий 50 мг соединения примера 1А в виде свободного основания.

3В - 100 мг вагинальные свечи

Свечи, подходящие для вагинального применения и содержащие эквивалент, соответствующий 100 мг соединения Примера 1А в качестве активного агента, готовили из следующих ингредиентов:

Соединение Примера 1А (в виде соли трифторуксусной кислоты) 154,5 г

Пшеничный крахмал 210,0 г

Коллоидный оксид кремния 2,5 г

Povidone 30 49,0 г

Стеарат магния 23,0 г

Адипиновая кислота 57,0 г

Бикарбонат натрия 43,0 г

Лаурилсульфат натрия 5,0 г

Лактоза 456,0

Всего 1000,0 г

Перечисленные материалы смешивали друг с другом и затем прессовали с получением 1000 свечей массой в 1 г, каждая из которых содержала эквивалент, соответствующий 100 мг соединения Примера 1А в виде свободного основания.

Приведенные выше примеры лишь иллюстрируют изобретение, раскрытое в настоящем документе, и не носят ограничительного характера. Некоторые расширения, рассматриваемые специалистом в данной области как эквивалентные, охватываются сферой настоящего изобретения и формулы изобретения, которая дополнительно определяет сферу притязаний.

Один или более ингибиторов DP-IV могут использоваться в качестве единого компонента, обладающего активностью, касающейся указанных предназначений рассматриваемой композиции и способа настоящего изобретения.