способ получения видоспецифического антигена chlamydia trachomatis для иммуноферментного анализа

Формула изобретения

Способ получения видоспецифического антигена С. trachomatis для иммуноферментного анализа, включающий обработку хламидийных телец детергентом N-лаурил саркозином и детергентом додецилсульфатом натрия, отличающийся тем, что хламидийные тельца перед обработкой N-лаурил саркозином обрабатывают комплексоном аминокислоты и перед обработкой додецилсульфатом натрия проводят обработку простым эфиром моносахарида.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для серологической диагностики урогенитального хламидиоза, и касается способа получения видоспецифического антигена С. trachomatis для иммуноферментного анализа.

Известен способ получения родоспецифического антигена из С. trachomatis для иммуноферментного анализа (ИФА) путем обработки хламидийных телец детергентом Тритоном Х-100 и очисткой солюбилизата от детергента с помощью обработки его галогенуглеводородом с последующим центрифугированием [Фармакопейная статья предприятия ФГУП “Пермское НПО “Биомед” на препарат “Хламисен” - антиген хламидийный родоспецифический для иммуноферментного анализа, жидкий (ФСП 42-0028-1589-01, утвержденная Фармакопейным Государственным комитетом 17.08.01 г.)]. Однако при серологической диагностике урогенитального хламидиоза, этиологически обусловленного С. trachomatis, с помощью антигена, полученного указанным способом, неизбежно возникновение ложноположительных результатов, так как данный антиген является родоспецифическим и не способен дифференциально реагировать с видоспецифическими антителами к С. trachomatis.

Наиболее близким аналогом является способ получения видоспецифического антигена С. trachomatis при помощи последовательной обработки хламидийных телец детергентом N-лаурил саркозином (SRC) и детергентом додецилсульфатом натрия (SDS) [Caldwell H.D., Kromhaut J., Schachter J. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis// Infection and Immunity. - 1981. - V.44. - P.111-116]. Однако указанным методом удается получить антиген с низким уровнем видоспецифической активности, что не позволяет использовать указанный антиген для серологической диагностики урогенитального хламидиоза, индуцированного С. trachomatis, в иммуноферментном тесте.

Технический результат изобретения заключается в повышении видоспецифической активности антигена С. trachomatis для иммуноферментного анализа.

Сущность изобретения заключается в том, что хламидийные тельца перед обработкой SRC обрабатывают комплексоном аминокислоты и перед обработкой SDS проводят обработку простым эфиром моносахарида.

Введение дополнительных этапов обработки исходной бактериальной суспензии С. trachomatis комплексоном аминокислоты (этилендиамин-тетрауксусная кислота, или динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, или 1,2-диаминогексантетрауксусная кислота) и простым эфиром моносахарида (октил--Д-глюкопиранозида, или гептил--Д-глюкопиранозида, или гексил--Д-глюкопиранозида) приводит к повышению видоспецифической активности получаемого антигена, что позволяет использовать его в иммуноферментном анализе для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции, вызванной С. trachomatis.

Пример 1. Бактериальную взвесь телец С. trachomatis обрабатывали раствором комплексона аминокислоты - этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (1,5±0,1) мМ в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Нерастворимую в ЭДТА фракцию от растворимой отделяли с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С.

Полученную нерастворимую в ЭДТА фракцию обрабатывали раствором SRC (2±0,2)% в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Нерастворимую в SRC фракцию отделяли от растворимой с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С.

Нерастворимую в SRC фракцию обрабатывали раствором простого эфира моносахарида - октил--Д-глюкопиранозида (2±0,2)% в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Нерастворимую в растворе октил--Д-глюкопиранозида фракцию отделяли от растворимой с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С.

Нерастворимую в растворе октил--Д-глюкопиранозида фракцию обрабатывали раствором SDS (0,2±0,01)% в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Растворимую в SDS фракцию отделяли от нерастворимой с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С. Растворимая в SDS фракция (надосадочная жидкость) являлась конечным продуктом - видоспецифическим антигеном С. trachomatis для иммуноферментного анализа.

Пример 2. Бактериальную взвесь телец С. trachomatis обрабатывали раствором комплексона аминокислоты - динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (1,5±0,1) мМ в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Нерастворимую в растворе динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты фракцию от растворимой отделяли с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С.

Полученную нерастворимую в растворе динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты фракцию обрабатывали раствором SRC (2±0,2)% в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Нерастворимую в SRC фракцию отделяли от растворимой с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С.

Нерастворимую в SRC фракцию обрабатывали раствором простого эфира моносахарида - гексил--Д-глюкопиранозида (2±0,2)% в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Нерастворимую в растворе гексил--Д-глюкопиранозида фракцию отделяли от растворимой с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С.

Нерастворимую в растворе гексил--Д-глюкопиранозида фракцию обрабатывали раствором SDS (0,2±0,01)% в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Растворимую в SDS фракцию отделяли от нерастворимой с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С. Растворимая в SDS фракция (надосадочная жидкость) являлась конечным продуктом - видоспецифическим антигеном С. trachomatis для иммуноферментного анализа.

Пример 3. Бактериальную взвесь телец С. trachomatis обрабатывали раствором комплексона аминокислоты - 1,2-диаминогексантетрауксусной кислоты (1,5±0,1) мМ в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Нерастворимую в растворе 1,2 - диаминогексантетрауксусной кислоты фракцию от растворимой отделяли с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С.

Полученную нерастворимую в растворе 1,2-диаминогексантетрауксусной кислоты фракцию обрабатывали раствором SRC (2±0,2)% в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Нерастворимую в SRC фракцию отделяли от растворимой с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С.

Нерастворимую в SRC фракцию обрабатывали раствором простого эфира моносахарида - гептил--Д-глюкопиранозида (2±0,2)% в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Нерастворимую в растворе гептил--Д-глюкопиранозида фракцию отделяли от растворимой с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С.

Нерастворимую в растворе гептил--Д-глюкопиранозида фракцию обрабатывали раствором SDS (0,2±0,01)% в течение (1±0,1) ч при температуре (20±2)°С. Растворимую в SDS фракцию отделяли от нерастворимой с помощью центрифугирования при 4500 g в течение (1±0,1) ч при температуре (15±2)°С. Растворимая в SDS фракция (надосадочная жидкость) являлась конечным продуктом - видоспецифическим антигеном С. trachomatis для иммуноферментного анализа.

Видоспецифическую активность предлагаемого антигена оценивали в твердофазном варианте ИФА по общепринятой схеме.

Полученный антиген сорбировали в лунках полистироловых планшетов по 100 мкл, разведения антигена готовили на фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,1±0,2. Сорбцию антигена проводили в течение (18±1) ч при температуре 4°С.

Реакцию оценивали спектрофотометрически при длине волны 492 нм.

Для оценки видоспецифической активности полученного антигена применяли индекс видоспецифичности антигена (ИВ_А), который вычислялся по формуле

ИВ_А=ОД_tr /ОП_ps,

где

ИВ_A - индекс видоспецифичности антигена;

ОП_tr - оптическая плотность в ИФА контрольной сыворотки, содержащей иммуноглобулины к С. trachomatis;

OП_ps - оптическая плотность в ИФА контрольной сыворотки, содержащей иммуноглобулины к С. psittaci.

Специфичность контрольных сывороток определяли в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) с коммерческими тест-антигенами С. trachomatis и С. psittaci.

В качестве антигенов сравнения применяли родоспецифический хламидийный антиген (Хламисен®), полученный по ФСП 42-0028-1589-01 Пермского НПО "Биомед" и видоспецифический антиген, приготовленный по способу Caldwell H.D., а также антиген, полученный по предлагаемому способу.

Данные сравнительного изучения видоспецифической активности хламидийного антигена, полученного по предлагаемому способу, и антигенов сравнения представлены в таблице.

Таблица
Данные сопоставительного изучения видоспецифической активности предлагаемого хламидийного антигена и антигенов сравнения
Антигены, использованные в качестве сенситинов в иммуноферментном анализе	Число серий	Среднее значение ИВА
Родоспецифический (Хламисен®) (аналог)	7	1,6
Видоспецифический (прототип)	7	4,3
Видоспецифический (предлагаемый антиген)	7	16,5

Из представленных в таблице данных видно, что из всех сравниваемых антигенов Видоспецифический антиген С. trachomatis, полученный по предлагаемому способу, обладает более высоким уровнем видоспецифической активности (16,5), чем у родоспецифического антигена (1,6) и у видоспецифического антигена-аналога (4,3).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить из телец С. trachomatis Видоспецифический антиген для иммуноферментного анализа с высокой видоспецифической активностью.