культура генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека и способ их получения

Формула изобретения

1. Культура генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека, характеризующаяся тем, что она получена из гиалинового хряща эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности и содержит аггрекан- и коллаген II-экспрессирующие клетки не менее 80%.

2. Способ получения культуры генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека, характеризующийся тем, что хрящевую ткань эмбриона человека 1-2-го триместра беременности отмывают, механически измельчают, далее подвергают ферментативной дезагрегации путем одномоментного инкубирования в растворе коллагеназы II типа и проназы Е, затем полученную суспензию первичных диссоциированных хондропрогениторных клеток засевают с плотностью не менее 1×10 ⁶ кл/мл и культивируют в селективной культуральной среде, содержащей ростовые среды DMEM+F12, 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, ростовые добавки и факторы роста, и при достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование.

3. Способ по п.2, где для ферментативной дезагрегации клеток используют 0,01-0,1%-ный раствор коллагеназы II типа и 0,05-0,1%-ный раствор проназы Е.

4. Способ по п.2, где используют селективную культуральную среду с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки.

5. Способ по п.2, где используют селективную культуральную среду с добавлением ростовых факторов 5-20 нг/мл bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) и/или 0,1-10 нг/мл TGF ₁ (Transforming Growth Factor ₁).

6. Способ по п.2, где используют селективную культуральную среду с добавлением ростовых добавок 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты.

7. Способ по п.2, где упомянутые клетки культивируют на не покрытых носителями культуральных чашках Петри.

8. Способ по п.2, где осуществляют пассирование упомянутых клеток не более двух раз при достижении культуры конфлюэнтного состояния.

9. Способ по п.2, где упомянутые клетки культивируют в течение 18-25 дней при температуре 37°C в атмосфере 5% СО₂.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается недифференцированных клеток животных и человека и способов их получения.

Лечение дегенеративных заболеваний и травм опорно-двигательного аппарата до настоящего времени является сложнейшей задачей медицины. Это обусловлено широкой распространенностью данных заболеваний, большим процентом инвалидизации, снижением качества жизни больных, отсутствием эффективных методов лечения. Несмотря на углубление представлений о этиологии, патогенезе, процессах регенерации костной и хрящевой ткани, современные методы распространенные в восстановительной хирургии не всегда позволяют восполнить структуру и функцию поврежденных органов и тканей, что обусловлено дегенеративными процессами в рамках самого заболевания, массивностью травматического повреждения, несостоятельность систем репарации, вследствие системных заболеваний и возрастных особенностей больных (Mankin et al. 1982., Buckwalter et al. 1994.). Одной из точек приложения в лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата является стимуляция процессов репарации костной и хрящевой тканей.

В настоящие время широко используются различные биологические и синтетические материалы в виде имплантатов, в том числе с применением ауто- и алло-генных фибробластов, мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, других элементов костного мозга, хондроцитов и др., с целью направленной остео- и хондро-регенерации (Ashton et al. 1980., Aston et al. 1986., Brittberg et al. 1994.). Как показано рядом авторов, используемые биологические и синтетические материалы не вызывают достаточной стимуляции репаративных процессов для восстановления структуры и функции ткани (Coletty et al. 1972., Fumkawa et al. 1980.).

Ауто- и аллогенные фибробласты представляют из себя дифференцированные клетки с низкими потенциями к пролиферации, миграции, направленной дифференцировке и репарации.

Ауто- и аллогенный костный мозг, получаемый путем стернальной пункции или трипанобиопсии гребня подвздошной кости взрослого человека (Yoo et al. 1998.) характеризуется клеточной неоднородностью, низким содержание гематогенных стволовых клеток, которые также обладают ограниченными способностями к пролиферации, миграции и репарации. Кроме того, фибробласты, клеточные элементы костного мозга, полученные от взрослого человека, экспрессируют антигены гистосовместимости I и II классов. Применение ауто- и аллогенных фибробластов, костного мозга оказывают выраженное трофическое действие, активируя неповрежденные участки ткани, однако в организме реципиента не "развиваются" и в результате элиминируются, но могут отторгаться и вызывать местные воспалительные реакции с дальнейшим развитием не гиалиновой, а волокнисто-хрящевой или фиброзной ткани (Coletty et al. 1972, Fumkawa et al. 1980. Патент US Grande et al. 6214369, 04.10. 2001).

Ауто- или аллогенные хондроциты, являясь зрелыми дифференцированными клетками хрящевой ткани, обладают ограниченной пролиферативной активностью, что не позволяет получать эти клетки в достаточном количестве с сохранением фенотипа (Brittberg et al. 1994., Katsube et al. 1999. Патент US McPherson et al. 6150163, 11.21.2000).

Известные способы получения хондропрогениторных клеток человека из фетальной хрящевой ткани, полученной на разных сроках гестации, включают в себя последовательную механическую и ферментативную дезагрегацию исходной хрящевой ткани с использованием различных ферментных растворов и их комбинации (коллагеназа, проназа, гиалуронидаза, деоксирибонуклеаза и др) в различных концентрациях. В зависимости от способов дезагрегации можно получать различное количество клеток с необходимым фенотипом и различное количество жизнеспособных клеток от 50 до 80%. Для культивирования хондропрогениторных клеток используются как непокрытые носителями чашки Петри, культуральные флаконы, так и на различных неселективных подложках из коллагена, агарозы и др. (Brittberg et al. 1994, Fuchs et al. 2002). Перечисленные способы культивирования клеток в монослое не позволяют осуществлять более 2-3 пассажей без потери фенотипа хондропрогениторных клеток, которые дедифференцируются в фибробластоподобные клетки. Известны способы культивирования хондропрогениторных клеток в суспензии с использованием различных трехмерных носителей (альгинат, полигликолид, полилактат, ателоколлаген), что позволяет вести культуру более длительное время без потери фенотипа клеток (Kimura et al. 1984., Matsusaki et al. 1998).

Хондропрогениторные клетки, получаемые из фетальной хрящевой ткани путем последовательной дезагрегации и культивирования в селективных средах при трансплантации с высокой эффективностью пролиферируют, мигрируют, встраиваются в очаг повреждения, дифференцируются в хондроциты или остеоциты, в зависимости от микроокружения, синтезируют внеклеточный матрикс, стимулируют ангиогенез (патент RU 2160112, 12.10.2000).

Применения в качестве трансплантата культуры хондропрогениторных клеток позволяет повысить эффективность лечения и избежать нежелательных результатов.

Технической задачей настоящего изобретения является получение гомогенной культуры хондропрогенеторных клеток для трансплантации при травматических и дегенеративных заболеваниях хрящевой и костной ткани, для повышения эффективности их лечения.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Один из объектов - культура генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека. Культура получена из гиалинового хряща эмбрионов человека 1-2 триместра беременности и содержит аггрекан- и коллаген II-экспрессирующих клеток не менее 80% и не более 20% примесных клеток. Второй объект - способ получения хондропрогениторных клеток. Хрящевую ткань эмбрионов человека 1-2 триместра беременности отмывают, механически измельчают и подвергают ферментативной дезагрегации в течении 40-90 мин в растворе, содержащем 0,01-0,1%-ный раствор коллагеназы II типа, 0,05-0,1%-ный раствор проназы Е. Суспензию первичных диссоциированных хондропрогениторных клеток засевают с плотностью не менее 1×10 ⁶ кл/мл и культивируют в среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12, 10% эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением ростовых добавок и факторов роста.

Среду неоднократно меняют. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина для дезагрегации монослоя. Плотность посева 1×10⁶ кл./мл.

Клетки культивируют 18-25 дней при 37°С в атмосфере 5% СО ₂. Пассируют культуру не более двух раз.

Способ осуществляется следующим образом

Для приготовления биотрансплантата используется фетальный абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций женщин. Фетальный материал переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и гентамицина (80 мг/л). Дальнейшая работа производится в стерильных условиях ламинарного бокса. Выделенная с помощью хирургических инструментов хрящевая ткань тщательно отмывается от сгустков крови, максимально отделяются все мягкие ткани (кожа, фасции, мышцы, сухожилия, связки) и костная ткань. Полученную хрящевую ткань измельчают до кусочков не менее 1 мм³.

Затем подвергают ферментативной и механической дезагрегации -освобождение клеточных элементов от тканевого матрикса.

Способ дезагрегации заключается в использовании 0,1%-ного раствора коллагеназы II типа (Sigma), 0,05% раствора проназы Е (Sigma), в одномоментном инкубировании кусочков хрящевой ткани в течение 40-90 мин в двухкомпонентном (1:1) ферментном растворе, последующем измельчении путем многократного пипетирования до получения одноклеточной суспензии. Полученная суспензия трижды отмывается путем центрифугирования при 700 об/мин.

Способ культивирования

Суспензию первичных диссоциированных хрящевых клеток, полученных из фетальной хрящевой ткани, культивируют на непокрытых носителями культуральных чашках Петри в среде, содержащей ростовую среду DMEM+F12 (1:1, Gibco BRL), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HПП ПанЭко), 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит. НПП ПанЭко), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В с добавлением ростовых факторов 5-20 нг/мл bFGF (Sigma) и/или 0,1-10 нг/мл TGF ₁ (Sigma). Замену среды производят каждые 3 дня. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния следует пассирование с использованием 0,05%-ного раствора трипсина для дезагрегации монослоя той же культуральной среды, при плотности посева не менее 10×10⁵ кл./мл. Возможно проведение не более двух пассажей вследствие дедифференцировки и изменении фенотипа (снижение количества аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток) получаемых клеток.

Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного биоматериала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов: система последовательной ферментативной дезагрегации исходной ткани позволяет получать максимальное количество жизнеспособных клеток одинакового фенотипа с незначительной примесью гетеротопных клеток; режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют максимально наращивать количество аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток; режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получать гомогенную клеточную культуру с содержанием аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток не менее 80%; режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получать гомогенную клеточную культуру с содержанием не более 20% примесных клеток.

Предлагаемый способ дезагрегации и культивирования хондропрогениторных клеток позволяет получить максимальное количество гомогенных аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток, обладающих высокими потенциями к пролиферации, дифференцировке и синтезирующих внеклеточный хрящевой матрикс. Культура генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток, полученная указанным способом, может быть использована при дегенеративных заболеваниях и травмах опорно-двигательного аппарата.