способ осаждения золота, способ определения присутствия конкретного вещества на активных центрах на подложке, способ определения присутствия анализируемого вещества в образце и набор средств, используемый в способе (варианты)

Формула изобретения

1. Способ осаждения золота на одном или большем количестве активных центров на подложке, включающий в себя

a) связывание, осаждение или формирование центров зародышеобразования на указанном одном или большем количестве активных центров, содержащих по меньшей мере один первый функциональный элемент распознающей группы, состоящей из двух или более молекул или комплексов, которые связываются друг с другом, при этом второй функциональный элемент указанной распознающей группы включает в себя или формирует указанный один или большее количество активных центров и связан с по меньшей мере одним центром зародышеобразования, выбранным из группы, состоящей из металлической частицы, содержащего атомы металла кластера, металлсодержащего комплекса и молекул; и

b) приведение указанного одного или большего количества активных центров при соответствующих условиях в контакт с обрабатывающей композицией, содержащей растворимый золотонесущий агент в виде золотосодержащей молекулы или комплекса и реагент и являющейся стабильной при рН менее 6 и кинетически стабильной, так что металлическое золото, по существу, не осаждается до тех пор, пока не присутствует центр зародышеобразования, а в присутствии центра зародышеобразования на указанном одном или большем количестве активных центров атомы золота высвобождаются из указанного золотонесущего агента и осаждаются на указанный центр зародышеобразования с формированием отложений металлического золота на указанном одном или большем количестве активных центров.

2. Способ по п.1, в котором один функциональный элемент распознающей группы связывается с по меньшей мере одним центром зародышеобразования, который представляет собой один или несколько компонентов группы, состоящей из содержащих ионы металла кластеров и металлсодержащих комплексов и молекул.

3. Способ по п.1, в котором один функциональный элемент распознающей группы связывается с по меньшей мере одним центром зародышеобразования, который представляет собой один или несколько компонентов группы, состоящей из частиц золота, содержащих атомы золота кластеров и золотосодержащих комплексов и молекул.

4. Способ по п.1, в котором один функциональный элемент распознающей группы связывается с по меньшей мере одним центром зародышеобразования, который представляет собой один или несколько компонентов группы, состоящей из содержащих атомы золота кластеров и золотосодержащих комплексов и молекул.

5. Способ по п.1, в котором указанная распознающая группа представляет собой пару из группы, состоящей из антигена и антитела или производного антитела с антигенсвязывающим доменом; сахара и лектина; рецептора и лиганда; нуклеотидной последовательности и комплементарной нуклеотидной последовательности; нуклеотидной последовательности и связывающего ее белка или другого специфически связывающего агента; биотина и авидина или стрептавидина; целлюлозы или хитина и целлюлозосвязывающего домена.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором указанная обрабатывающая композиция представляет собой водный раствор.

7. Способ по п.6, в котором указанный золотонесущий агент представляет собой Au ^I(SCN)^-₂.

8. Способ по п.7, в котором указанный реагент представляет собой гидрохинон или нафтогидрохинон.

9. Способ определения присутствия конкретного вещества на активных центрах на подложке, включающий в себя

a) создание условий для формирования центров зародышеобразования на активных центрах, содержащих указанное вещество;

b) приведение указанной подложки в контакт с обрабатывающей композицией, содержащей растворимый золотонесущий агент в виде золотосодержащей молекулы или комплекса и реагент и являющейся стабильной при рН менее 6 и кинетически стабильной, так что при таком соприкосновении металлическое золото, по существу, не осаждается на подложку до тех пор, пока на ней не присутствует центр зародышеобразования, а в присутствии центра зародышеобразования на указанных активных центрах атомы золота высвобождаются из указанного золотонесущего агента и осаждаются на указанные центры зародышеобразования с формированием металлического золота на указанных активных центрах; и

c) детектирование отложений металлического золота на указанной подложке, при этом отложение золота на активном центре подложки указывает на присутствие указанного вещества на указанном активном центре.

10. Способ по п.9, в котором стадия а) включает в себя а1) обеспечение наличия формирующих центры зародышеобразования агентов, каждый из которых содержит по меньшей мере один остаток, имеющий специфическое сродство к связыванию с указанным веществом и связанный с по меньшей мере одним центром зародышеобразования, представляющим собой один или несколько компонентов из группы, состоящей из металлической частицы, содержащего атомы металла кластера и металлсодержащего комплекса; и а2) приведение указанной подложки в контакт с указанными агентами.

11. Способ по п.10, в котором указанный остаток включен в один функциональный элемент распознающей пары, состоящей из двух молекул или комплексов, которые специфически связываются друг с другом, при этом другой функциональный элемент составляет или включен в указанное вещество.

12. Способ по п.11, в котором указанная распознающая пара представляет собой пару из группы, состоящей из антигена и антитела или производного антитела с антигенсвязывающим доменом; сахара и лектина; рецептора и лиганда; нуклеотидной последовательности и комплементарной нуклеотидной последовательности; нуклеотидной последовательности и связывающего ее белка или другого специфически связывающего агента; биотина и авидина или стрептавидина; целлюлозы или хитина и целлюлозосвязывающего домена; при этом указанный остаток представляет собой один из функциональных элементов распознающей пары, а указанное вещество является другим функциональным элементом или включает его.

13. Способ по любому из пп.9-12, предназначенный для определения присутствия в образце одного или нескольких целевых олигонуклеотидов с конкретной целевой последовательностью и включающий в себя

a) обеспечение наличия подложки, несущей один или большее количество пробных олигонуклеотидов, каждый из которых имеет пробную последовательность, комплементарную к одной из указанных целевых последовательностей;

b) приведение указанной подложки в контакт с образцом и создание условий для формирования центров зародышеобразования, где целевой олигонуклеотид гибридизуется с пробными олигонуклеотидами;

c) приведение указанной подложки в контакт с обрабатывающей композицией, содержащей растворимый золотонесущий агент в виде золотосодержащей молекулы или комплекса и реагент и являющейся кинетически стабильной, так что при таком соприкосновении металлическое золото по существу не осаждается на подложку до тех пор, пока на ней не присутствует центр зародышеобразования, а в присутствии центра зародышеобразования на указанных активных центрах атомы золота высвобождаются из указанного золотонесущего агента и осаждаются на указанные центры зародышеобразования с формированием отложений металлического золота на указанных активных центрах; и

d) детектирование отложений металлического золота на указанной подложке, при этом отложение золота на активном центре подложки указывает на присутствие указанного вещества на указанном активном центре.

14. Способ по п.13, в котором стадия b) включает в себя b1) обработку указанного образца для связывания метки с олигонуклеотидами в образце; b2) приведение указанного образца в контакт с указанной подложкой и b3) приведение указанной подложки в контакт с содержащим центры зародышеобразования агентом, способным к специфическому связыванию с указанной меткой.

15. Способ по п.13, в котором стадия b) включает в себя b1) обработку указанного образца таким образом, чтобы связать центры зародышеобразования с присутствующими в нем олигонуклеотидами, и b2) приведение указанного образца в контакт с указанной подложкой.

16. Способ по любому из пп.9-15, в котором указанный центр зародышеобразования представляет собой частицу золота, содержащий атомы золота кластер или золотосодержащий комплекс или молекулы.

17. Способ по любому из пп.9-16, в котором указанная обрабатывающая композиция представляет собой водный раствор.

18. Способ по п.17, в котором указанный золотонесущий агент представляет собой Au^I(SCN)^-₂, а указанный реагент представляет собой хинон.

19. Способ по любому из пп.9-18, в котором указанная подложка представляет собой образец для просмотра в методе получения изображения или визуализации.

20. Способ по п.19, в котором методика детектирования основывается на свете.

21. Способ по п.19, в котором методика детектирования основывается на поглощении света, и/или прохождении света, и/или отражении света, и/или рассеивании света.

22. Способ по п.19, в котором указанное детектирование производят с помощью методик, выбранных из просвечивающей электронной микроскопии, сканирующей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии.

23. Способ по п.19, предназначенный для приготовления образца к просмотру под микроскопом и включающий в себя следующие стадии:

a) создание условий для формирования центров зародышеобразования на селективных активных центрах образца и

b) приведение указанного образца в контакт с обрабатывающей композицией, содержащей растворимый золотонесущий агент в виде золотосодержащей молекулы или комплекса и реагент и являющейся кинетически стабильной, так что золото практически не осаждается на образце до тех пор, пока на нем не присутствует центр зародышеобразования, а в его присутствии атомы золота высвобождаются из указанного золотонесущего агента и осаждаются на указанный образец на селективных активных центрах.

24. Способ по любому из пп.9-18, в котором указанная подложка содержит разделенные фракции образца.

25. Способ по п.23, предназначенный для идентификации положений конкретного продукта разделения на подложке и включающий в себя стадии

a) создания условий для формирования центров зародышеобразования на активных центрах указанной подложки, содержащих указанный конкретный продукт разделения;

b) приведения указанной подложки в контакт с обрабатывающей композицией, содержащей растворимый золотонесущий агент в виде золотосодержащей молекулы или комплекса и реагент и являющейся кинетически стабильной, так что золото, по существу, осаждается на подложку только там, где на ней присутствует центр зародышеобразования, и при таком контакте атомы золота высвобождаются из указанного золотонесущего агента и осаждаются на указанный центр зародышеобразования; и

c) детектирования присутствия золота на указанной подложке, причем такое золото обозначает присутствие конкретного продукта разделения на подложке на том активном центре, где детектируется золото.

26. Способ определения присутствия анализируемого вещества в образце, включающий в себя

a) обеспечение наличия подложки, несущей захватывающие агенты, которые связывают указанное анализируемое вещество;

b) приведение указанной подложки в контакт с указанным образцом, при этом анализируемое вещество связывается с указанными захватывающими агентами;

c) создание условий для формирования центров зародышеобразования на активных центрах подложки, содержащих указанное анализируемое вещество;

d) приведение указанной подложки в контакт с обрабатывающей композицией, содержащей растворимую золотосодержащую молекулу или комплекс и реагент и являющуюся стабильной при рН менее 6 и кинетически стабильной, так что золото осаждается на подложке, по существу, только на ее активных центрах, содержащих центры зародышеобразования; и

е) детектирование отложений металлического золота на указанной подложке, которые указывают на присутствие указанного анализируемого вещества в указанном образце.

27. Способ по п.26, в котором стадия с) включает в себя с1) обеспечение наличия формирующих центры зародышеобразования агентов, каждый из которых содержит по меньшей мере один остаток, имеющий специфическое сродство к связыванию с указанным анализируемым веществом и связанный с по меньшей мере одним центром зародышеобразования, представляющим собой один или несколько компонентов из группы, состоящей из металлической частицы, кластера из атомов металла и металлсодержащего комплекса, и с2) приведение указанной подложки в контакт с указанными агентами.

28. Способ по п.27, в котором указанное анализируемое вещество представляет собой один из функциональных элементов связывающейся пары, состоящей из антигена и антитела или производного антитела с антигенсвязывающим доменом; сахара и лектина; рецептора и лиганда; нуклеотидной последовательности и комплементарной нуклеотидной последовательности; нуклеотидной последовательности и связывающего ее белка или другого специфически связывающего агента; биотина и авидина или стрептавидина; целлюлозы или хитина и целлюлозосвязывающего домена, и при этом указанный по меньшей мере один остаток является другим функциональным элементом указанной связывающейся пары.

29. Способ по п.26, в котором стадия b) включает в себя b1) приведение указанного образца в контакт с центрами зародышеобразования, представляющими собой один или несколько компонентов из группы, состоящей из металлических частиц, кластера из атомов металла и металлсодержащих комплексов или молекул, и создание условий для связывания указанных центров зародышеобразования с анализируемым веществом, если оно присутствует в образце, с получением таким образом модифицированного образца, содержащего модифицированные анализируемые вещества, и b2) приведение указанной подложки в контакт с модифицированными анализируемыми веществами, связанными с указанными центрами зародышеобразования.

30. Способ по п.29, в котором указанное анализируемое вещество представляет собой один из функциональных элементов связывающейся пары, состоящей из антигена и антитела или производного антитела с антигенсвязывающим доменом; сахара и лектина; рецептора и лиганда; нуклеотидной последовательности и комплементарной нуклеотидной последовательности; нуклеотидной последовательности и связывающего ее белка или другого специфически связывающего агента; биотина и авидина или стрептавидина; целлюлозы или хитина и целлюлозосвязывающего домена, и при этом указанный захватывающий агент является другим функциональным элементом указанной связывающейся пары.

31. Способ по любому из пп.26-30, в котором указанные захватывающие агенты наносят на подложку между электродами, так что золото, осажденное на указанные центры зародышеобразования на стадии d), устанавливает электрический контакт между электродами; и осуществляют детектирование отложений золота на стадии е) путем измерения соотношения ток - потенциал между электродами.

32. Способ по любому из пп.26-31, в котором указанная(ый) по меньшей мере одна(ин) металлическая частица, кластер из атомов металла или металлсодержащий комплекс представляет собой частицу золота или кластер, содержащий атомы золота.

33. Способ по любому из пп.26-32, в котором указанная обрабатывающая композиция представляет собой водный раствор.

34. Способ по п.33, в котором указанный золотонесущий агент представляет собой Au ^I(SCN)^-₂.

35. Способ по п.33, в котором указанный реагент представляет собой гидрохинон.

36. Набор для использования в способе по любому из пп.1-35.

37. Набор по п.36, включающий в себя обрабатывающую композицию, содержащую растворимый золотонесущий агент в виде золотосодержащей молекулы или комплекса и реагент и являющуюся кинетически стабильной, так что при контакте с подложкой золото осаждается на подложке, по существу, только на активных центрах подложки, содержащих центры зародышеобразования.

38. Набор по п.36 или 37, дополнительно включающий в себя формирующие центры зародышеобразования агенты для формирования центров зародышеобразования на одном или большем количестве активных центров на подложке, причем каждый из указанных агентов содержит по меньшей мере один функциональный элемент распознающей группы, имеющий специфическое сродство к связыванию с веществом, присутствующим на указанном одном или большем количестве активных центров, и связанный с по меньшей мере одним остатком центра зародышеобразования, представляющим собой один или несколько компонентов из группы, состоящей из металлической частицы, кластера из атомов металла и металлсодержащего комплекса или молекулы.

39. Набор для использования в способе по любому из пп.26-35, предназначенный для определения анализируемого вещества в образце и включающий в себя (i) подложку, несущую захватывающие агенты, которые связывают указанное анализируемое вещество; (ii) агенты для формирования центров зародышеобразования на тех частях подложки, на которых иммобилизуется указанное анализируемое вещество; (iii) обрабатывающую композицию, содержащую растворимую золотосодержащую молекулу или комплекс и реагент и являющуюся кинетически стабильной, так что золото осаждается на подложке, по существу, только на ее активных центрах, содержащих центры зародышеобразования.

40. Набор по п.39, в котором агент для формирования центров зародышеобразования содержит центр зародышеобразования и вещества, необходимые для связывания указанного центра зародышеобразования с указанным анализируемым веществом.

41. Набор по п.39, дополнительно включающий в себя агенты для формирования центров зародышеобразования, каждый из которых содержит по меньшей мере один остаток, имеющий специфическое сродство к связыванию с указанным анализируемым веществом и связанный с по меньшей мере одним остатком центра зародышеобразования, представляющим собой один или несколько компонентов из группы, состоящей из металлической частицы, кластера из атомов металла и металлсодержащего комплекса.

42. Набор по любому из пп.39-41, в котором указанная подложка содержит два или большее количество электродов и указанные захватывающие агенты нанесены в зазорах между электродами.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Изобретение относится к химическому осаждению металлического золота на подложки.

Уровень техники

Существуют различные способы, в которых металлические вещества осаждаются на подложках. В таких различных способах осаждаемый металл получают в форме растворимого комплекса или молекулы, например, в водном растворе. При соответствующих условиях такой комплекс или молекула восстанавливается и осаждает металл на подложку.

Иногда, с целью гарантирования осаждения металла из раствора на подложку, является предпочтительным сначала создать центры зародышеобразования на этой подложке. Такие центры зародышеобразования могут быть, например, различными комплексами металлов, кластерами или малыми металлическими частицами, осажденными на поверхность или прикрепленными к поверхности.

Примерами способов, включающих в себя осаждение металлов, являются различные способы получения изображения или увеличения контраста скрытого изображения для фотографии, оптической микроскопии или электронной микроскопии. Другим примером лабораторных способов, в которых на подложку осаждаются комплексы металлов, является визуализация продуктов разделения, например белков или нуклеиновых кислот, в различных хроматографических или злектрофоретических способах.

Металл, чаще всего используемый в таких способах, представляет собой серебро. Однако типичным недостатком осаждения серебра является то, что осаждение не является полностью специфичным, и в определенной степени спонтанное осаждение серебра может происходить также без априорного осаждения центров зародышеобразования. Таким образом, когда осаждение серебра используется в способах улучшения качества изображения или улучшения контрастности, как правило, существует ограниченное отношение сигнал/шум.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение имеет, в качестве одной из своих целей, создание способа осаждения золота на специфичные активные центры на подложке. Другой целью настоящего изобретения является создание композиции и набора для использования в таком способе.

В соответствии с настоящим изобретением золото, изначально содержащееся в растворимом золотонесущем агенте, который представляет собой золотосодержащую молекулу, кластер или комплекс, осаждается на центрах зародышеобразования. Термин "центры зародышеобразования", как он используется здесь, относится к любой соли, комплексу, кластеру или частице, имеющей каталитические свойства преобразования золота из золотосодержащей молекулы или комплекса в металлическое золото. Частицы с металлической поверхностью представляют собой, например, коллоидные металлические частицы, различные комплексы металлов, содержащие атомы металлов, кластеры и тому подобное.

В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ осаждения золота на один или большее количество активных центров на подложке, включающий в себя:

(a) связывание, осаждение или образование центров зародышеобразования на указанном одном или большем количестве активных центров;

(b) приведение в контакт указанных одного или большего количества активных центров с обрабатывающей композицией, содержащей указанный золотонесущий агент и реагент и являющейся кинетически стабильной, так что металлическое золото по существу не осаждается на подложку до тех пор, пока на подложке не присутствует центр зародышеобразования, а в присутствии центра зародышеобразования на указанном одном или большем количестве активных центров атомы золота высвобождаются из указанного золотонесущего агента и осаждаются на указанный центр зародышеобразования с формированием отложений (осажденных слоев) металлического золота на указанном одном или большем количестве активных центров.

Понятно, что как только золото осаждается на подложку, оно служит в качестве центра зародышеобразования для дальнейшего осаждения золота. Путем соответствующего управления временем выдерживания, а также другими условиями, влияющими на осаждение золота (некоторые из них будут в общем виде описаны ниже), можно управлять количеством осажденного золота на активном центре осаждения. Более того, хотя изначально осаждение золота может происходить на отдельных активных центрах на подложке, путем предоставления возможности для роста отложений золота при дальнейшем осаждении отдельные активные центры могут объединяться с формированием одного большого отложения золота, соединяющего объединенные таким образом активные центры.

Термин "по существу не осаждается" используется для обозначения того, что золото либо не выделяется из раствора и атомы золота остаются в растворимой молекуле или комплексе, либо того, что осаждение металлического золота на подложку является пренебрежимо малым и, таким образом, ненаблюдаемым или лишь слабо наблюдаемым и измеряемым с получением высокого отношения сигнал/шум.

В соответствии с одним из возможных вариантов выполнения способа центры зародышеобразования формируют путем химического или физического осаждения агента, формирующего центры зародышеобразования, на одном или большем количестве активных центров. В соответствии с другим вариантом выполнения такие центры зародышеобразования могут быть сформированы химически на указанном одном или большем количестве активных центров путем окислительно-восстановительной реакции, в которой ионы металла, в частности ионы серебра, окисляются до металлического серебра. Такое химическое формирование центров зародышеобразования само по себе является известным (см., например, WO 99/04402 и PCT/IL 99/00232).

В соответствии с еще одним вариантом выполнения центры зародышеобразования формируются путем связывания формирующих центры зародышеобразования агентов на указанном одном или большем количестве активных центров. Такие агенты содержат по меньшей мере один связывающийся остаток с афинностью или, иначе говоря, сродством к связыванию (которое может быть специфичным или не специфичным) с указанным одним или большим количеством активных центров, который связывается по меньшей мере с одним остатком центра зародышеобразования. Остаток центра зародышеобразования представляет собой частицу, которая может действовать в качестве каталитического агента для осаждения металлического золота, например соль, металлическую частицу, кластер из атомов металла или содержащий металл комплекс. Связывающийся остаток может быть, например, одним функциональным элементом распознающей группы, в то время как другой функциональный элемент распознающей группы образует или включен в указанный один или большее количество активных центров. Распознающая группа, как правило распознающая пара, состоит из двух или более веществ со сродством к связыванию друг с другом. Распознающая группа может представлять собой, хотя и не ограничиваясь этим, любую из следующих пар: антиген и антитело или производное антитела с комплементарным антигенсвязывающим участком (доменом); сахар и лектин; рецептор и лиганд; нуклеотидная последовательность и комплементарная нуклеотидная последовательность; нуклеотидная последовательность и связывающий ее белок или синтетический связывающий агент; биотин и авидин или стрептавидин; целлюлоза или хитин и целлюлозосвязывающий домен.

Остаток центра зародышеобразования предпочтительно представляет собой частицу золота или кластер, содержащий атомы золота, например, Аu₁₁, или Au ₅₅, или Au₁₄₇ (кластеры золота, которые содержат соответственно 11, 55 или 147 атомов золота). Обрабатывающая композиция обычно представляет собой водный раствор. Указанный золотонесущий агент предпочтительно представляет собой комплекс золота, такой как Au^I(SCN)^-₂ , как правило в форме соли щелочного металла (например, Nа ⁺ или К⁺) или аммония.

Реагент в обрабатывающей композиции может быть восстанавливающим агентом. Если указанным золотонесущим агентом является Au^I(SCN)^- ₂, реагентом предпочтительно является хинон, например гидрохинон (HQ) или нафтогидрохинон (NHQ). Однако также может быть использован любой другой восстанавливающий агент, который может восстановить золотосодержащую молекулу или комплекс с получением металлического золота, но из-за кинетических ограничений (например, из-за большой энергии активации и малого предэкспоненциального множителя) будет делать это с пренебрежимо малой скоростью в отсутствие центра зародышеобразования и вместе с тем с разумной скоростью (а именно со скоростью, которая приводит к получению заметных результатов через не слишком длинный период времени) в присутствии центра зародышеобразования.

Обрабатывающая композиция, содержащая Au^I(SCN)^-₂ и HQ, является стабильной в кислотной среде, что означает, что золото остается в виде растворимых частиц в растворе и не осаждается в виде твердого металла и не осаждается на твердые подложки, отличные от центров зародышеобразования. Когда значение рН такой обрабатывающей композиции является более низким, чем приблизительно 6, обрабатывающая композиция является особенно стабильной. При контакте с центром зародышеобразования металлическое золото осаждается на активные центры подложки, содержащие центры зародышеобразования.

Скоростью осаждения металлического золота можно управлять, например, путем управления значением рН обрабатывающей композиции: увеличение рН будет увеличивать скорость осаждения золота, а уменьшение рН будет уменьшать скорость осаждения. Кроме того, скоростью осаждения можно также управлять с помощью различных других средств, например: путем управления параметрами потока обрабатывающей композиции (быстрый поток предотвращает отравление побочными продуктами, такими как СN^-, которое может понизить скорость осаждения золота); путем добавления поверхностно-активных веществ, которые могут либо увеличивать, либо уменьшать скорость осаждения (так, например, полиамины, поликислоты или полиспирты и другие поверхностно-активные вещества могут оказывать эффект изменения скорости осаждения золота). Кроме того, путем использования различных добавок, например, тех, которые отмечены выше, можно изменять степень шероховатости поверхности осажденного золота (такое изменение может приводить к изменению цвета и электрических свойств осажденного золота).

Способ согласно изобретению может быть использован для определения присутствия или концентрации конкретного вещества на активных центрах на подложке. Такой способ включает в себя следующие стадии:

(a) создание условий, делающих возможным формирование центров зародышеобразования на активных центрах, содержащих указанное вещество;

(b) приведение указанной подложки в контакт с обрабатывающей композицией, содержащей указанный золотонесущий агент и реагент и являющейся кинетически стабильной, так что при таком соприкосновении металлическое золото по существу не осаждается на подложку до тех пор, пока на ней не присутствует центр зародышеобразования, а в присутствии центра зародышеобразования на указанных активных центрах атомы золота высвобождаются из указанного золотонесущего агента и осаждаются на указанные центры зародышеобразования с формированием металлического золота на указанных активных центрах; и

(c) детектирование отложений золота на указанной подложке, причем отложение золота на активном центре подложки указывает на присутствие указанного вещества на указанном активном центре.

Настоящий способ определения может быть применим, например, во множестве методик определения, например, в методиках, включающих в себя визуализацию образцов в микроскопии (которая может быть оптической или электронной микроскопией) или любой SPM методике, или при идентификации конкретных продуктов разделения на подложке (например, продукта разделения при электрофорезе или хроматографии, содержащегося в геле или на твердой подложке, такой как ДНК-чип). В любом из таких определений центры зародышеобразования могут быть сформированы путем использования указанных формирующих центры зародышеобразования агентов, в которых остаток со специфическим сродством к связыванию представляет собой один функциональный элемент распознающей группы, который может быть любым из тех, которые рассмотрены выше, а определяемый агент представляет собой другой функциональный элемент этой распознающей группы.

В соответствии с другим вариантом выполнения способ осаждения золота согласно изобретению используется при определении, направленном на детектирование присутствия анализируемого вещества в образце. В частности, настоящее изобретение может применяться в таком способе, в котором используется удерживаемый на подложке захватывающий агент для детектирования присутствия в образце анализируемого вещества, которое специфически связывается с этим захватывающим агентом. Такой захватывающий агент может представлять собой функциональный элемент распознающей группы, в то время как анализируемое вещество представляет собой другой функциональный элемент этой распознающей группы. Конкретным примером является случай определения присутствия целевого олигонуклеотида в образце, при этом захватывающий агент является олигонуклеотидом с последовательностью, комплементарной к нему. Формирующий центр зародышеобразования остаток может связываться с анализируемыми веществами, присутствующими в образце, например с олигонуклеотидами в образце, а затем обеспечивать возможность для взаимодействия образца с подложкой и для осуществления описанной выше реакции осаждения золота, при этом формирование отложений золота будет указывать на присутствие анализируемого вещества в образце.

Способ подготовки образца для получения изображения под микроскопом согласно настоящему изобретению включает в себя следующие стадии:

(a) создание условий, делающих возможным формирование центров зародышеобразования на селективных активных центрах образца; и

(b) приведение указанного образца в контакт с обрабатывающей композицией, содержащей указанный золотонесущий агент и реагент и являющейся кинетически стабильной, так что золото по существу не осаждается на образце до тех пор, пока на нем не присутствует центр зародышеобразования, а при его присутствии атомы золота высвобождаются из указанного золотонесущего агента и осаждаются на указанный образец на указанных селективных активных центрах.

Способ детектирования присутствия анализируемого вещества в образце согласно настоящему изобретению включает в себя следующие стадии:

(a) обработка образца для связывания формирующих центры зародышеобразования остатков с анализируемым веществом, если оно присутствует в образце;

(b) взаимодействие образца с подложкой, удерживающей захватывающие агенты, которые специфически связываются с указанным анализируемым веществом, и удаление несвязанных частей образца;

(c) приведение указанной подложки в контакт с обрабатывающей композицией, содержащей указанный золотонесущий агент и реагент и являющейся кинетически стабильной, так что при таком соприкосновении металлическое золото по существу не осаждается на подложку до тех пор, пока на ней не присутствует центр зародышеобразования, а в присутствии центра зародышеобразования на указанных активных центрах атомы золота высвобождаются из указанного золотонесущего агента и осаждаются на указанные центры зародышеобразования с формированием металлического золота на указанных активных центрах; и

(d) детектирование отложений золота на указанной подложке, при этом отложение золота указывает на присутствие анализируемого вещества в образце.

Конкретное применение настоящий способ находит в олигонуклеотидных чипах. Олигонуклеотидные чипы имеют различные захватывающие олигонуклеотиды, осажденные на различных активных центрах на чипе. Применение указанного выше способа может сделать возможным одновременное определение большого количества различных олигонуклеотидов в образце.

В приготовленном таким образом образце указанные селективные активные центры содержат отложения золота, которые делают возможной их визуализацию. Указанные селективные активные центры, как правило, могут быть активными центрами, содержащими конкретное вещество, и затем на указанных активных центрах с помощью формирующих центры зародышеобразования агентов с остатком, имеющим специфическое сродство к связыванию с указанным конкретным веществом, формируются центры зародышеобразования. Таким способом, например, могут четко быть визуализированы конкретные клетки, органеллы, богатые конкретным веществом области и тому подобное.

Способ идентификации положений конкретного продукта разделения на подложке согласно настоящему изобретению содержит следующие стадии:

(a) создание условий, делающих возможным формирование центров зародышеобразования на активных центрах указанной подложки, содержащих указанный конкретный продукт разделения;

(b) приведение указанной подложки в контакт с обрабатывающей композицией, содержащей указанный золотонесущий агент и реагент и являющейся кинетически стабильной, так что золото осаждается на подложку по существу только там, где на ней присутствует центр зародышеобразования, и при таком контакте атомы золота высвобождаются из указанного золотонесущего агента и осаждаются на указанные центры зародышеобразования с формированием металлического золота; и

(c) детектирование присутствия золота на указанной подложке, при этом такое золото обозначает присутствие указанного конкретного продукта разделения на подложке на том месте, где детектируется золото.

В методике разделения, где образец разделяется на различные фракции на основе различных скоростей движения различных веществ через некоторую среду (как правило, гель или твердое вещество) при приложенных условиях, например при электрофорезе, тонкослойной хроматографии (ТСХ) и тому подобном, формирующие центры зародышеобразования агенты могут быть подмешаны в образец перед разделением. Обычно это является предпочтительным. При этом такое предварительное добавление формирующего центры зародышеобразования агента может быть более экономичным, поскольку может требоваться меньше материала. Кроме того, когда такие агенты наносятся на подложку после разделения, они должны диффундировать через среду для достижения расположенного в этой среде разделенного вещества. Такая диффузия может быть ограничивающим фактором при правильном проявлении (контрастировании) золотом разделенных фракций. Однако иногда, как легко заметить, также является возможным добавление указанного формирующего центры зародышеобразования агента и после разделения.

Настоящее изобретение также предусматривает способ определения присутствия анализируемого вещества в образце. Такой способ включает в себя следующие стадии:

(а) обеспечение наличия подложки, несущей захватывающие агенты, которые связывают указанное анализируемое вещество;

(b) приведение указанной подложки в контакт с указанным образцом, при этом указанное анализируемое вещество связывается с указанными захватывающими агентами;

(c) создание условий, делающих возможным формирование центров зародышеобразования на активных центрах указанной подложки, содержащих указанное анализируемое вещество;

(d) приведение указанной подложки в контакт с обрабатывающей композицией, содержащей указанный золотонесущий агент и реагент и являющейся кинетически стабильной, так что золото осаждается на подложку по существу только на ее активных центрах, содержащих центры зародышеобразования; и

(е) детектирование отложений металлического золота на указанной подложке, которые указывают на присутствие указанного анализируемого вещества в указанном образце.

Детектирование на стадии (е) способа определения присутствия анализируемого вещества в образце может быть осуществлено путем исследования внешнего вида осажденного на подложке золота (осажденное золото в зависимости от размера и степени шероховатости поверхности может иметь цвет, изменяющийся от желтого до оранжевого и красного).

В соответствии с одним из вариантов выполнения настоящего изобретения, детектирование на стадии (е) основывается на электрической проводимости осажденного золота. В этом варианте выполнения захватывающие агенты могут находиться на подложке между электродами или могут быть нанесены на один или большее количество электродов, так что золото, осажденное на центр зародышеобразования на стадии (d), устанавливает электрический контакт между электродами. Детектирование отложений золота на стадии (е) осуществляется, таким образом, путем определения существования электрического контакта между электродами, например, путем измерения соотношения ток-потенциал между электродами. Величина соотношения ток-потенциал может быть использована в качестве датчика для концентрации агента в образце. Альтернативно, определение числа соединений в большом массиве одинаковых пар электродов с идентичными захватывающими агентами, нанесенными между ними или на них, может также обеспечить количественную меру концентрации анализируемого вещества.

Определяемое анализируемое вещество может быть функциональным элементом любой из распознающих пар, рассмотренных выше, при этом другой функциональный элемент такой пары затем включается в виде остатка в захватывающий агент. Формирование центров зародышеобразования на стадии (с) может быть условием для агентов, имеющих связывающийся остаток со специфическим сродством к связыванию с анализируемым веществом, захватываемым на подложке захватывающим агентом, для связывания с формирующим зародыши остатком, который может быть металлической частицей, содержащим атомы металла кластером или металлсодержащим комплексом, либо любой другой частицей, имеющий каталитические свойства преобразования содержащих золото молекулярных частиц в металлическое золото. Например, если анализируемое вещество является одним функциональным элементом связывающейся пары, то связывающийся остаток может быть другим функциональным элементом (например, если анализируемое вещество является антигеном, то формирующий центр зародышеобразования агент может содержать антитело, которое может быть таким же самым или отличным от антитела, используемого в качестве захватывающего агента).

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает набор для использования в указанном выше способе. Такой набор, как правило, содержит обрабатывающую композицию. Кроме того, такой набор может также содержать реагент для формирования центров зародышеобразования на конкретных активных центрах подложки, например, имеющих специфически связывающийся остаток, являющийся функциональным элементом любой из указанных выше связывающихся пар. Кроме того, набор для использования в указанном выше способе определения может также содержать, в соответствии с некоторыми вариантами выполнения, систему реагентов для “маркировки” анализируемого вещества в образце с помощью формирующего центр зародышеобразования остатка. Далее, в соответствии с некоторыми вариантами выполнения настоящего изобретения, набор может включать в себя подложку, содержащую электроды с захватывающими агентами, расположенными между электродами и/или на них.

С целью более детального понимания сущности настоящего изобретения и его практических вариантов осуществления изобретение поясняется с помощью не ограничивающего примера с соответствующими ссылками на прилагаемые чертежи.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 представлены схемы реакций способа приготовления обрабатывающей композиции в соответствии с изобретением (схема (а) и схема (b)) и осаждения золота на центр зародышеобразования (схема (с)).

Фиг.2 представляет собой схематическое изображение определения анализируемого вещества в образце согласно одному из вариантов выполнения изобретения.

Фиг.3 представляет собой схематическое изображение определения вещества в соответствии с другим вариантом выполнения изобретения.

Фиг.4 представляет собой схематическое изображение определения в соответствии с еще одним вариантом выполнения изобретения.

Фиг.5 представляет собой схематическую иллюстрацию способа усиления конкретных полос на твердой или гелевой подложке, разделенных с помощью хроматографии или электрофореза.

Фиг.6 представляет собой схематическую иллюстрацию способа получения изображения (визуализации) отдельных частей микроскопического образца в соответствии с вариантом выполнения изобретения.

Фиг.7 демонстрирует применение системы при детектировании анализируемых веществ в образце, в этом конкретном примере представляющих собой олигонуклеотиды с конкретной последовательностью.

Подробное описание предпочтительных вариантов выполнения

Приготовление обрабатывающей композиции и общая схема осаждения золота

Обрабатывающая композиция в соответствии с предпочтительным вариантом выполнения изобретения включает в себя содержащий золото комплекс auⁱscn ^-. С целью получения такой обрабатывающей композиции на первой стадии приготавливают раствор, содержащий KAu^III Cl₄ и KSCN, как правило, путем смешивания двух исходных растворов, один из них содержит золотосодержащий комплекс, а другой - KSCN. Например, такой раствор может быть получен путем смешивания одинаковых объемов первого раствора, содержащего около 0,5 М KSCN, и второго раствора, содержащего около 0,05 М KAu ^IIICl₄. Такое смешивание приводит к образованию комплекса KAu^III(SCN)₄ (смотри схему (а) на фиг.1). Такой комплекс выпадает в осадок, но при этом спонтанно образует комплекс KAu^I(SCN)₂. Как правило, после выпадения KAu^III(SCN)₄ в осадок его промывают и повторно суспендируют в воде или буфере и дают возможность для осуществления отмеченной выше спонтанной реакции (иллюстрируется как “СПОНТАННО” на схеме (b) фиг.1).

Затем раствор KAu ^I(SCN)₂ смешивают с восстанавливающим агентом, например, с около 0,055 М гидрохинона (HQ). Восстановление золотосодержащего комплекса с помощью гидрохинона при этом является термодинамически выгодным, но из-за большой энергии активации и малого предэкспоненциального множителя кинетика этой реакции является очень медленной. При значениях рН менее около 6 спонтанное восстановление является практически нулевым. Таким образом, раствор является стабильным и металлическое золото спонтанно не осаждается.

Однако, как показано на схеме (с) фиг.1, при соприкосновении с центрами зародышеобразования (ЦЗ), действующими как катализаторы, которые могут, например, быть коллоидными частицами золота, другими коллоидными металлами, кластерами из атомов металла, металлсодержащими комплексами, ионами металлов и тому подобным, на поверхность центра зародышеобразования осаждается металлическое золото (Au⁰), что связано с образованием бензохинона (BQ).

Уровень рН управляет скоростью осаждения золота: подкисление раствора, т.е. понижение рН, замедляет осаждение металла, в то время как добавление основания, т.е. повышение рН, ускоряет скорость осаждения металла.

Необходимо заметить, что при щелочных значениях рН некоторое спонтанное осаждение золота может иметь место даже без центров зародышеобразования.

Различные добавки, которые могут быть либо добавлены к обрабатывающему раствору изначально, либо добавляются во время процесса осаждения, могут влиять на скорость процесса осаждения золота и на структуру отложений золота (размер отложений, степень шероховатости поверхности, цвет и тому подобное). Например, добавление галогенидных ионов в обрабатывающую композицию приводит к отравлению поверхности растущих центров металла. Это будет ограничивать скорость, а возможно и прекращать процесс осаждения золота. Поэтому использование таких добавок делает возможным управление кристалличностью и размером зерен осажденного золота, скоростью осаждения золота, степенью шероховатости поверхности осажденного золота, электрическими свойствами и тому подобное. Очевидно, что процессом осаждения золота можно также управлять с помощью изменения множества других параметров, таких как температура, содержание кислорода, поток света, скорость перемешивания раствора и тому подобное.

Процесс осаждения золота по настоящему изобретению может использоваться для множества различных применений, некоторые примеры которых будут проиллюстрированы ниже.

Детектирование анализируемых веществ в образце

Определение в соответствии с одним из вариантов выполнения настоящего изобретения иллюстрируется на фиг.2. В этом варианте выполнения предусматривается устройство 20, имеющее непроводящую подложку 22, несущую электрически проводящие электроды 23. В зазоре между электродами на подложку 22 нанесены захватывающие агенты 24, которые имеют специфическое сродство к связыванию с анализируемым веществом 26, которое необходимо определить.

Образец S, который содержит анализируемое вещество 26, предварительно обрабатывается путем добавления центров 28 зародышеобразования и обработки таким образом, что центры зародышеобразования становятся связанными с анализируемым веществом посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия с получением модифицированного анализируемого вещества 30. В случае анализируемого вещества, которое является олигонуклеотидом, такое связывание может осуществляться, например, путем нагрева образца в присутствии цис-платина-биотина, а затем добавления соответствующим образом дериватизированного кластера, например кластера Au₅₅(Рb₃Р) ₁₂Сl₆-стрептавидина. Цис-платина-биотин связывается с олигонуклеотидами, затем Au₅₅(Рh₃Р) ₁₂Сl₆-стрептавидин связывается с остатками биотина на указанных нуклеотидах, таким образом связывая остатки зародышей с анализируемым веществом. В случае не являющегося нуклеотидом анализируемого вещества связывание может быть достигнуто, например, путем связывания амино-дериватизированного кластера или коллоида с карбоксильными остатками анализируемого вещества; путем связывания карбокси-дериватизированных кластеров или коллоидов с амино-остатками анализируемого вещества; путем связывания малеимидо-дериватезированного кластера или коллоида с тиольными остатками анализируемого вещества; и тому подобное. Как станет очевидным, в этом процессе могут также стать “мечеными” и другие вещества в образце с помощью центра зародышеобразования. Однако они не будут связываться с захватывающими агентами 24, и связанные с ними центры зародышеобразования не будут, таким образом, оставаться на подложке после обработки (смотри описание ниже).

При контакте с устройством 20 модифицированное анализируемое вещество 30 связывается с захватывающими агентами с получением формирующих центры зародышеобразования комплексов 32, которые иммобилизованы на подложке 22. Промывка подложки удаляет несвязанные вещества (NB, от англ. non bound).

Устройство 20 может затем быть приведено в контакт с обрабатывающим раствором 34, который содержит золотосодержащий комплекс, такой как КАu^I(SCN)₂, и восстанавливающий агент, такой как гидрохинон (HQ), а затем при контакте с центрами зародышеобразования 28 на них осаждается золото и образует непрерывную золотую массу 36, простирающуюся между электродами 23. Для предотвращения действия электродов 23 в качестве центров зародышеобразования они могут либо выполняться из проводящего материала, у которого отсутствуют каталитические свойства, например из кремния, пассивированного с помощью окиси кремния, пассивированного с помощью длинных алкильных цепей или пассивированного путем покрытия инертным материалом, либо, когда электроды выполнены из металла, они могут быть предварительно обработаны таким образом, чтобы сделать их инертными в качестве катализаторов осаждения золота, например, путем выдерживания с раствором, содержащим алкантиол с длинной цепью, такой как 1-октадецил-тиол.

Путем измерения соотношений между током и напряжением с использованием измерительного устройства 40 может быть определено существование электрического контакта между электродами 23, присутствие которого указывает на присутствие анализируемого вещества в определяемом образце.

Как в целом понятно специалисту в данной области техники, связывание захватывающих агентов с подложкой может быть достигнуто рядом способов. Например, оксидные поверхности могут быть дериватизированы с помощью кремнийсодержащего реагента, такого как (СН₃СН₂О)₃ Si-R-Х, где R может быть алкилом, арилом или другой разделительной группой, а Х может быть активным остатком для последующего связывания с остатком Y в захватывающем агенте. Природа Х и Y зависит от выбранной пары, и они могут быть выбраны из пар, состоящих из кислоты и амина, гидроксида и кислоты, реакций добавления цикла, радикальных реакций, нуклеофильных замещений, нековалентных взаимодействий и тому подобное, как хорошо известно и понятно специалисту в данной области техники. Если вещество выполнено из полимерного материала, то связывание может также быть достигнуто между захватывающим агентом и боковой группой полимерного материала с помощью любой из реакций указанного выше или другого типа.

Устройство 20 может содержать два или большее количество электродов, как правило - множество электродов, расположенных в виде массива. Термин “в виде массива” может подразумевать самые различные геометрии. Между различными парами электродов могут содержаться одинаковые захватывающие агенты, и/или различные захватывающие агенты могут быть осаждены между различными электродами. Устройство последнего рода может быть использовано для мультиплексного (параллельного и одновременного) анализа с целью одновременного определения множества анализируемых веществ. Кроме того, когда между различными парами электродов содержатся одинаковые захватывающие агенты, это может дать возможность для осуществления количественного анализа концентрации анализируемого вещества. Например, концентрация может оцениваться на основе числа электрических контактов, образованных между различными парами электродов: большое количество электрических контактов означает большую концентрацию, а малое количество соответствует малой концентрации.

Массив электродов может быть также частью более сложной электронной схемы (устройства), содержащей различные компоненты, например диоды, транзисторы, проводники, конденсаторы и тому подобное.

Другой вариант выполнения анализа в соответствии с настоящим изобретением можно увидеть на фиг.3. Главное отличие в случае варианте выполнения по фиг.3 от того, который показан на фиг.2, заключается в том, что вместо обработки образца S для связывания центров 28 зародышеобразования с анализируемым веществом 26 для получения модифицированного анализируемого вещества 30, в случае варианта по фиг.3 предусматривается формирующий центры зародышеобразования агент 150. Другие используемые в этом анализе компоненты являются очень похожими на компоненты, используемые в варианте по фиг.2, и поэтому на фиг.3 для обозначения подобных компонентов используются такие же самые цифровые обозначения по сравнению с фиг.2, но сдвинутые на одну сотню (а именно, с "1" в начале).

После контакта устройства 120 с образцом анализируемое вещество 126 связывается с захватывающим агентом 124, а затем, после отмывки свободных (не связанных (NB)) молекул анализируемого вещества и других веществ в образце, устройство приводится в контакт с формирующим центры зародышеобразования агентом 150, который содержит связанный с центром зародышеобразования 154 остаток 152 со специфическим сродством к связыванию с анализируемым веществом 126, которое теперь является связанным с захватывающими агентами 124. Таким образом, на подложке в зазоре между электродами 123 формируется иммобилизованный центр зародышеобразования 132. Затем после удаления несвязанных агентов 150 (NB) и добавления обрабатывающей композиции 134 формируется золотая масса 136, которая обеспечивает электрический контакт между электродами 123, который затем может быть определен подобно тому, как показано на фиг.2.

Еще один вариант выполнения анализа в соответствии с настоящим изобретением показан на фиг.4. Элементы, подобные элементам на фиг.2 и 3, обозначены на фиг.4 с помощью таких же цифровых обозначений, какие используются на фиг.2, но сдвинутых на одну сотню (а именно, с "2" в начале). Образец S, содержащий анализируемое вещество 226, взаимодействует с биотином 227 для получения обработанного образца S' с комплексами 231 анализируемое вещество-биотин. Затем они приводятся в контакт с подложкой 222, которая содержит захватывающие агенты 224, размещенные между электродами 223, для получения модифицированных захватывающих комплексов 233 на подложке 222.

Коллоидные частицы 240 золота взаимодействуют с авидином или стрептавидином 242 для получения формирующих центры зародышеобразования агентов 243. Затем приведение в контакт агента 243 с модифицированной подложкой 222 приводит к образованию иммобилизованных центров зародышеобразования 235.

Затем данный объект может быть приведен в контакт с обрабатывающим раствором 234 подобно тому, как показано на фиг.2 и 3, что приводит к осаждению золота с формированием сплошной золотой массы 236 между электродами 223.

Как несомненно будет ясно для специалиста в данной области техники, являются возможными различные модификации представленных выше вариантов выполнения.

Визуализация продуктов разделения

Способ согласно изобретению может быть использован для визуализации продуктов разделения, полученных в ряде таких методик разделения, как гель-электрофорез, гельпроникающие методики, эксклюзионная хроматография, афинная хроматография, и тому подобное. Это схематически иллюстрируется на фиг.5.

Подложка 200, которая может представлять собой гель или твердую подложку, содержащую различные дорожки 202, каждая из которых состоит из множества полосок 204, каждая из которых представляет собой отдельную фракцию образца, разделенного на каждой дорожке. Такая подложка 200 может быть получена с помощью любой из методик, отмеченных выше.

С целью визуализации существования конкретного вещества и локализации его полоски в контакт с подложкой 200 приводится формирующий центры зародышеобразования агент 206, имеющий остаток 208, который специфически связывается с указанным веществом в центре 210 зародышеобразования, и после успешного взаимодействия агенты 206 вымываются, а подложка приводится в контакт с обрабатывающим раствором 212, в результате чего на содержащих это вещество полосках будут формироваться отложения 214 золота (остальные полоски являются невидимыми и показаны на чертеже только для иллюстративных целей). Однако является предпочтительным, когда формирующие центры зародышеобразования агенты 206 могут быть добавлены к подложке перед началом процесса разделения, поскольку диффузия добавленных впоследствии агентов может быть ограничивающим фактором для достижения связывания этих агентов с разделенным веществом.

В зависимости от конкретных условий осаждения, которые среди прочего определяют степень шероховатости поверхностей осажденной золотой массы, цвет полосок может изменяться от желтого до черного. При использовании различных методик визуализации, основанных на измерении поглощения или прохождения света через эти полоски, может быть осуществлено количественное измерение разделенного вещества.

В качестве альтернативы оптическим методикам, отложения золота могут также детектироваться с помощью различных методик электрического детектирования. Это может быть достигнуто, например, путем создания двух планарных массивов электродов, между которыми находится разделяющая матрица, которая делает возможным автоматическое электрическое детектирование.

Усиление контраста в методиках визуализации

Существует множество методик визуализации, которые требуют контрастирующих агентов для того, чтобы увидеть определенные компоненты. Такими методиками являются оптическая микроскопия, электронная микроскопия (просвечивающая электронная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия), а также другие методики визуализации, например, атомно-силовая микроскопия (AFM). До настоящего времени такие методики визуализации использовали осаждение металлического серебра или осаждение углерода и некоторых других веществ.

В случае биологических образцов усилители контраста требуется для того, чтобы сделать возможным визуализацию конкретных тканей, клеток, органелл и т.п.

В соответствии с настоящим изобретением и согласно иллюстрируемому на фиг.6 биологический образец 300, содержащий клетку 302 с невидимой органеллой 304, обрабатывается в соответствии с настоящим изобретением путем последовательного контакта с формирующим центры зародышеобразования агентом 306, который имеет остаток 308, специфически связывающийся с содержащимся в органелле 304 веществом, и центр 310 зародышеобразования, и после обработки такого образца обрабатывающей композицией 312 органелла 304 становится видимой как черное или непрозрачное отложение 314.

Визуализация гибридизации олигонуклеотидов

Определение присутствия и концентрации олигонуклеотидов с конкретной последовательностью в последнее время осуществляется обычно с использованием проб олигонуклеотидов с комплементарной последовательностью, прикрепленных в известных местах к подложке. Конкретными и широко используемыми примерами таких систем являются так называемые ДНК-чипы. Такие чипы представляют собой поверхности, несущие множество пробных олигонуклеотидов с известными последовательностями в известных и дискретных положениях на указанной поверхности. Образец, который может содержать или не содержать целевые последовательности, комплементарные к пробным последовательностям на чипе, обрабатывается таким образом, что все фрагменты ДНК являются мечеными (обычно с помощью флуоресцентных меток). При контакте образца с поверхностью чипа при соответствующих условиях заданные олигонуклеотиды прикрепляются к поверхности в местах, несущих комплементарную последовательность. Детектирование продуктов гибридизации, как правило, производится путем отслеживания флуоресценции меченых дуплексов. Положение продукта гибридизации указывает последовательность образца, а интенсивность флуоресценции показывает их поверхностную концентрацию.

Обратимся теперь к фиг.7, представляющей применение способа осаждения золота согласно изобретению при визуализации продуктов гибридизации на ДНК-чипе с использованием различных возможных методик визуализации, таких как оптические методики (поглощение, отражение) и неоптические методики визуализации (AMF, STM и подобных им). Как несомненно будет понятно, это является только примером использования способа согласно изобретению для визуализации связывания исследуемых объектов с образцами в целом, например, связывания с-цепей ДНК с комплементарными цепями, связывания антитела с антигеном и других типов распознающих пар.

Подложка ДНК-чипа 400 содержит множество активных центров с пробами ДНК, причем на фигуре в качестве примера представлены три, т.е. 402, 404 и 406, каждый из них имеет различную последовательность нуклеотидов. Образец S, который может содержать целевые олигонуклеотиды 410, обрабатывается таким образом, что все частицы ДНК в растворе становятся мечеными с помощью метки 412, при этом получается модифицированный образец S', который может содержать модифицированное анализируемое вещество (если это анализируемое вещество присутствует в образце S). Приведение в контакт модифицированного образца S' с подложкой ДНК-чипа 400 при соответствующих условиях делает возможной селективную гибридизацию проб ДНК на чипе с целевыми олигонуклеотидами, если они присутствуют в модифицированном образце S'. После промывки чипа в систему вводятся формирующие центры зародышеобразования агенты 430 при условиях, делающих возможным их связывание с метками 412 на меченых олигонуклеотидах, если они присутствуют на различных активных центрах чипа. После промывки центры зародышеобразования присутствуют только в тех местах, где происходит гибридизация между пробами на чипе и целевыми частицами из раствора. Визуализация гибридизации достигается путем применения способа осаждения золота согласно изобретению, и таким образом из центров зародышеобразования на чипе выращиваются зерна золота, и эти зерна 440 золота детектируются с использованием различных методик, таких как оптические методики и SPM методики (AFM, STM и им подобные).

В другом варианте выполнения метка сама по себе служит в качестве центра зародышеобразования. В таком случае, стадия прикрепления центра зародышеобразования к метке пропускается.