способ определения микроколичеств белковых соединений в почечных камнях

Формула изобретения

Способ определения микроколичеств белковых соединений в почечных камнях, отличающийся тем, что в качестве биологического материала используют фосфатные и оксалатные почечные камни, которые после измельчения подвергают экстракционному концентрированию, в качестве экстрагента используют смесь состава хлороформ-этиловый спирт в объемном отношении 1:1, причем экстракционное концентрирование проводят при комнатной температуре путем трехкратной повторности в течение 3 суток, после испарения сухой остаток растворяют в дистиллированной воде, добавляют реактив Бенедикта и проводят спектрофотометрическое определение концентрации белка.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к экспериментальной медицине и минералогии, в частности к области исследования биоминеральных образований, и конкретно к способу определения содержания белковых соединений в почечных камнях.

Понять основные причины возникновения и развития почечнокаменной болезни невозможно без детального изучения почечных камней их состава, структуры, онтогенетических особенностей. Эти знания, возможно, позволят более эффективно разрабатывать методы профилактики, лечения и предотвращения рецидивов почечнокаменной болезни.

Особое место в исследовании органо-минеральных агрегатов занимает определение их органической составляющей. В последнее время некоторыми исследователями подчеркивается особая роль органического вещества в процессах образования, роста камней и формирования их структуры.

В литературе имеются публикации (Кораго А.А. Введение в биоминералогию. СПб., Недра, 1992, 280 с.; Тиктинский О.Л., Александров В.П. Мочекаменная болезнь. СПб., Медицина, 2000, 384 с.), согласно которым основными веществами, слагающими органическое вещество камня, являются белки, гликопротеины и мукополисахариды. При этом содержание белков достигает 70% от массы всей органики. Для подтверждения гипотезы о влиянии веществ белковой природы на процессы образования и роста камня необходимо проводить исследования, направленные на анализ именно этой составляющей конкрементов.

Следует отметить, что в современной литературе имеются лишь единичные работы, посвященные данной проблеме. Объясняется это скорее всего тем, что белковые соединения не удавалось обнаружить вследствие их малого количества и сложности определения на преобладающем фоне минеральной составляющей конкрементов.

Известен способ количественного определения аминокислот в биоминеральных образованиях (Каткова В.И., Юшкин Н.П. Механизмы, факторы и эволюция минералообразования. Отчет о научно-исследовательских работах по разделу: Роль органического вещества в генезисе биоминеральных образований за 1996-2000 гг.// Изд. Коми научного центра УроРАН, Сыктывкар, 2000, с.14.), заключающийся в том, что предварительно подготовку проб для анализа на аминокислоты осуществляли на приборе ААА-339М с проведением гидролиза в 6 н. НСl при 110 С в течение 24 ч.

Основным недостатком известного способа является то, что он недостаточно точно характеризует содержание различных форм белковых соединений, в частности водорастворимых, не обеспечивает необходимую селективность определения. Указанные недостатки связаны с тем, что на основании данных об аминокислотном составе объектов нельзя оценить качественные и количественные характеристики белкового вещества, слагающего образец.

Известен способ качественно-количественного определения содержания белка в биологических растворах (RU 2163019 С2, 7 G 01 N 33/48), включающий связывание белка с красящим реагентом с последующим учетом содержания белка по изменению окраски исследуемого раствора в сравнении со стандартным раствором белка, отличающийся тем, что исследуемый раствор и стандартный раствор белка раститровывают параллельно на микробиологическом планшете, а учет содержания белка осуществляют визуально в течение 4 ч.

Данный способ имеет следующие недостатки: определение белка является полуколичественным; невозможность его применения к почечным камням, поскольку данный способ определения белков применим лишь к растворам.

Известен также способ количественного определения алифатических аминокислот (RU 2167410 С2, 7 G 01 N 21/78) путем обработки анализируемой пробы цветореагентом при нагревании с последующим спектрофотометрированием полученного окрашенного раствора, отличающийся тем, что пробу обрабатывают 1%-ным спиртовым раствором нингидрида в среде фосфатного буфера раствора с рН-6,4-7,6, в присутствии 1 мг аскорбиновой кислоты, разбавляют полученный окрашенный раствор водой, а оптическую плотность измеряют при длине волны 568 нм.

Данный способ имеет ряд недостатков: во-первых, имеется возможность определения только алифатических аминокислот, во-вторых данный способ недостаточно точно характеризует содержание различных форм белковых соединений, в частности водорастворимых, не обеспечивает необходимую селективность. Указанные недостатки связаны с тем, что на основании данных об аминокислотном составе объектов нельзя оценить качественные и количественные характеристики белкового вещества, слагающего образец.

Известен способ для определения общей концентрации белка в растворах (WO 9621861 А1, МПК 6 G 01 N 33/483), который предусматривает нанесение раствора белка на белковую подложку, которая способна удерживать общий белок в виде пятна, имеющего размер, пропорциональный концентрации белка в растворе, при условии, что белок контактирует с белковой подложкой в присутствии детергента и по меньшей мере одной соли или кислого агента. Размер белкового пятна, образовавшегося на белковой подложке, определяют с помощью масштаба, и далее сравнивают его с эталоном.

Недостатком этого способа является невозможность его применения к почечным камням, поскольку данный способ определения белков применим лишь к растворам.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности является способ микроопределения белка с использованием биуретовой реакции (Мешкова Н.П. Практикум по биохимии. М., Изд. Московского университета, 1979, с.90-91), основанный на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с ионами двухвалентной меди в щелочной среде. Биуретовый реактив для микроопределения белка (реактив Бенедикта) представляет собой раствор, в 100 мл которого содержится 17.3 г цитрата натрия, 10 г Nа₂СО₃ и 1.73 г сульфата меди. При построении градуировочного графика анализируемые пробы готовят следующим образом: в мерные колбы на 10 мл добавляют последовательно 0.25; 0.5; 1.0; 1.5;..3.00 мл рабочего раствора белка, 1.0 мл 12% раствора NaOH, 0.2 мл раствора реактива Бенедикта и доводят до метки дистиллированной водой. Фоновый раствор готовят аналогичным образом, исключая введение белка. Оптическая плотность измеряется на спектрофотометре СФ-46 при =330 нм, толщина поглощающего слоя 1 см.

Преимуществом данного способа является:

- достаточная простота по своему применению, способ не требует больших затрат реагентов и дорогостоящего оборудования;

- хорошая воспроизводимость и точность определения.

Недостатком данного способа является невозможность применения к твердым нерастворимым в воде объектам, каковыми, в частности, являются почечные камни, имеющие в своем составе водорастворимые белковые соединения.

Задачей изобретения является разработка эффективного способа селективного определения водорастворимых белковых соединений в почечных камнях.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения микроколичеств белковых соединений в биоминеральных образованиях, основанном на использовании реактива Бенедикта и регистрации содержания белковых соединений спектрофотометрическим методом, в качестве биологического материала используют почечные камни, которые после измельчения подвергают экстракционному концентрированию, в качестве экстрагента используют смесь состава хлороформ-этиловый спирт, в объемном соотношении 1:1, причем экстракционное концентрирование проводят при комнатной температуре в течение 3 суток в трехкратной повторности, после испарения экстрагента сухой остаток растворяют в определенном объеме дистиллированной воды для получения оптимальной концентрации белка. Далее к анализируемой пробе добавляют 1.0 мл 12% раствора NaOH и 0.2 мл раствора Бенедикта. Фоновый раствор готовят аналогичным образом на основе испаренного растворителя без внесения пробы почечного камня. Оптическую плотность измеряют при =330 нм. В начале измеряют оптическую плотность стандартных растворов, а затем по градуировочному графику находят концентрацию белка.

Определение содержания микроколичеств белковых соединений биоминеральных образований, в частности, в почечных камнях осуществляют следующим образом.

Материалом для исследований служила коллекция фосфатных, не содержащих струвит и оксалатных камней (с содержанием основного компонента не менее 90% от массы камня) больных уролитиазом в Омском регионе, полученных как путем открытого оперативного вмешательства, так и с помощью дистанционной литотрипсии.

Белковые соединения в почечных камнях этого типа представлены, главным образом, водорастворимой формой и для оценки эффективности и точности предлагаемого способа селективного определения водорастворимых белковых соединений в почечных камнях данного типа можно использовать для сравнения данные, полученные методом Кельдаля (определение общего количества белка), и при совпадении результатов двух методов (в случае почечных камней, в которых белковое вещество представлено только в виде водорастворимой формы) сделать вывод об эффективном применении заявляемого способа селективного определения водорастворимых белковых соединений и для почечных камней, имеющих в своем составе не только водорастворимые, но и неводорастворимые белковые соединения.

Для идентификации белковых веществ и форм их локализации в конкрементах использовали один из методов качественного анализа (реагент - кислый раствор сулемы-бромфенолового синего). Поскольку белковое вещество в зависимости от конформации молекулы может быть представлено в двух формах, водорастворимой и водонерастворимой, то в качестве методики количественного определения суммарного содержания белков в почечных камнях нами был использован метод Кельдаля, а для установления доли водорастворимой составляющей, что является задачей изобретения, была разработана методика с использованием спектрофотометрического метода Бенедикта.

Определение общего содержания белкового вещества проводили методом Кельдаля на приборе Kjeltec Auto 1030 Analyzer. Долю водорастворимой формы белка устанавливали разработанным авторами способом на основе метода Бенедикта, при этом оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-46 ( =330 нм, 1=1 см).

При осуществлении способа использовали следующие реагенты:

1. Качественный анализ белковых соединений: 10% раствор сулемы, 0.1% раствор сулемы-бромфенолового синего, 0.5% уксусная кислота, буферный раствор с рН 6,5.

Водный раствор сулемы-бромфенолового синего готовят путем растворения в 100 мл воды 0.1 г красителя. Приготовление сулемового раствора состоит из двух этапов. Сначала готовят насыщенный раствор сулемы. Для этого к 100 мл дистиллированной воды необходимо добавить 10 г сулемы, нагреть до кипения, охладить и профильтровать. Затем к 100 мл фильтрата добавить 0.1 г красителя. Хранить во флаконе с притертой пробкой.

2. Количественное определение общего белка методом Кельдаля: H₂SO₄ с плотностью 1.83, катализатор (смесь 0.3 г CuSO₄ 5H₂O и 5 г К₂SO₄), 33% и 0.1 н раствор NaOH, 0.1 н H₂SO₄, индикатор метиловый оранжевый.

3. Количественное определение водорастворимой составляющей белка модифицированным методом Бенедикта: 12% раствор гидроксида натрия, биуретовый реактив, хлороформ, этиловый спирт, водный раствор альбумина (60 мг/мл).

Биуретовый реактив (реактив Бенедикта) готовят путем растворения 17.3 г цитрата натрия и 10 г Na₂CO₃ при нагревании в небольшом количестве воды, затем в полученный раствор добавляют 1.73 г сульфата меди, растворенного в 10 мл воды, и доводят до 100 мл.

Рабочий раствор альбумина с концентрацией 0.6 мг/мл готовят непосредственно перед экспериментом разбавлением стандартного раствора альбумина (60 мг/мл) в 100 раз.

Для качественного анализа белковых соединений образцы из коллекции почечных камней, полученных путем открытого оперативного вмешательства, распиливают через геометрический центр для получения срезов, затем проводят окрашивание срезов. Полученные срезы почечных камней помещают на 20 мин в сулемовый раствор БФС. После чего переносят на 15 мин в 0,5% уксусную кислоту, а затем в течение 20 мин промывают дистиллированной водой и выдерживают в буферном растворе до тех пор, пока со среза не перестанет отделяться краситель. Высушивают на фильтровальной бумаге. По характерному сине-зеленому окрашиванию определяют присутствие и форму локализации белковых соединений в исследуемом образце.

Для количественного определения общего белка методом Кельдаля образцы из коллекции фосфатных (не содержащих струвит) и оксалатных камней (с содержанием основного компонента не менее 90% от массы камня) размельчают до порошкообразного состояния. Навеску исследуемого порошкообразного почечного камня 0,2 г помещают в колбу для сжигания, добавляют 10 мл концентрированной Н₂SO₄, осторожно перемешивают и нагревают при температуре 400-450 С до полного просветления жидкости.

Полученный раствор помещают в Kjeltec Auto 1030 Analyzer, устанавливают коэффициент пересчета К=6,25 и снимают показания прибора.

Определение белка по этому методу основано на предположении, что содержание азота в большинстве белков практически одинаково и может быть принято равным 16%. При нагревании органического соединения с концентрированной серной кислотой происходит его минерализация, азот переходит в сульфат аммония и его можно определить количественно. Под действием концентрированного раствора щелочи происходит выделение аммиака, который поглощают определенным количеством серной кислоты, а затем его содержание определяют методом обратного титрования раствором щелочи.

Следует отметить, что поскольку содержание белка по данному методу определяется суммарным количеством азотсодержащих соединений в исследуемом образце, то в составе анализируемых конкрементов не должны содержаться вещества небелковой природы, при озолении которых возможно получение соединений аммония, поэтому материалом для анализа служила коллекция фосфатных (не содержащих струвит) и оксалатных почечных камней. Данный метод достаточно прост в использовании и легко автоматизируется, что позволяет применять его для массового анализа образцов с содержанием белка не менее 10^-3 г.

В ходе работы общее содержание белка в конкрементах нами определялось на приборе Kjeltec Auto 1030 Analyzer. При этом погрешность определения белка не превышает погрешности показаний этого прибора в рекомендованном для него диапазоне определяемых концентраций, что делает возможным использование этого метода в целях получения данных об общем количественном содержании белковых соединений в почечных камнях.

Для определения доли водорастворимой составляющей в белковой фракции почечных камней была разработана методика с использованием фотометрического определения белков по Бенедикту. В основе данного метода лежит реакция образования окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белков с ионами меди в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка в исследуемой пробе. Оптическую плотность растворов измеряли спектрофотометрически ( =330 нм, 1=1 см). К достоинствам данной методики можно отнести высокую чувствительность (предел обнаружения белка составляет 30 мкг/мл) и простоту исполнения. Однако применение этой методики для анализа белковых соединений почечных камней осложнено необходимостью их перевода в раствор, концентрация которого не должна быть меньше нижнего предела обнаружения данного метода. Для извлечения необходимых соединений из анализируемых образцов и снижения пределов обнаружения при их фотометрическом определении авторы использовали экстракционное концентрирование.

С целью выбора наиболее эффективной экстракционной системы для концентрирования водорастворимых белковых составляющих почечные камни авторами исследована экстракция этих соединений рядом органических растворителей и их смесей (хлороформ, этиловый спирт, хлороформ-этиловый спирт (1:1)), а также проведено изучение зависимости степени извлечения от кратности и времени однократной экстракции. Материалом для исследования служила коллекция фосфатных (не содержащих струвит) почечных камней, поскольку белковые соединения в почечных камнях этого типа представлены, главным образом, водорастворимой формой. Эффективность извлечения оценивалась величиной степени извлечения и рассчитывалась по результатам спектрофотометрического анализа водных растворов сухих остатков органической фазы после испарения экстрагента, при этом за суммарное количество белковых соединений в почечных камнях принималась величина определенная методом Кельдаля.

В ходе проведенных исследований изучалась экстракционная способность трех видов растворителей: хлороформ, этиловый спирт и смесь хлороформ-этиловый спирт (1:1). В три колбы с притертыми пробками последовательно вносилось по 0.05 г порошкообразного почечного камня и добавлялось 10 мл исследуемого экстрагента. Через определенные промежутки времени (1-3 суток) из колб испаряли растворитель и добавляли 3 мл дистиллированной воды, отфильтровывали полученный раствор, вносили 1.0 мл 12% раствора NaOH и 0.2 мл раствора Бенедикта. Фоновый раствор готовили аналогичным образом на основе испаренного растворителя без внесения пробы почечного камня. Оптическая плотность измерялась при =330 нм, толщине поглощающего слоя 1см.

Для определения оптимального времени и числа экстракций в колбы с притертыми пробками последовательно вносили по 0.05 г порошкообразного почечного камня и добавляли 10 мл экстрагента. Через определенные промежутки времени (от 1 до 4 суток) из колб испаряли растворитель, добавляли 3 мл дистиллированной воды и отфильтровывали полученный раствор. Осадок повторно заливали растворителем, а в фильтрат вносили 1.0 мл 12% раствора NaOH и 0.2 мл раствора Бенедикта. Фоновый раствор готовили аналогичным образом на основе испаренного растворителя без внесения пробы почечного камня. Оптическая плотность измерялась при =330 нм. Операцию повторяли несколько раз до достижения максимальной степени извлечения. Для определения водорастворимой белковой составляющей в почечных камнях в колбы с притертыми пробками последовательно вносили по 0.05 г порошкообразного почечного камня и добавляли 10 мл экстрагента. Через промежуток времени, определенный экспериментально, из колб испаряли растворитель, добавляли 3 мл дистиллированной воды, отфильтровывали полученный раствор. Осадок повторно заливали растворителем, а в фильтрат вносили 1.0 мл 12% раствора NaOH и 0.2 мл раствора Бенедикта. Фоновый раствор готовили аналогичным образом на основе испаренного растворителя без внесения пробы почечного камня. Оптическая плотность измерялась при =330 нм, 1=1 см. Операцию повторяли несколько раз до достижения максимальной степени извлечения.

Изучение влияния природы растворителя на величину степени извлечения белковых соединений почечных камней показало, что наиболее эффективным экстрагентом является смесь хлороформа и этилового спирта в объемном соотношении 1:1. Применение данного экстрагента позволяет повысить степень извлечения по сравнению с чистым этиловым спиртом в среднем на 18,8±2,9%, а с хлороформом на 30,8±4,9%.

Подбор оптимальных условий извлечения относительно кратности экстракций и времени однократного экстрагирования осуществлялся на основании полученных значений степени извлечения при определенных экспериментальных условиях (экстрагент хлороформ-этиловый спирт (1:1)). Исходя из полученных данных (табл. 1,2), можно сделать вывод, что оптимальная величина времени однократной экстракции составляет 3 суток, а для достижения степени извлечения 96,9±4,6% необходимо провести 3 последовательные экстракции.

В таблице 1 показаны значения степени извлечения белковых соединений почечных камней при однократной экстракции в условиях различного времени контакта фаз (Р=0,95).

В таблице 2 приведены данные о степени извлечения белковых соединений почечных камней при различном числе последовательных экстракций (время каждой экстракции 3 суток) (Р=0,95)

Полученные результаты свидетельствуют о возможности извлечения и экстракционного концентрирования белковых соединений из почечных камней предложенным методом. При этом максимальные значения степени извлечения достигаются при элюировании образцов раствором экстрагента, содержащего хлороформ и этиловый спирт в объемном соотношении 1:1, и проведении трехкратной экстракции (время контакта фаз в каждом случае составляет трое суток).

При проведении анализов спектрофотометрического определения концентрации водорастворимого белка методом Бенедикта использована обычная процедура градуировки прибора по стандартным растворам альбумина в выбранных условиях измерений.

Для построения градуировочной зависимости в мерные пробирки наливают последовательно 0.25-3.00 мл рабочего раствора белка, 1.0 мл 12% раствора NaOH, 0.2 мл раствора Бенедикта и доводят до метки дистиллированной водой. Фоновый раствор готовят аналогичным образом, исключая введение белка. Оптическая плотность измеряется на спектрофотометре СФ-46 при =330 нм, 1=1 см.

Построен градуировочный график для определения концентрации белка в виде комплекса с ионами меди, коэффициент корреляции 0,9998 (Р=0,95). Разработанная методика обеспечивает возможность определения водорастворимых белковых соединений в почечных камнях с использованием для анализа малых количеств образца (0.05г).

С помощью заявленного способа проанализирована коллекция почечных камней. При этом эффективность извлечения оценивалось величиной степени извлечения и рассчитывалось по результатам спектрофотометрического анализа водных растворов сухих остатков органической фазы после испарения экстрагента, за суммарное количество белковых соединений в почечных камнях принималась величина, определенная методом Кельдаля для камней фосфатного типа, где белковое вещество представлено только в водорастворимой форме.

Полученные результаты статистически обработаны. При этом расхождение между результатами по воспроизводимости (для Р=0,95) и по среднему значению (для Р=0,95) статистически незначимы. Относительное стандартное отклонение при определении водорастворимых белковых соединений составляет 0,03-0,04.

Результаты сравнительного определения содержания водорастворимых белковых соединений в почечных камнях фосфатного типа (при Р=0,95) спектрофотометрическим методом (с предварительной экстракцией) и методом Кельдаля приведены в таблице 3, где Х -среднее значение массовой доли белка в почечном камне; Sr - относительное стандартное отклонение; X - полуширина доверительного интервала.

Анализ результатов проведенных экспериментов показал, что разработанный способ имеет ряд существенных преимуществ по отношению к известным:

- достаточно прост по своему применению и не требует больших затрат реагентов и дорогостоящего оборудования;

- обеспечивает хорошую воспроизводимость и точность определения водорастворимых белковых соединений;

- дает возможность селективного определения водорастворимой формы белковых соединений в почечных камнях;

- поскольку водорастворимые белки в почечных камнях представлены, главным образом, глобулярными белками, являющимися основой антител и лейкоцитов, наличие которых в почечном камне указывает на протекание воспалительного процесса при генезисе конкремента, то их определение дает возможность судить о механизме образования камня и более эффективно разрабатывать методы профилактики, лечения и предотвращения рецидивов почечнокаменной болезни.