субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека

Формула изобретения

1. Субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека, содержащий концевые последовательности провирусной ДНК и меченный радиоактивной меткой, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют фрагмент провирусной ДНК ВИЧ-1, состоящий из двух параллельно ориентированных интактных LTR-последовательностей длиной 1200-1300 п.н.

2. Субстрат по п.1, отличающийся тем, что длинные концевые повторы (размер 600-650 п.н.) расположены на 5’ и 3’ концах провирусной ДНК.

3. Субстрат по п.1, отличающийся тем, что в качестве ДНК для встраивания используют избыток ДНК плазмиды.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к энзимологии, и может быть использовано в вирусологии для выявления потенциальных ингибиторов интегразы вируса иммунодефицита человека.

Вирус иммунодефицита человека, относящийся к семейству ретровирусов, вызывает хроническую инфекцию чувствительных клеток, используя при этом стратегию репликации, которая выделяет его среди других животных вирусов. После связывания вируса с клеткой-мишенью вирусный геном в виде одноцепочечной РНК высвобождается в цитоплазму хозяйской клетки. В ходе репликации в клетке вирусная РНК проходит стадию обратной транскрипции, которую осуществляет вирус специфичный фермент - обратная транскриптаза, с образованием двуцепочечной ДНК с длинными концевыми повторами (LTR) [1]. В процессе репродукции вируса иммунодефицита человека образуются по крайней мере три формы ДНК провируса: линейная копия вирусного генома, которая является субстратом для интеграции [2] и две кольцевые формы с одним или двумя LTR, функциональная роль которых до сих пор остается неясной [3]. Встраивание линейной формы ДНК провируса в геном клетки-хозяина осуществляется при помощи вирусного фермента - интегразы.

Вирусная интеграза (ИН) в несколько стадий осуществляет встраивание ДНК провируса в геном клетки-хозяина. На первой стадии удаляются два нуклеотида с 3’-концов LTR вновь синтезированной провирусной ДНК. Эта сайт-специфичная эндонуклеазная активность называется реакцией 3’-процессинга. Последующие стадии интеграции происходят после проникновения комплекса из цитоплазмы в ядро. Ядерный этап интегрирования включает образование одноцепочечных разрезов в хозяйской ДНК и лигирование с процессированными 3’-ОН LTR-концами - реакция встраивания.

До настоящего времени для определения активности интегразы ретровирусов in vitro используются различные радиоактивные двуцепочечные дуплексы длиной 20-26 нуклеотидов.

Известен радиоактивный дуплекс, используемый в способе определения активности интегразы [4].

Дуплекс получают синтезом комплементарных дезоксиолигонуклеотидов, конструированием из гибридизованных комплементарных олигонуклеотидов, мечением радиоактивными изотопами. Полученный радиоактивно меченный дуплекс инкубируют с препаратом очищенной интегразы и полученные продукты анализируют в полиакриламидном геле.

Известен флуоресцентно меченный дуплекс из метода измерения активности ретровирусной интегразы [5]. Измерение активности ретровирусной интегразы в реакции 3’-процессинга происходит по возрастанию интенсивности флуоресценции при отщеплении GT-динуклеотида.

К недостаткам данных субстратов можно отнести то, что при ингибиторном анализе результаты, полученные при помощи тест-системы оценки активности интегразы in vitro на основе олигонуклеотидных дуплексов, не коррелируют с результатами, полученными в культуре ВИЧ-инфицированных клеток [6]. Это ставит вопрос об адекватной интерпретации существующих на сегодняшний день данных о функциональной роли интегразы. Вследствие этого на сегодняшний день ведутся поиски тест-системы оценки активности интегразы, основанной на использовании протяженного ДНК-субстрата фланкированного LTR-фрагментами, которые узнаются интегразой вируса иммунодефицита человека.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является субстрат, полученный конструированием плазмиды, содержащей концевые последовательности провирусной ДНК, известный из способа определения активности интегразы ВИЧ [7, прототип]. Субстрат получают так: проводят амплификацию концов провирусной ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), в присутствии двух пар ВИЧ-специфических праймеров, клонируют в векторную плазмиду pBKRSV ("Stratagene", Канада), нарабатывают полученную плазмидную конструкцию, линеаризуют плазмиду при помощи рестриктазы, получают 5’-выступающий конец посредством нуклезы ExoIII и в дальнейшем достраивают Т7 ДНК-полимеразой с использованием радиоактивно меченных нуклеотидов. Полученный радиоактивно меченный субстрат используется для определения активности интегразы в реакции встраивания с последующим разделением продуктов реакции в полиакриламидном геле и радиоавтографированием. Для определения активности интегразы в реакции 3’-процессинга проводят рестрикцию полученной плазмидной конструкции для получения фрагмента 107 п.н. с последующим введением радиоактивной метки.

Основным недостатком данного субстрата является то, что он получается различный по длине и составу, что влияет на результаты определения активности интегразы в реакциях 3’-процессинга и встраивания. Применение данной системы для скриннинга ингибиторов интегразы для отбора потенциальных анти-ВИЧ препаратов затрудняется из-за многостадийности конструирования субстрата, использования дорогостоящих малодоступных ферментов, а также из-за дополнительной стадии наработки плазмиды в бактериальной системе Е.coli. Также из-за трудоемкости получения субстрата использование данного способа затрудняет конструирование субстратов, гомологичных различным штаммам вируса иммунодефицита человека, для исследования влияния природных нуклеотидных замен в субстрате на функциональную активность интегразы.

Технической задачей изобретения является конструирование субстрата, идентичного природному субстрату интегразы ВИЧ, позволяющего повысить быстроту проведения измерения активности интегразы in vitro и дающего возможность комплексного исследования функциональной активности интегразы в нескольких реакциях (3’-процессинга и встраивания) на одном субстрате.

Поставленная техническая задача изобретения решается выбором и синтезом олигонуклеотидных праймеров, таким образом, что амплифицируются только фрагменты ДНК, гомологичные кольцевым формам кДНК вируса иммунодефицита человека.

Субстрат для определения активности интегразы состоит из фрагмента 1200-1300 п.н. комплементарного интактным параллельно ориентированным длинным концевым повторам (LTR) ВИЧ. Субстрат является неинфекционной мини-копией вирусного генома, что позволяет изучать процесс интеграции в условиях, максимально приближенных к естественным.

Длинные концевые повторы (размер 600-650 п.н.) расположены на 5’ и 3’ концах провирусной ДНК, причем ориентация относительно друг друга параллельная. 5’ район LTR является промоторно-энхансерным районом вируса и состоит из множества функциональных элементов, осуществляющих базальную и регулируемую экспрессию вирусных генов. LTR ВИЧ делится на три области: U3, R и U5, которые содержат различные районы для связывания клеточных факторов транскрипции.

Первичная последовательность LTR играет важную роль в процессе интеграции. Оба 3’-ОН конца LTR играет важную роль в процессе интеграции. Оба 3’-ОН конца LTR несут консервативный СА-динуклеотид в позиции 3,4, с которым специфично связывается интеграза. После связывания с субстратом интеграза отщепляет два концевых динуклеотида GT с 3’-ОН конца. Полученный ДНК-продукт с гидролизованными 3’-ОН концами интеграза встраивает в геном хозяйской клетки. При использовании предлагаемого субстрата в качестве ДНК для встраивания используют избыток ДНК плазмиды.

Праймеры выбирают в консервативной области геномов различных штаммов вируса иммунодефицита человека так, что имеют 100% гомологию между различными штаммами вируса иммунодефицита человека, что позволяет амплифицировать субстрат для интегразы, гомологичный различным штаммам вируса, используя одни и те же праймеры. Первой парой праймеров амплифицируют последовательность, состоящую из двух параллельно ориентированных LTR-последовательностей, с 5’ конца части гена env и с 3’ конца части гена gag. Второй парой праймеров на внутреннюю область полученного фрагмента амплифицируется непосредственно субстрат для интегразы, содержащий на концах динуклеотид СА, в положениях 3, 4 3’-ОН конца, который специфически узнается интегразой. Далее полученный ДНК фрагмент радиоактивно метится с помощью фрагмента Кленова и используется для определения активности интегразы в реакциях 3’-процессинга и встраивания. О положительном результате реакции судили по появлению продукта, выявляемого электрофорезом в полиакриламидном геле.

Субстрат получают следующим образом.

На первом этапе выбираются и синтезируются две пары олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативной области наибольшего сходства геномов различных штаммов вируса иммунодефицита человека 1-го типа. Причем ориентированность праймеров должна быть таким образом, что амплифицируется только фрагмент, комплементарный кольцевым формам ДНК (фиг.1). Например: S1–5’-GGGGTGGGAGCAGCATCTCG-3’ (на конец гена env) и S2–5’-TCTTGCCGTGCGCGCTTCAG-3’ (на начало гена gag). Затем повторным амплифицированием парой гнездовых праймеров непосредственно на концы LTR: N1-5’-ACTGGAAGGGCTAATTCACTCC-3’ и N2-5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3’; получают ДНК продукт, который содержит сайт - СА-динуклеотид на 3’-ОН конце для специфического узнавания интегразы и состоит из двух параллельно ориентированных интактных LTR-последовательностей длинной 1200-1300 п.н. Полученный ДНК продукт метится посредством фрагмента Кленова и [-р³²]ТТР для определения активности интегразы в реакции 3’-процессинга и посредством фрагмента Кленова и набора [-p³²]dNTP для определения активности интегразы в реакции встраивания.

Существенное отличие заявляемого субстрата от известного прототипа:

в качестве субстрата используется протяженная 1200-1300 п.н. последовательность ДНК, гомологичная кДНК вируса иммунодефицита человека, состоящая только из длинных концевых повторов, что дает возможность исследовать функциональную активность интегразы in vitro с использованием неинфекционной копии мини-генома ВИЧ.

Следовательно, можно считать заявляемое техническое решение соответствующим критерию "изобретательный уровень".

ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

Фиг.1 Схематическое изображение конструирования LTR-содержащего ДНК субстрата.

Фиг.2 Зависимость накопления продукта в реакции 3’-процессинга, катализируемой интегразой, от времени: 1 - Контроль; 2-5 мин; 3-15 мин; 5-45 мин; 6-90 мин.

Фиг.3 Активность рекомбинантной интегразы ВИЧ в реакции встраивания с использованием ЛТР-содержащего ДНК субстрата. Радиоавтограф с 4%-ного полиакриламидного геля.

Сущность технического решения раскрыта в конкретных примерах осуществления способа.

Пример 1. Конструирование LTR-содержащего субстрата для определения активности интегразы на основе кольцевых форм ДНК вируса.

Операция 1. Выделение провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека из лимфоцитов периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов.

Забор периферической крови пациентов для предотвращения образования тромба проводят в пробирки, содержащие 0,5 М ЭДТА рН 8,0, конечная концентрация ЭДТА - 4 мМ. Выделение лимфоцитов проводят разделением крови пациента в градиенте фиколл-верографин. Готовят 60 мл 15% раствора фиколла на деионизированной воде и при перемешивании приливают к нему 20 мл 76% раствора верографина ("Spofa", Чехословакия). Из этого раствора под контролем ареометра готовят растворы плотностью 1,097 г/мл и 1,075 г/мл. Приготовленные растворы стерилизуют автоклавированием при 121С в течение 30 мин. На градиент, составленный из 5 мл раствора плотностью 1,097 г/мл и 5 мл раствора плотностью 1,075 г/мл, наслаивают 10 мл разведенной раствором Хенкса в соотношении 1:2 крови. Центрифугируют 40 мин при 400 g и температуре 22С. Отбирают легкую фракцию, которая содержит лимфоциты и моноциты, отмывают, центрифугируя (2-3 мин при 400 g) раствором Хенкса.

Клетки ресуспендируют в лизирующем буфере (10 мМ трис рН 8,3; 1 мМ ЭДТА; 0,5% твин 20; 0,5% NP-40) с добавлением протеиназы К (концентрация 8 мг/мл) и инкубируют в термостате при 56С в течение 3 часов. Затем проводят экстракцию фенолом и переосаждение ДНК этанолом.

Операция 2. Выделение суммарной клеточной ДНК из суспензии культуры клеток.

В работе используют высокочувствительную к вирусу иммунодефицита человека культуру клеток МТ-4, инфицированную штаммами ВИЧ-1/ГКВ4046, ВИЧ-1/Bru, с инфекционным титром 10⁴-10⁶ инфекционных единиц / мл и концентрацией 0,510⁶ клеток/мл.

Клетки, предварительно отмытые раствором Хенкса или DMEM(M), ресуспендируют в лизирующем буфере (10 мМ трис рН 8,3; 1 мМ ЭДТА; 0,5% твин 20; 0,5% NP-40) с добавлением протеиназы К (концентрация 8 мг/мл) и инкубируют в термостате при 56С в течение 3 ч. Затем проводят экстракцию фенолом и переосаждение ДНК этанолом.

Операция 3. Полимеразная цепная реакция.

ПЦР проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 6,7 мМ трис НСl (рН 8,8), 1,5 мМ MgCl₂, 0,01% твин-20, по 0,1 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 2 единицы Tag-полимеразы, по 2 мкМ праймера S1 и S2 и добавляют 5 мкл выделенной ДНК из инфекционного материала. Поверх реакционной смеси наслаивают 30 мкл вазелинового масла. ПЦР состоит из 30 циклов: 95С в течение 1 мин, 55С в течение 1,2 мин, 72С в течение 1,5 мин. В конце реакции проводят завершающий синтез при 72С в течении 5 мин. После завершения ПЦР отбирают водную фазу и смешивают ее с равным объемом раствора, содержащего фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:25:1). После центрифугирования при 14000 об/мин в течение 30 с, водную фазу отбирают и осаждают ДНК этиловым спиртом с ацетатом натрия. Осадок растворяют в 20 мкл воды. ПЦР проводят в тех же условиях гнездовыми праймерами N1 и N2, добавляя 5 мкл раствора, полученного в результате амплификации праймерами S1 и S2.

Операция 4. Получение радиоактивно меченного ДНК субстрата для измерения активности интегразы в реакции 3’-процессинга.

Фрагмент ДНК с тупыми концами метят с помощью фрагмента Кленова путем замещения dTTP нуклеотида на 3’-гидроксильном конце.

Реакцию замещения проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис НСl (рН 7,5), 5 мМ MgCl₂, 7,5 мМ DTT, 33 мкМ [³²р]ТТР (50 мкКи), 1,2 единицы Большого (Кленов) фрагмента ДНК-полимеразы I и 1-3 мкг ДНК субстрата, синтезированного в полимеразной цепной реакции. Смесь инкубируют в течение 1 часа при 37С. При завершении реакции добавляют 5 мкл раствора, содержащего 0,4 М ЭДТА, 60% глицерин, 0,1% бромфеноловый синий. Очистку радиоактивно меченного субстрата проводят препаративным электрофорезом в 4% полиакриламидном геле в нативных условиях с последующей радиоавтографией.

Операция 5. Получение радиоактивно меченного ДНК субстрата для измерения активности интегразы в реакции встраивания.

Фрагмент ДНК подвергают частичному гидролизу с 3’-ОН концов за счет 3’-5’ экзонуклеазной активности фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е.coli. Затем после добавления dNTP выступающие 5’-концы достраивают за счет 5’-3’ полимеразной активности фрагмента Кленова.

Реакционная смесь содержит 10 мМ трис НСl (рН 7,5), 5 мМ MgCl₂, 7,5 мМ DTT, 1,2 единицы Большого (Кленов) фрагмента ДНК-полимеразы I и 1-3 мкг ДНК субстрата, синтезированного в полимеразной цепной реакции. Смесь инкубируют 30 мин при 37С, затем добавляют по 33 мкМ dATP, dGTP, dCTP и [³²p]TTP (50 мкКи). Инкубируют смесь 60 мин при 37С. Очистку радиоактивно меченного субстрата проводят препаративным электрофорезом в 4% полиакриламидном геле в нативных условиях с последующей радиоавтографией.

Операция 6. Элюция радиоактивно меченного ДНК субстрата из полиакриламидного геля.

Полосу, соответствующую ДНК субстрату по данным радиоавтографии, вырезают из геля и добавляют к ней 1 объем элюирующего буфера, содержащего 0,5 М NН₄СН₃СO₂, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Инкубируют при вращении (100 rpm) в течение 12 ч при 37С. Центрифугируют 10 мин при 10000 g. Собирают надосадочную жидкость и осаждают ДНК этиловым спиртом. Осадок растворяют в 50 мкл буфера 50 мМ трис-НСl (рН 8,0), 2 мМ ЭДТА (рН 8,0). Измеряют спектрофотометрически концентрацию полученного ДНК субстрата.

Пример 2. Определение скорости реакции 3’-процессинга, катализируемой ИН ВИЧ.

Активность интегразы измеряют по отщеплению радиоактивно меченного динуклеотида GT* с 3’ конца обеих цепей ДНК-субстрата. Реакционная смесь (45-50 мкл) содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl₂, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 70 нг рекомбинантной интегразы ВИЧ и 2 нМ радиоактивно меченного субстрата.

Реакционную смесь помещают в лед на 10 мин и затем инкубируют 60 мин при 37С. В процессе инкубации отбирают аликвоты по 10 мкл через каждые 10-20 мин. Продукты реакции анализируют электрофоретически, используя 20% ПААГ в денатурирующих условиях (7,5 М мочевина), с последующей радиоавтографией (фиг.2). Для количественного определения продукта реакции фрагменты геля, соответствующие продукту на радиоавтографе, вырезают и измеряют радиоактивность на счетчике (Mark-III).

Пример 3. Определение кинетических параметров реакции 3’-процессинга, катализируемой интегразой.

При определении кинетических параметров реакционная смесь (45-50 мкл) для реакции 3’-процессинга содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl₂, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 70 нг рекомбинантной интегразы ВИЧ и варьируемые концентрации радиоактивно меченного субстрата (10^-11-10^-8 М).

Реакционную смесь помещают в лед на 10 мин и затем инкубируют 60 мин при 37С. В процессе инкубации отбирают аликвоты по 10 мкл через каждые 10-20 мин. Продукты реакции анализируют, как в примере 2.

Km реакции 3’ процессинга находят по уравнению Михаэлиса-Ментен, используя программу Origin Professional 5.0 (Micrococal inc.). Все измерения проводят на линейных участках зависимостей накопления продуктов от времени и концентрации фермента. Ошибка определения констант не превышает 10-30%. Для используемой в работе рекомбинантной интегразы ВИЧ величины Км в реакции 3’-процессинга для радиоактивно меченного субстрата составляет (1,2±0,3)10^-10 М. Все измерения проводят на линейных участках зависимостей накопления продуктов от времени и концентрации фермента. Ошибка определения констант не превышает 10-30%.

Пример 4. Ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ ауринтрикарбоновой кислотой в реакции 3’-процессинга с использованием ДНК субстрата.

При определении концентрации ауринтрикарбоновой кислоты, при которой относительная активность фермента составляет 50% ([I]₅₀); реакционная смесь (45-50 мкл) содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl₂, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 70 нг рекомбинантной интегразы ВИЧ, 2 нМ радиоактивно меченного ДНК субстрата и ауринтрикарбоновую кислоту в различных концентрациях (10^-7-10^-3 М)

Реакционную смесь помещают в лед на 10 мин и затем инкубируют 60 мин при 37С. В процессе инкубации отбирают аликвоты по 10 мкл через каждые 10-20 мин. Продукты реакции анализируют как, в примере 2.

[I]₅₀ ауринтрикарбоновой кислоты находят графически с помощью построения экспериментальных данных в координатах зависимости концентрации АТК от относительной скорости реакции 3’-процессинга. [I]₅₀ ауринтрикарбоновой кислоты в реакции 3’-процессинга, катализируемой интегразой, для данного ДНК-субстрата составляет (7,2±0,7)10^-7 М.

Пример 5. Измерение активности интегразы ВИЧ в реакции встраивания.

Активность интегразы в реакции встраивания оценивают по количеству встраивания радиоактивно меченного ДНК субстрата в плазмиду pUC19 (фиг.3). Реакционная смесь (45-50 мкл) содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl₂, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 0,5 мкг pUC19, 70 нг интегразы и 1 нМ радиоактивно меченного субстрата. Реакцию поводят при 37С в течение 30-90 мин. Продукты реакции анализируют электрофоретически, используя 4% ПААГ в нативных условиях с последующей радиоавтографией. Для количественного определения продукта реакции фрагменты геля, соответствующие продукту на радиоавтографе, вырезают и измеряют радиоактивность на счетчике (Mark-III).

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Fausi A.S. // Science. 1988. V.239. Р.617-622; Weiss R.A. // Science. 1993. V.260. Р.1273-1279; De Clercq E. // Clinical Microbiology Reviews V.8, №12, P.200-239.

2. Hindmarsh P., Leis J. // Microbiology and Molecular Biology Reviews, Dec. 1999, p.836-843.

3. Гашникова Н.М. и др. // ДАН, №4, 2001 г.

4. Chow S.A. (1997) In vitro assays for activities of retroviral integrase // Methods, 12, 306-317.

5. Патент США №5763181.

6. O’Brien С. //Science. 1994. V.266. Р.1946; Sourgen F. et all // Eur. J. Biochem. V.240. P.765-73.

7. Activity of recombinant HIV-1 integrase on mini-HIV DNA. Cherepanov P., Surratt D., Toelen J., Pluymers W., Griffith J., De Clercq E. and Debyser Z. (1999) Nucleic Acids Res., 27, 2202-2210.