способ локальной иммунокоррекции при раневой хирургической инфекции

Формула изобретения

Способ интенсификации заживления ран при раневой хирургической инфекции, включающий местное применение супернатанта, отличающийся тем, что используют супернатанты активированных адгезией нейтрофилов, которые наносят на рану с 3-4 суток после оперативного вмешательства, пятикратно, с интервалом 24 ч в дозе 0,5-1,0 мл супернатанта, разведенного в 3,0 мл физиологического раствора, а через 12 ч проводят перевязки с антисептиками, причем супернатанты получают путем культивирования лейкоцитарной смеси в течение 1 ч при температуре 37°С, а неадгезированные клетки удаляют из супернатантов центрифугированием при 3000 об/мин, в течение 10 мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии.

Цель изобретения - повысить эффективность проводимой терапии, в результате стимуляции местного иммунитета значительно уменьшить локальную воспалительную реакцию, снизить уровень бактериальной обсемененности раны, повысить темпы сокращения раневого дефекта.

Сущность изобретения заключается в местном применении аутологичных секреторных продуктов активированных адгезией нейтрофилов в дополнение к комплексной терапии гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей (карбункулы, абсцессы, флегмоны) у мужчин и женщин. Для этого у больного производят забор 20,0 мл гепаринизированной периферической венозной крови, которую с целью осаждения эритроцитов и получения лейкоцитарной взвеси отстаивают с добавлением 10% раствора желатина в соотношении 10:1 при температуре 37С в течение 30 минут. Выделенную лейкоцитарную взвесь однократно отмывают в растворе Хенкса центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут. Определяют количество нейтрофилов в 1,0 мл лейкоцитарной взвеси, разводят нейтрофилы до концентрации 5 млн кл/мл раствором Хенкса. Разливают по 1,0 мл клеточной суспензии в пластмассовые лабораторные чашки Петри для однократного применения диаметром 40 мм. Культивируют 1 час при температуре 37С. Адгезированные при таком режиме культивирования клетки состоят на 94-98% из нейтрофилов, 2-6% составляют мононуклеары. Сливают надосадок. Неадгезированные клетки удаляют из супернатанта центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут. Полученный бесклеточный супернатант стерилизуют фильтрацией через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм ("Millipore", USA). Выделенные аутологичные супернатанты активированных адгезией нейтрофилов наносят на рану больного пятикратно с интервалом 24 часа в дозе 0,5-1,0 мл супернатанта, разведенного в 3,0 мл 0,9% раствора NaCl. Перед использованием супернатанты проверяют на стерильность и иммунотропную активность. Стимулирующая активность супернатантов нейтрофилов больного устанавливается "in vitro" при использовании в качестве клеток-мишеней моноцитов донора, функциональная активность которых увеличивается после культивирования с исследуемым супернатантом. Доза супернатанта нейтрофилов больного определяется уровнем содержания в нем иммуностимулирующих факторов при сравнении его активности на моноцитах донора со стандартными суммарными донорскими супернатантами нейтрофилов с определенным уровнем содержания в них иммуностимулирующих продуктов. Для оценки эффективности местного применения супернатантов аутологичных нейтрофилов всех больных обследуют дважды: на 2-3 и 9-10 сутки после оперативного вмешательства. Определяют клеточный состав раневого отделяемого (Камаев М.Ф., 1970), функциональную активность фагоцитов в ране (лизосомальную, фагоцитарную и НСТ-редуцирующую функции нейтрофилов и макрофагов) (Маянский А.Н., Виксман М.К., 1979; Эберт Л.Я. и соавт., 1983; Власов А.В., 1989; Park B.N. et al., 1968), темпы сокращения раневого дефекта (Песчанский B.C. и соавт., 1977; Шнейдер А.Б., 1983), уровень бактериальной обсемененности раны с подсчетом КОЕ в 1,0 мл раневого отделяемого. Состояние раны (наличие воспалительных явлений вокруг раны, характер отделяемого из раны, сроки начала гранулирования раны) отмечают ежедневно во время перевязок.

Пример 1. Больной Б., 42 года. Госпитализирован с диагнозом: карбункул подлопаточной области. Произведена операция - некрэктомия. У пациента взято 20,0 мл венозной крови, выделено 7,0 мл супернатанта активированных нейтрофилов по вышеописанному способу. В течение трех дней производились перевязки с 0,05% раствором хлоргексидина. Общая антибиотикотерапия с учетом антибиотикочувствительности выделенного возбудителя проводилась в течение 7 суток. На 3 сутки после оперативного вмешательства на фоне воспалительных явлений вокруг раны появились краевые некрозы. Размеры послеоперационной раны составляли: длина - 8,0 см; ширина - 8,0 см; глубина - 2,0 см. В результате бактериологического исследования раневого отделяемого выделен Staphylococcus aureus, 10⁶ КОЕ/мл. В мазках из раневого отделяемого определено процентное содержание лейкоцитов: 74% составляли нейтрофилы, 16% - лимфоциты, 10% - макрофаги. При изучении функциональной активности нейтрофилов и макрофагов в ране у больного отмечалось угнетение функций макрофагов (лизосомальной и фагоцитарной). С четвертых суток после оперативного вмешательства осуществлялись ежедневные пятикратные перевязки с выделенным супернатантом в количестве 1,0 мл, разведенным в 3,0 мл физиологического раствора. Предварительно рана обрабатывалась раствором перекиси водорода с последующим орошением супернатантом нейтрофилов больного. Накладывалась асептическая повязка. Через 12 часов осуществлялись перевязки с ферментами, антисептиками. После местного применения супернатанта нейтрофилов воспалительные явления вокруг раны купировались; отека, инфильтрации в области раны нет, отделяемое из раны скудное, серозного характера. Рана выполнилась яркими грануляциями. Размеры раны: длина - 4,0 см; ширина - 3,0 см; глубина - 0,5 см. При бактериологическом исследовании отделяемого из раны выделен St. aureus, 10³ КОЕ/мл. В мазках из раневого отделяемого 50% составляют нейтрофилы, 30% - макрофаги и фибробласты, 20% - лимфоциты. Функциональная активность макрофагов в ране значительно увеличилась. На рану наложены вторичные швы. В удовлетворительном состоянии больной выписан на амбулаторное лечение.

Пример 2. Больная В., 32 года. Поступила с диагнозом: постинъекционная флегмона левой ягодицы. Произведена операция -вскрытие флегмоны. Взята кровь из вены в количестве 20,0 мл для получения супернатанта активированных адгезией нейтрофилов. Выделено 5,0 мл супернатанта нейтрофилов. Больной была назначена общая антибиотикотерапия с учетом антибиотикочувствительности выделенного возбудителя в течение 7 суток. Местно проводились перевязки с 0,05% раствором хлоргексидина. Кожа вокруг раны гиперемирована, отмечается отек, инфильтрация тканей. Размеры послеоперационной раны следующие: длина - 6,0 см; ширина - 3,0 см; глубина - 4,5 см. При бактериологическом исследовании отделяемого из раны выделен St. aureus, 10⁶ КОЕ/мл. В мазках из раневого отделяемого определено процентное содержание лейкоцитов: 76% - нейтрофилы, 15% - макрофаги, 9% - лимфоциты. При изучении функциональной активности нейтрофилов и макрофагов в ране у больной отмечалось угнетение фагоцитарной функции нейтрофилов и макрофагов. С третьих суток после операции осуществлялись ежедневные перевязки с выделенным аутологичным супернатантом нейтрофилов в количестве 0,5 мл, разведенным в 3,0 мл физиологического раствора. Через 12 часов проводились перевязки с 0,05% раствором хлоргексидина. После использования аутологичных супернатантов воспалительные явления вокруг раны купировались, рана выполнилась грануляционной тканью, отделяемое из раны серозное, скудное. Размеры раны: длина - 3,0 см; ширина - 1,5 см; глубина - 2,0 см. При бактериологическом исследовании отделяемого из раны - роста микроорганизмов нет. Клеточный состав раневого отделяемого следующий: 46% составляют нейтрофилы, 35% - макрофаги и фибробласты, 19% - лимфоциты. Сниженная на ранних стадиях течения раневого процесса фагоцитарная активность нейтрофилов и макрофагов увеличилась более чем в 2 раза, а также возросли показатели спонтанного НСТ - теста макрофагов. Больная выписана в удовлетворительном состоянии на амбулаторное лечение.

Предложенный способ локальной иммунокоррекции был использован при лечении 15 пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей (карбункулы, абсцессы, флегмоны). После местного применения аутологичных супернатантов нейтрофилов у больных достоверно по сравнению с контрольной группой и с исходными данными увеличивалась сниженная на ранних стадиях течения раневого процесса функциональная активность нейтрофилов и макрофагов в ране (лизосомальная, фагоцитарная), появлялась тенденция к росту кислородзависимого киллинга. Достоверно изменялся клеточный состав раневого отделяемого: более интенсивно по сравнению с контрольной группой уменьшалось процентное содержание нейтрофилов и возрастало количество макрофагов и фибробластов в ране, что свидетельствовало о более быстром наступлении регенеративного этапа заживления раны. Это сопровождалось более интенсивной динамикой исчезновения локального воспаления, ранним образованием грануляционной ткани по сравнению с контрольной группой. Так, у всех больных после использования аутологичных супернатантов нейтрофилов объективно выявлено отсутствие гиперемии, отека вокруг раны. В среднем, на пятые сутки после оперативного вмешательства отмечено появление ярких грануляций, тогда как в контрольной группе грануляции появлялись, в среднем, на седьмые сутки после операции. Анализ величины относительного заживления ран показал, что у больных при использовании аутологичных секреторных продуктов нейтрофилов динамика заживления ран была более интенсивной по сравнению с контролем (величина относительного заживления ран у таких больных более чем в 1,5 раза превышала аналогичные показатели у больных в контрольной группе). Кроме того, результаты бактериологического исследования отделяемого из раны выявили, что у больных после местного применения аутологичных супернатантов нейтрофилов содержание микроорганизмов в ране в 20 раз было меньше, чем у больных в контрольной группе в одни и те же сроки наблюдения. Осложнений после использования аутосупернатантов нейтрофилов не наблюдалось. Все больные были выписаны в удовлетворительном состоянии на амбулаторное лечение, в среднем, на 3 - 5 дней раньше, чем пациенты контрольной группы.

Контрольную группу составили 15 больных, которые получали лечение по общепринятой схеме. В качестве плацебо использовали физиологический раствор в аналогичной дозе и кратности применения. Диагноз, возраст, пол больных были идентичны в обеих группах. В контрольной группе у пациентов дольше сохранялись отек, гиперемия, средний срок появления грануляций составлял 7 суток после оперативного вмешательства. Функциональная активность нейтрофилов и макрофагов в ране по некоторым показателям на ранних стадиях течения раневого процесса была сниженной (лизосомальная активность макрофагов, фагоцитарная функция нейтрофилов и макрофагов). При повторном исследовании значения функций нейтрофилов и макрофагов сохранялись на исходном уровне, а по некоторым показателям (лизосомальная, НСТ-редуцирующая активность нейтрофилов и макрофагов) достоверно снижались. Клеточный состав раневого отделяемого характеризовался менее интенсивным ростом процентного содержания макрофагов и фибробластов на фоне более высокого количества нейтрофилов. Больные из этой группы дольше находились на стационарном лечении.

Достоинством предложенного способа локальной иммунокоррекции при раневой хирургической инфекции с помощью аутологичных секреторных продуктов нейтрофилов является:

- повышает эффективность проводимой терапии;

способ прост и доступен, не требует использования дорогостоящих препаратов;

- возможность получения секреторных продуктов нейтрофилов в достаточно чистом виде;

- возможность получения иммуностимулирующих факторов нейтрофилов, обладающих равнонаправленным спектром действия;

- применение аутологичного супернатанта нейтрофилов исключает возможность заражения больного вирусами гепатита, ВИЧ и т.п.;

- бесклеточный супернатант активированных нейтрофилов больного позволяет избежать развития аллергических и цитотоксических реакций, наблюдаемых при применении чужеродных лейкоцитов, поскольку используемый бесклеточный супернатант состоит из продуктов, секретируемых нейтрофилами самого больного и полностью идентичен организму.

По данным патентного поиска предлагаемый способ локальной иммунокоррекции при раневой хирургической инфекции обладает новизной и соответствует критерию "новизна", а по совокупности отличительных действий (дополнительное применение аутологичных супернатантов нейтрофилов в лечении в определенной дозе и по разработанной схеме) обладает критерием "существенные отличия".