способ обнаружения микроорганизма "montezuma"

Формула изобретения

Способ определения риккетсиеподобного микроорганизма "Montezuma" при помощи ПЦР, отличающийся тем, что для определения ДНК при проведении первой ПЦР используют внешнюю пару праймеров Per1mod (5"-TTTATCGCTACAAGATGAGCCCATG) и Per2mod (5"-CTCTACACTAGGAATTCCGCCAT) с соблюдением следующих условий: 1 l исследуемой очищенной ДНК добавляют к 9, 19 или 49 l реакционной смеси, содержащей соответствующее количество необходимых компонентов для проведения ПЦР с Taq-полимеразой, начальная денатурация - 5 мин, затем 40 циклов, состоящих из 11 с денатурации при 94С, 10 с присоединения праймеров при 50С и 15 с элонгации при 72С, финальную элонгацию продолжают 7 мин при 72С, затем проводят постановку ПЦР с использованием гнездовых праймеров: Mon1 (5"-CCCATGCAAGATTAGCTAGTTGGTGAG) и Моn2 (5"-CAATTCTTGGGTTAAGCCCAAGGAT) с соблюдением следующих условий: 1 l продукта реакции первой ПЦР добавляют к 19 l реакционной смеси, содержащей соответствующее количество необходимых компонентов для проведения ПЦР с Taq-полимеразой, начальная денатурация - 5 мин, затем 40 циклов, состоящих из 30 с денатурации при 94С, 30 с присоединения праймеров при 55С и 30 с элонгации при 72С, финальную элонгацию продолжают 7 мин при 72С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, к эпидемиологии, к микробиологии и молекулярной биологии.

Аналогом является способ определения ДНК любого организма в исследуемом материале при наличии специфических для данного ДНК праймеров (Saiki R.M., Gelfand D.N., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. Science, 1988, 239: 487-491).

Недостатком является отсутствие специфических праймеров и модификаций основной методики для определения нового микроорганизма, что не позволяет диагностировать заражение биологических объектов (кровь, тканевая жидкость и другие биологические материалы больных людей и животных, а также клещей) риккетсиеподобным микроорганизмом "Montezuma". Указанный микроорганизм был обнаружен у людей, больных остролихорадочным заболеванием из группы пятнистых лихорадок, связанным с присасыванием клещей и у клещей - переносчиков инфекции. Этому микроорганизму авторами было дано временное название "Montezuma".

Наиболее близким аналогом-прототипом является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики близкого микроорганизма - возбудителя гранулоцитарного эрлихиоза человека (Massung R.F., Slater К., Owens J.H. et al. Nested PCR assay for detection of granulocytic ehriichiae. J.Clin Microbiol., 1998, 36: 1090-1095), который также не позволяет определить наличие в исследуемом материале ДНК микроорганизмов "Montezuma".

Задачей изобретения является обнаружение нового микроорганизма "Montezuma" в биологических средах путем определения ДНК с помощью ПЦР.

Способ осуществляется следующим образом: ДНК микроорганизма "Montezuma" из любого исследуемого материала выделяют методом Ausubel F.M., Brent R., Kingaton R.E. et al. (Short Protocols in Molecular Biology. - New York: John Wiley & Sons, 1999). Для проведения первой ПЦР используют внешнюю пару праймеров, подобранных на основе секвенирования гена 16S рибосомальной РНК микроорганизма "Montezuma" со специфической последовательностью нуклеотидов:

Per1mod (5"-TTTATCGCTACAAGATGAGCCCATG) и

Per2mod (5"-CTCTACACTAGGAATTCCGCCAT)

с оптимизацией условий проведения реакции: 1 l исследуемой очищенной ДНК добавляется к 9, 19 или 49 l реакционной смеси, содержащей соответствующее количество необходимых компонентов для проведения ПЦР с Taq-полимеразой (производства Promega, USA). Начальная денатурация - 5 минут, затем 40 циклов, состоящих из 11 секунд денатурации при 94С, 10 секунд присоединения праймеров при 50С и 15 секунд элонгации при 72С. Финальная элонгация продолжается 7 минут при 72С. Затем проводят постановку гнездовой ПЦР с использованием второй пары праймеров:

Mon1 (5"-CCCATGCAAGATTAGCTAGTTGGTGAG) и

Mon2 (5"-CAATTCTTGGGTTAAGCCCAAGGAT)

с оптимизацией условий проведения реакции: 1 l продукта реакции первой ПЦР добавляется к 19 l реакционной смеси, содержащей соответствующее количество необходимых компонентов для проведения ПЦР с Taq-полимеразой (производства Promega, USA). Начальная денатурация - 5 минут, затем 40 циклов, состоящих из 30 секунд денатурации при 94С, 30 секунд присоединения праймеров при 55С и 30 секунд элонгации при 72С. Финальная элонгация продолжается 7 минут при 72С. В результате проведенной реакции при наличии в образце, взятом для исследования, хотя бы нескольких молекул ДНК искомого микроорганизма, происходит репликация ДНК до количеств, определяемых лабораторными методами.

Пример 1. 35 клещей вида Ixodes persulcatus были исследованы на наличие микроорганизма "Montezuma" по вышеописанной методике. До момента исследования клещи хранились при -80С. ДНК извлекалась при помощи коммерческих наборов фирмы Qiagen. При проведении ПЦР в 34 пробах из 35 клещей была найдена ДНК микроорганизма "Montezuma". Проведенное далее прямое секвенирование полученного фрагмента ДНК показало, что все полученные ампликоны принадлежат одному и тому же микроорганизму, которому ранее авторами было дано временное название "Montezuma". Одновременно с проводимыми исследованиями проводились реакции с выделенными ДНК от следующих микроорганизмов: Rickettsia sibirica, Anaplasma phagocytophila, Anaplasma bovis, Ehrlichia chaffeensis, Borrelia burgdorferi sensu stricto, Coxiella-like microorganism "Cenerentola". Ни в одной из исследуемых проб не было найдено указанных микроорганизмов. Кроме того, известно, что клещи Ixodes persulcatus могут содержать в себе не только ДНК микроорганизма "Montezuma", но одновременно и ДНК других микроорганизмов, таких как Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophila, Ehrlichia chaffeensis, Rickettsia sp. (из группы пятнистой лихорадки), Agrobacterium tumefacien. При проведении ПЦР по указанной методике ДНК ни одного из вышеуказанных микроорганизмов не вступала в реакцию со специфическими праймерами, что было доказано при секвенировании полученных при ПЦР ампликонов.

Пример 2. История болезни №747. Больной И., 48 лет, житель п. Мирного Хабаровского края, находился в инфекционном отделении 10 горбольницы г. Хабаровска с 11.07.01 по 17.07.02. Поступил на 6-й день болезни с жалобами на слабость, ломоту в теле, повышение температуры до 38C, головную боль, тошноту. Заболел остро, температура до 39C, озноб, ломота в теле, на 4-й день появилась сыпь, потемнела моча. Принимал жаропонижающие.

Из эпидемиологического анамнеза известно, что больной с 30.06.01 по 01.07.01 был на рыбалке и 4.07.01 снял с боковой поверхности грудной клетки присосавшегося клеща. При осмотре выявлена умеренная интоксикация, температура была 38С. На туловище обнаружена грубая крупная пятнистая сыпь. На боковой поверхности грудной клетки слева в месте присасывания клеща найден первичный аффект в виде инфильтрата размером 3,5 см в диаметре, покрытого корочкой 1 см в диаметре, подмышечный лимфаденит слева. Пальпировался край печени, выступающий на 1-1,5 см ниже края реберной дуги. Пальпировалась селезенка. При лабораторном обследовании выявлены нормоцитоз с резким сдвигом формулы влево (до 43% палочкоядерных нейтрофилов), увеличение активности сывороточных транеаминаз (аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы) в 1,5-2 раза. Был заподозрен клещевой риккетсиоз Северной Азии и назначено соответствующее лечение. Однако при серологическом исследовании сыворотки крови в динамике болезни у больного не было выявлено титров антител против известных клещевых трансмиссивных патогенов (вирус клещевого энцефалита, возбудители болезни Лайма, клещевого риккетсиоза). Тогда было проведено обследование больного на наличие микроорганизма "Montezuma". Для этого из лейковзвеси, полученной из цельной крови, смешанной с антикоагулянтом (EDTA), была выделена ДНК. Исследование проводилось по предложенной методике. Были получены положительные результаты, полученный ампликон секвенирован и доказана его идентичность с ДНК микроорганизма "Montezuma". Дополнительно выделенная ДНК исследовалась в ПЦР на наличие нуклеиновых кислот других инфекционных агентов (Rickettsia spp., Borrelia burgdorferi sensu lato, Babesia microti, Anaplasma phagocytophila, Ehrlichia chaffeensis, Bartonella spp., вирус клещевого энцефалита). Все результаты оказались отрицательными, единственная полученная при ПЦР ДНК оказалась частью генома микроорганизма "Montezuma".

Предлагаемый способ был оценен при исследовании ДНК, выделенной из клещей (переносчиков заболевания) и крови больного человека. Достоверность результатов была проверена прямым секвенированием полученного фрагмента ДНК и сравнения его с эталонной ДНК искомого микроорганизма (последовательность зарегистрирована под номером AF493952 в международном банке генетических данных GenBank).