способ получения биологически активных веществ из древесной зелени пихты

Формула изобретения

1. Способ получения биологически активных веществ из древесной зелени пихты, включающий измельчение исходного сырья, экстракцию органическим растворителем и последующую отгонку последнего, отличающийся тем, что в качестве сырья используют высушенную на воздухе древесную зелень с влажностью не более 10%, сырье экстрагируют азеотропной смесью изопропиловый спирт:вода (88:12), экстрагент отгоняют, суммарный экстракт отстаивают в течение 48-72 ч при температуре 60-70С, нижний водно-органический слой сливают, охлаждают, промывают неполярным растворителем, удаляют последний и получают фракцию полярных веществ, а из верхнего органического слоя суммарного экстракта выделяют сумму тритерпеновых кислот.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию проводят при соотношении сырье:экстрагент, равном 1:(4-7).

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстрагент отгоняют при температуре 65-70С и остаточном давлении 300-400 мм рт.ст.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что нижний водно-органический слой после сливания охлаждают до 35-45С.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве неполярного растворителя используют трет-бутилметиловый эфир или уайт-спирит или бензин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, в частности к способам получения биологически активных экстрактивных веществ из древесной зелени пихты.

Из всего разнообразия экстрактивных веществ, выделяемых из древесной зелени хвойных пород, наиболее широкую известность и применение нашли в сельском хозяйстве тритерпеновые кислоты, обладающие ростстимулирующей и фунгицидной активностью.

Известны различные способы получения биологически активной суммы тритерпеновых кислот из древесной зелени пихты, которые широко используются в сельском хозяйстве для повышения продуктивности растений. Известен, например, способ получения биологически активной суммы тритерпеновых кислот из высушенной древесной зелени пихты сибирской (Патент РФ №2108803, кл. А 61 К 35/78, опубл. 20.04.98), согласно которому измельченную древесную зелень экстрагируют трет-бутилметиловым эфиром, экстракт обрабатывают водным раствором щелочного раствора, подкисляют его до рН 2 и выделяют целевой продукт из этого раствора экстракцией трет-бутилметиловым эфиром.

Недостатками известного способа являются его многостадийность и функциональная ограниченность, связанная с получением только одного биологически активного препарата, так как трет-бутилметиловый эфир не экстрагирует группу полярных веществ, также обладающих высокой биологической активностью. Для их извлечения необходима последующая экстракция более полярным экстрагентом. Последовательная экстракция древесной зелени разными экстрагентами создает значительные сложности при промышленном использовании данного способа из-за постоянного их смешивания, образования азеотропных смесей и большого объема перегоняемых ЛВЖ.

Ближайшим к заявляемому способу - прототипом является способ получения биологически активной суммы тритерпеновых кислот из древесной зелени пихты экстракцией водными спиртами или ацетоном (Патент РФ №2179393, кл. А 01 N 65/00, опубл. 20.02.2000). Способ заключается в экстракции измельченной свежесобранной хвои пихты сибирской алифатическим спиртом с числом углеродных атомов 1, 2, 3 или ацетоном с содержанием воды не более 50%. Из полученного экстракта отгоняют растворитель, затем при пониженном давлении - воду и получают вязкую темно-зеленую массу. Отогнанную смесь растворителя с водой далее снова используют в качестве экстрагента новой порции древесной зелени пихты.

Выход целевого продукта составляет 6,3-6,5%.

Известный способ имеет ряд недостатков. Во-первых, количественное определение суммы тритерпеновых кислот этим способом, без наличия стандарта, практически невозможно, а с использованием стандарта точность определения выхода целевого продукта не превышает 30% (ТУ 2449-003-03533895-01). Таким образом, в данном способе указывается выход не суммы тритерпеновых кислот, а суммарный выход экстрактивных веществ (реальный выход целевого продукта составляет не более 4%). Во-вторых, при экстракции свежесобранного сырья или при использовании сильно обводненного растворителя значительно уменьшается выход группы нейтральных веществ, которые также обладают высокой биологической активностью. В-третьих, однородный экстракт получается только при использовании древесной зелени с влажностью не более 10% и однократном использовании растворителей с содержанием воды не более 10%. В-четвертых, при постоянном возвращении отогнанного растворителя для последующей экстракции происходит повышение содержания воды за счет вытяжки остаточной влаги из сырья. Это приводит к уменьшению суммарного выхода экстрагируемых веществ. При отгонке растворителя из такого экстракта происходит расслоение его на два слоя, причем в зависимости от количества воды в кубовом остатке водный слой, содержащий полярные вещества, может быть и верхним, и нижним слоем. При большом содержании воды верхний слой является водным, а нижний содержит нейтральные вещества и тритерпеновые кислоты, как это описано в примере 2 прототипа. При небольшом количестве остаточной влаги (10-20% от веса кубового остатка) группу полярных соединений с остатками растворителя и избыточной влаги содержит нижний слой.

Целью изобретения является повышение функциональных возможностей способа за счет выделения из древесной зелени пихты в одном технологическом процессе двух препаратов, разных по химическому составу и биологической активности.

Поставленная цель достигается тем, что высушенную на воздухе и измельченную древесную зелень (хвоя и побеги) пихты с влажностью не более 10% экстрагируют азеотропной смесью: изопропиловый спирт:вода (88:12), экстрагент отгоняют и возвращают в производство, суммарный экстракт отстаивают в течение 48-72 часов при температуре 60-70С для разделения его на два слоя, после чего нижний водно-органический слой сливают, охлаждают, промывают неполярным растворителем (трет-бутилметиловый эфир, уайт-спирит, бензин) и удаляют в вакууме из него остатки растворителя. В результате получают фракцию полярных веществ в виде тягучей красно-коричневой массы с содержанием сухих веществ 69-77%, растворимую в органических полярных растворителях (ацетон, спирт). Из верхнего органического слоя, содержащего неполярную часть суммарного экстракта, выделяют сумму тритерпеновых кислот известным способом.

Выход суммы тритерпеновых кислот составляет 5-6% от веса исходного сырья.

Выход фракции полярных веществ (условное наименование препарата - Терпенол) зависит от влажности сырья и растворителя и составляет 4,7-6% от веса сухой древесной зелени.

Таким образом, в одном технологическом процессе выделяют сразу два биологически активных препарата: сумму тритерпеновых кислот и Терпенол.

Препарат Терпенол представляет собой природный комплекс веществ фенольной и углеводной природы, дающий положительную цветную реакцию на фенолы с хлорным железом и проявляющий в спектре ЯМР на ядрах ¹³С сигналы углеводных атомов углерода. Биологическая активность препарата Терпенол, по данным полевых испытаний, отлична от свойств суммы тритерпеновых кислот, получаемых известным способом (Патент РФ №2108803, 1998).

Отличительными признаками заявляемого способа по сравнению с прототипом являются:

- в качестве исходного сырья используют высушенную на воздухе древесную зелень пихты с влажностью не более 10%, что позволяет предотвратить вытяжку остаточной влаги из сырья и разбавление водой экстрагента;

- в качестве экстрагента используют азеотропную смесь: изопропиловый спирт:вода в соотношении 88:12, что позволяет экстрагировать не только эфирорастворимые вещества (тритерпеновые кислоты и сопутствующие им нейтральные вещества), но и качественно другие, более полярные компоненты;

- после отгонки эктрагента суммарный экстракт подвергают отстаиванию в течение 48-72 часов при температуре 60-70С, что позволяет разделить его на два слоя: верхний органический слой, содержащий сумму тритерпеновых кислот, и нижний водно-органический слой, содержащий фракцию полярных компонентов;

- нижний слой экстракта сливают, охлаждают, промывают растворителем, преимущественно трет-бутилметиловым эфиром, растворитель удаляют и получают полярную фракцию компонентов (препарат Терпенол), что позволяет повысить функциональные возможности способа за счет получения нового ценного биологически активного продукта.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Высушенную на воздухе и измельченную древесную зелень пихты с влажностью 5% (12,2 кг) заливают 50 л водного 88%-ного изопропилового спирта. Из полученного экстракта при температуре 65С и остаточном давлении 300 мм рт.ст отгоняют экстрагент в количестве 50 л, который постоянно возвращают на экстракцию. Кубовый остаток в количестве 2,3 кг оставляют при температуре 60С в течение трех суток (72 часа) для разделения смеси на два слоя, затем сливают через нижний патрубок 1 л нижнего водно-органического слоя в колбу, охлаждают до 45С и добавляют 0,5 л трет-бутилметилового эфира. После перемешивания механической мешалкой 60 об/мин в течение 30 мин смеси дают отстояться (5 мин) и отделяют декантацией верхний (эфирный) слой. Получают 0,74 кг фракции полярных компонентов экстракта в виде красно-коричневой смолообразной массы с содержанием сухих веществ 77%. В пересчете на сухое вещество его вес составляет 0,57 кг, что составляет 4,7% от веса исходной древесной зелени.

Декантированный эфирный слой смешивают с верхним слоем исходного расслоившегося кубового остатка (1,3 кг), добавляют к нему 10 л трет-бутилметилового эфира и 10 л 2%-ного водного раствора гидроокиси натрия. Полученный раствор энергично перемешивают и оставляют на 0,5 часа для расслоения, после чего нижний (водно-щелочной) слой сливают, а верхний (эфирный) повторно обрабатывают новой порцией (5 л) 2%-ного водного раствора гидроокиси натрия, причем получаемый при этом водно-щелочной слой объединяют с полученным при первой водно-щелочной обработке, подкисляют соляной кислотой до рН 2, энергично перемешивают с 12 л трет-бутилметилового эфира и оставляют на 15 мин для расслоения. Эфирный слой отделяют, промывают его насыщенным водным раствором хлористого натрия и отгоняют из него растворитель. Получают 0,698 кг (5,7%) суммы тритерпеновых кислот.

Таким образом, суммарный выход экстрактивных веществ при экстракции водным азеотропом изопропилового спирта составляет 1,27 кг или 10,4% от веса сухого сырья.

Пример 2.

Высушенную на воздухе и измельченную древесную зелень пихты (3 кг) с влажностью 10% заливают 20 л водного 88%-ного изопропилового спирта. Из получаемого экстракта при температуре 70С и остаточном давлении 400 мм рт.ст. отгоняют экстрагент в количестве 20 л, который постоянно возвращают на экстракцию. Кубовый остаток в количестве 0,65 кг отстаивают при температуре 70С в течение 48 часов. Верхний слой расслоившегося кубового остатка (0,42 кг) декантируют, а нижний слой сливают, охлаждают до 35С и промывают 0,2 литра уайт-спирита. Получают 0,22 кг тягучей коричневой массы (препарат Терпенол) с содержанием сухих веществ 68% (выход 0,15 кг или 5% от исходного сырья.

Уайт-спиритный промывной раствор смешивают с верхним слоем кубового остатка (0,42 кг) и выделяют из него сумму тритерпеновых кислот аналогично примеру 1. Выход суммы тритерпеновых кислот составил 0,18 кг (6% от исходного сырья).

На чертеже приведена хроматограмма, полученная методом ВЭЖХ для образцов фракции полярных компонентов, полученного в условиях примера 1. Условия анализа: микроколоночный жидкостной хроматограф “Миллихром”, колонка “Лихросорб РП-18”, зерно - 5 мкм, элюент - смесь 0,05 М водной ортофосфорной кислоты и 20%-ного метанола в соотношении 85:15 по объему соответственно, УФ-детекция при 200 и 240 нм.

Таким образом, использование водного азеотропа изопропилового спирта в качестве экстрагента древесной зелени, с последующим отстаиванием кубового остатка, позволяет просто и практически без дополнительных затрат выделять фракцию полярных веществ наряду с препаратом, содержащим сумму тритерпеновых кислот.

Пример 3.

Полевые испытания биологической активности препарата Терпенол проводили в Первомайском районе Алтайского края на яровой пшенице “Алтайская-92”. Предпосевную обработку семян проводили за день посева препаратом, содержащим сумму тритерпеновых кислот (СТТК) - норма расхода 50 г/т, и препаратом Терпенол - норма расхода 5 г/т, при расходе рабочего раствора 10 л/т. Эффективность препаратов для предпосевной обработки семян яровой пшеницы “Алтайская-92” представлена в таблице 1. Из таблицы видно, что наибольшая прибавка получена при использовании препарата Терпенол - 5 ц/га.

Вегетирующие растения яровой пшеницы обрабатывали в фазе кущения препаратами (СТТК) (норма расхода 50 г/га) и Терпенол (норма расхода 5 г/га) при расходе рабочей жидкости 300 л/га. Контрольные растения опрыскивали водой.

Результаты обработки представлены в таблице 2. Из таблицы видно, что наибольшая прибавка урожая получена при использовании препарата Терпенол - 7,3%. Таким образом, препарат Терпенол обладает высокой биологической активностью на рост и развитие растений (яровой пшеницы), не уступающей, а иногда и превосходящей активность широко известного препарата, содержащего сумму тритерпеновых кислот.