способ криоконсервирования гемопоэтических клеток человека

Формула изобретения

Способ криоконсервирования гемопоэтических клеток человека, который включает добавление в суспензию клеток криопротектора диметилсульфоксида, трехэтапное замораживание суспензии с последующим оттаиванием, при этом на первом этапе замораживание осуществляют со скоростью в пределах 0,7-1,2С/мин, отличающийся тем, что применяют концентрации криопротектора 0,4-1,45 моль/л, на первом этапе замораживание осуществляют до минус 8,5-минус 10,5С с применением сидинга при температуре минус 3,5-минус 4С, на втором этапе - со скоростью 1,0-4,5С/мин до минус 30-минус 40С, при этом после второго этапа осуществляют температурную остановку при минус 30-минус 40С в течение 3-5 мин, а на третьем этапе - со скоростью 10-12С/мин до минус 130-минус 196С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для криоконсервирования гемопоэтических клеток человека.

Известен способ криоконсервирования тромбоцитов (смотри заявку России 99126524/14, МПК A 01 N 1/02, опубл. заявки 27.08.2001) который предусматривает криоконсервирование в гофрированных алюминиевых контейнерах с удалением излишка плазмы центрифугированием и с последующим ресуспендированием суспензии и добавлением криопротектора, в котором подготовку к консервированию осуществляют в полимерном контейнере, который помещают в дюралевый пенал-холдер, а замораживание проводят при температуре -80°С, хранение осуществляют в этой же таре.

Недостатком данного способа является то, что обозначенный режим замораживания травматичный для гемопоэтических клеток человека, потому что быстрое снижение температуры вызывает рост больших кристаллов, которые нарушают оболочки клеток. Это приводит к снижению периода хранения и уменьшению количества жизнеспособных клеток после периода хранения.

Известен способ криоконсервирования и подготовки к трансфузии гемопоэтических клеток кордовой крови (см. патент Украины 42599, МПК А 01 N 1/00, А 01 N 1/02, А 61 К 35/14), который включает разведение цельной крови стабилизатором крови в соотношении 4:1, удаление эритроцитов, удаление надстоя клеточной взвеси, добавление равного объема криоконсерванта на основе поливинилпиролидона с дальнейшим программным замораживанием и размораживанием смеси, при котором удаление эритроцитов проводят после разбавления цельной кордовой крови стабилизующим раствором, обработкой разведенной кордовой крови раствором гидроксиметил-крахмала для осаждения эритроцитов, после чего осадок отделяют, свободный от эритроцитов надстой клеточной взвеси концентрируют, а криоконсервант добавляют к концентрату клеточной взвеси.

Недостатком данного способа является его многоэтапность, которая усложняет способ и ухудшает условия стерильности. Неопределенный режим замораживания гемопоэтических клеток человека не позволяет получить приемлемые результаты, потому что жизнеспособность клеток обеспечивается лишь в узком интервале скорости снижения температуры. Это приводит к снижению периода хранения и уменьшению количества жизнеспособных клеток после периода хранения.

Известен способ криоконсервирования костного мозга (см. патент России 2144290, МПК A 01 N 1/02, опубл. 20.01.2000), который осуществляют путем поэтапного замораживания в присутствии криозащитного раствора, при котором суспензию клеток, залитую в мягкий однократного использования контейнер, заполненный на 10-30%, размещенный в металлическом пенале, который обеспечивает толщину слоя суспензии 6-8 мм, на первом этапе помещают в жидкий хладагент с температурой минус 26-30С и выдерживают 15-25 мин, на втором этапе помещают в хранилище-холодильник с температурой минус 40-50С.

Недостатком указанного способа является то, что указанный режим замораживания травматичен для гемопоэтических клеток человека, так как температура хранения по способу -40 - -50С недостаточна для длительного хранения гемопоэтических клеток человека. Все это приводит к уменьшению периода хранения и снижению количества жизнеспособных клеток после периода сохранения.

Наиболее близким к заявленному по признакам является способ сохранения при криогенной температуре ткани (преимущественно кожи) млекопитающих (см. патент США 5891617, МПК A 01 N 001/02, дата публикации 06.04.99 г.), который предусматривает погружение указанной ткани в раствор криоконсерванта, что представляет собой 1,5-2,5 М глицерин в среде Dulbecco’s Modified Eagle’s Mediuм (DMEM), перемешивание указанного раствора криоконсерванта и обозначенной погруженной ткани, внесение зародышей льда в внеклеточное пространство криоконсерванта и перфузированной ткани, охлаждение обозначенной ткани со скоростью примерно -10С/мин до температуры примерно -6С, или проводят замораживание со скоростью -1°С/мин до температуры примерно -8С, продолжают охлаждение при скорости в пределах от -0,3-0,02С до температуры примерно -70С.

Недостатком указанного способа является то, что инициация кристаллообразования осуществляется путем внесения зародышей льда во внеклеточное пространство, что усложняет способ и ухудшает условия стерильности среды.

Применение среды Dulbecco’s Modified Eagle’s Mediuм в большинстве стран не разрешено для внутривенного использования и поэтому клетки, полученные таким способом, нельзя использовать в большинстве случаев лечения.

Указанные режимы замораживания травматичны для гемопоэтических клеток человека, потому что быстрое снижение температуры на первом этапе вызывает рост больших кристаллов, которые разрушают мембраны клеток.

Низкая скорость замораживания на завершающей стадии охлаждения существенно затягивает процесс выполнения способа. Температура по способу около -70С недостаточна для длительного хранения гемопоэтических клеток человека.

Благодаря тому, что способ предусматривает использование большого количества криопротектора, полученные таким способом клетки перед использованием надлежит отмывать от криопротектора, что усложняет способ и обеспечивает негативное влияние дополнительных действий на клетки.

Указанные недостатки приводят к уменьшению периода хранения и уменьшению количества жизнеспособных клеток после периода сохранения.

Задачей изобретения является создание способа криоконсервирования гемопоэтических клеток человека, в котором путем изменения режимов способа криоконсервирования, найденных эмпирическим путем, обеспечивается упрощение способа, улучшение условий стерильности, увеличение периода сохранности и повышения количества жизнеспособных клеток после периода хранения.

Для этого способ криоконсервирования гемопоэтических клеток предусматривает добавление к суспензии клеток криопротектора, многоэтапное замораживание с последующим оттаиванием.

Новым в способе является то, что применяют криопротектор концентрации 0,4-1,45 мол/л, замораживание осуществляют в три этапа, при этом на первом этапе со скоростью 0,7-1,2С/мин до -8,5 - -10,5С с применением сидинга при температуре -3,5 - -4С, на втором этапе со скоростью 1,0-4,5С/мин до -30 - -40С, после второго этапа осуществляют температурную остановку при -30 - -40°С на протяжении 3-5 мин, а на третьем этапе со скоростью 10-12°С/мин до -130 - -196С.

Вследствие применения новой совокупности признаков способа инициация кристаллообразования осуществляется без дополнительного контакта с клеточной суспензией, что упрощает способ и улучшает условия стерильности среды. Примененные в способе среды разрешены для внутривенного использования.

Указанные режимы замораживания не травматичны для гемопоэтических клеток человека, потому что эмпирически подобранный режим снижения температуры не вызывает рост больших кристаллов, которые могут нарушить целостность клеточной мембраны.

Указанные преимущества приводят к удлинению периода хранения и увеличению количества жизнеспособных клеток после периода замораживания.

Для сравнения прототипа и предложенного способа осуществляли способ по прототипу и предложенный на указанных ниже примерах 1-64. В примерах осуществляли такие действия.

Независимо от источника получения (костный мозг, кордовая кровь, эмбриональная печень, периферическая кровь) приготовление клеточной суспензии по прототипу и предложенным способом осуществляли одинаково.

В таблице 1 указаны режимы выполнения примеров 1-8 по прототипу. При подготовке клеток к низкотемпературному консервированию по прототипу в полученную взвесь клеток, которые предназначены для криоконсервирования, через инъекционную иглу по капле добавляли такой же объем криоконсерванта, который представлял собой 1,5-2,5 мол/л глицерина в среде Dulbecco’s Modified Eagle’s Mediuм при легком перемешивании взвеси путем покачивания пробирки.

С помощью шприца через инъекционную иглу гемопоэтические клетки разливали по 1 мл в полиэтиленовые криоампулы объемом 1,8 мл фирмы Nunc (CryoStore Boxes).

Криоампулы герметично закрывали крышками и маркировали. Замораживание осуществляли при различных режимах, указанных в таблице 1. Замораживание гемопоэтических клеток за прототипом выполняли с помощью программного замораживателя, который позволяет варьировать скорость снижения температуры на различных этапах. Для инициализации кристаллообразования дополнительно вносили в криоампулы зародыши льда во внеклеточное пространство.

Хранили криоконсервированные гемопоэтические клетки в низкотемпературном хранилище при -70С на протяжении двух месяцев.

Процедуру отмывания клеток от криопротектора осуществляли путем добавления раствора, который содержит вдвое меньшую концентрацию криопротектора, раствор центрифугировали при скорости 2000 об/мин на протяжении 10 минут. Потом надосадок снимали, еще раз добавляли вдвое меньшую концентрацию криопротектора, повторяли процесс центрифугирования. Надосадок снимали, к осадку прибавляли раствор физиологичного раствора до достижения начального объема суспензии.

В таблице 2 указаны режимы выполнения примеров 9-64 в соответствии с предложенным способом.

В примерах 9-22, таблица 2а, использовали гемопоэтические клетки эмбриональной печени; в примерах 23-36, таблица 2б, - гемопоэтические клетки кордовой крови; в примерах 37-50, таблица 2с, - гемопоэтические клетки периферической крови; в примерах 51-64, таблица 2д, - гемопоэтические клетки костного мозга.

Подготовка клеток к низкотемпературному консервированию по предложенному способу.

Криопротектор диметилсульфоксид (далее ДМСО) 7,0 мол/л концентрации разводили до 0,8 и 2,9 мол/л концентрации, а потом добавляли к клеткам в соотношении 1:1 до получения 0,4-1,45 мол/л конечных концентраций. В полученную взвесь клеток, которые предназначены для криоконсервирования, через инъекционную иглу по капле добавляли такой же объем 0,4-1,45 моль/л ДМСО при легком перемешивании взвеси путем покачивания пробирки.

С помощью шприца через инъекционную иглу гемопоэтические клетки разливали по 1 мл в полиэтиленовые криоампулы объемом 1-1,8 мл фирмы Nunc (CryoStore Boxes). Криоампулы герметично закрывали крышками и маркировали.

Замораживание гемопоэтических клеток выполняли с помощью программного замораживателя, который позволяет варьировать скорость снижения температуры на различных этапах криоконсервирования и автоматически осуществлять инициирование процесса кристаллизации (сидинг) при определенной температуре путем разового пропускания жидкого азота через соответствующую трубку.

При замораживании клеточной суспензии в ампулах использовали специальные укладки, в которые вставляли контейнеры вертикально и укладку размещали в теплообменную камеру замораживателя на соответствующем устройстве, которое выполняет инициацию кристаллообразования.

Замораживание клеток выполняли по трехэтапной программе. На первом этапе от комнатной температуры 20±4С со скоростью 0,7-1,2С в минуту до минус 8,5-10,5С. На протяжении первого этапа замораживания при достижении температуры -3,5-4С осуществляли захолаживание (сидинг) одной стороны контейнера с клеточной суспензией путем разового пропуска через трубку жидкого азота, благодаря чему при соответствующей температуре автоматически происходила инициация кристаллообразования.

На втором со скоростью 1,0-4,5С в 1 минуту до минус 30-40С и на третьем - со скоростью 10-12С в 1 минуту до минус 130-196С. Конкретные режимы указаны в таблице 2. Концентрация криопротектора составляла 0,4-1,4 моль/л. После завершения замораживания контейнеры с помощью щипцов вынимали из укладки и переносили в среду жидкого азота в специальное хранилище биологических продуктов (марки СБ 0,5), оборудованное ячейками со сменными кассетами.

Хранили криоконсервированные гемопоэтические клетки в низкотемпературном хранилище при минус 130-196°С на протяжении трех месяцев.

Эффективность режимов, указанных в примерах, оценивали путем проверки жизнеспособности клеток, которые оценивали методом последующего культивирования в агаровой среде клеток, замороженных по режимам, указанным в примерах 1-8, после двухмесячного хранения, а в примерах 9-64 - после трехмесячного хранения при конечной температуре охлаждения, обозначенной в примерах. Эффективность метода также оценивали проведением бактериологического контроля криоконсервированных гемопоэтических клеток.

Бактериологический контроль криоконсервированных гемопоэтических клеток на отсутствие грампозитивной и грамнегативной флоры осуществляли согласно "Инструкции по контролю стерильности консервированной крови, ее компонентов, препаратов, консервированного костного мозга, кровезаменителей, консервирующих растворов и условий их заготовки", утвержденной МОЗ Украины в 1996 г.

С этой целью сателлит изымали из низкотемпературного банка и размораживали в водяной бане (плюс 40±0,5С) и осуществляли скрининг.

Качественные характеристики продуктов, полученных по известному способу, указаны в таблице 1 в конкретных примерах. Как видно из результатов, большинство образцов имеет контаминацию различными видами микрофлоры, что свидетельствует о нарушении стерильности при внесении кристаллов льда.

В примерах 9-64 в таблице 2а, 2б, 2с, 2д указано количество колоний и кластеров (на 10⁵ посаженных в культуру клеток) на 8-10 сутки. Примеры 9-64 характеризуются отсутствием грампозитивной и грамнегативной флоры в полученном продукте.

Как видно из полученных результатов, предложенный способ имеет лучшие результаты сохранности клеток.

Инициация кристаллообразования в этом способе осуществляется автоматически без дополнительного контакта с клеточной суспензией, что упрощает способ и улучшает условия стерильности среды.

Примененные в способе среды разрешены для внутривенного использования и потому клетки, полученные таким способом, можно использовать в большинстве случаев лечения.

Указанные режимы замораживания не травматичны для гемопоэтических клеток человека, потому что эмпирически подобранный режим снижения температуры не вызывает рост больших кристаллов, которые могут разрушить клеточную мембрану.

Благодаря тому, что способ предусматривает использование уменьшенной концентрации криопротектора, полученные описанным способом клетки можно использовать сразу после размораживания без отмывания от криопротектора, что упрощает способ и уменьшает негативное влияние дополнительных воздействий на клетки.

Указанные преимущества, как показывают примеры, обеспечивают увеличение периода хранения и увеличение количества жизнеспособных клеток после периода замораживания.