способ получения тест-системы для определения антигенов цитотоксинассоциированных белков helicobacter pylori в биологическом материале инфицированных лиц реакцией коагглютинации

Формула изобретения

1. Способ получения тест-системы для определения антигенов высокомолекулярных белков Helicobacter pylori в биологическом материале инфицированных лиц реакцией коагглютинации, включающий иммунизацию кроликов комплексом белков Helicobacter pylori с последующим забором крови, выделением сыворотки, сенсибилизацией получаемыми сыворотками клеток Staphylococcus aureus Cowan I, отмывкой, ресуспендированием и консервированием, отличающийся тем, что животных иммунизируют гомогенатом жидкостей куриных эмбрионов после заражения их культурой Helicobacter pylori (vас-А⁺, cag-А⁺) и гибели их через 1-2 суток.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию коагглютинации ставят на иммунологических планшетах с U-образным дном лунок, в 2 ряда которых вносят негретый исследуемый материал (копрофильтрат, слюна, сыворотка крови), разведенный четырехкратно до 1:4096, и затем в первый ряд вносят диагностикум, во второй – взвесь несенсибилизированного стафилококка (контроль), а реакцию учитывают по появлению равномерного агглюгината (“зонтика”) на дне лунки и считают положительной при превышении в четыре и более раз титра агглютинации в первом ряду по сравнению с титром агглютинации во втором.

Описание изобретения к патенту

Назначение: биотехнология. Может быть использован в области медицины для диагностики и мониторинга хеликобактерной инфекции, вызванной токсигенными штаммами, оценки эффективности антибактериальной терапии, а также в научных исследованиях патогенеза и иммуногенеза этой инфекции.

Сущность изобретения: получают сыворотки при иммунизации кроликов эмбриональной жидкостью куриных эмбрионов, зараженных токсигенной (VAC-A⁺, CAG-A⁺) культурой Helicobacter pylori (H.pylori) и погибших в течение 1-2 суток в результате размножения и летального действия этих бактерий. Сыворотками, содержащими преимущественно антитела к крупномолекулярным белкам с молекулярной массой 90-140 кДа и взятыми в подобранных оптимальных разведениях, сенсибилизируют обработанные формалином и нагреванием клетки стафилококка Cowan I.

Полученный антительный диагностикум используют при постановке реакции коагглютинации на иммунологических планшетах с U-образным дном с различными разведениями биологического материала (копрофильтрат, слюна, циркулирующие иммунные комплексы, сыворотка крови) - опытный ряд. Во втором ряду разведенного таким же образом биоматериала вместо диагностикума вносят несенсибилизированный стафилококк (контрольный ряд).

Результаты учитывают по разнице титров коагглютинации в опытном и контрольном рядах, 4-кратное и более различие титров в которых свидетельствует о положительной реакции на наличие комплекса крупномолекулярных протеинов, являющихся высокоспецифическим антигенным маркером для цитотоксинпродуцирующих штаммов Н.pylori.

Способ позволяет диагностировать и верифицировать инфекцию H.pylori в остром периоде заболевания, определять возможность возбудителя экспрессировать токсин в организме в динамике, оценивать эффективность эрадикационной терапии.

Постановка реакции коагглютинации на иммунологических планшетах делает ее высокочувствительной и информативной.

Известно, что H.pylori имеют несколько патогенетически значимых антигенов-белков, среди которых большое значение придается вакуолизирующему цитотоксину VAC-A с молекулярной массой (мМ) около 90 кДа и ассоциированному с ним высокоиммуногенному белку CAG-A с мМ 120-140 кДа, являющегося специфическим маркером островка патогенности (PAI), который содержит около 40 генов, контролирующих синтез патогенетически значимых белков этих бактерий.

Штаммы H.pylori, выделяемые от больных и здоровых лиц, обладают различной способностью экспрессировать VAC-A и CAG-A белки и делятся по этому признаку на 2 основных типа: I - (VAC⁺, CAG⁺), II - (VAC^-, CAG^-).

Для диагностики инфекции H.pylori важно не только определение факта инфицирования, наличия и количества в организме самих бактерий, но также выявление способности бактерий экспрессировать эти белки (VAC-A и CAG-A) в организме. Штаммы H.pylori I типа обладают повышенной вирулентностью и значительно чаще обнаруживаются при язвенной болезни и раке желудка.

Известны способы диагностики H.pylori инфекции, основанные на определении участков генома, ответственных за синтез VAC-A и CAG-A белков, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в штаммах. Материалом для исследования с помощью ПЦР теоретически могут служить также биоптаты слизистой оболочки желудка, желудочный сок, зубной налет, кал (1, 2). Однако использование ПЦР для исследования кала весьма затруднено вследствие наличия ингибирующих полисахаридных компонентов, требует предварительной сложной многоступенчатой обработки материала, что делает этот метод практически не приемлемым для использования в обычных диагностических лабораториях.

Известен способ диагностики H.pylori инфекции с помощью определения антител к VAC-A и CAG-A белкам в сыворотке крови пациентов методами ИФА и иммуноблота (3). Однако, как и другие серологические методы, эти методы не позволяют судить о текущей инфекции, так как антитела сохраняются в организме в течение длительного времени после клинически выраженной инфекции, по этой же причине метод не может быть использован для оценки эффективности эрадикационной терапии.

В настоящем изобретении была впервые использована реакция коагглютинации, позволяющая исследовать непосредственно в биологическом материале антигены патогенетически значимых высокомолекулярных белков H.pylori (более 90 кДа), в том числе, очевидно, вакуолизирующий токсин VAC-A и цитотоксинассоциированный CAG-A белок.

Известно, что патогенные микроорганизмы, выращенные на питательных средах, не проявляют полностью свои потенциальные возможности метаболизма (1).

Попадая в организм чувствительного хозяина (человека или животного), бактерии, чтобы противостоять защитным силам организма, перестраивают свой метаболизм. При этом микроорганизмы могут приобретать способность образовывать капсулу, экспрессировать токсины, изменять антигенные и иммуногенные свойства.

Helicobacter pylori, геном которого детально изучен, отличается особенно выраженной нестабильностью. При его трудной культивируемости на искусственных питательных средах мы предположили, что в чувствительном организме продукция патогенетически значимых антигенов и в особенности токсинов может быть значительно более выраженной и полной. Это относится не только к известным, но, возможно, и не известным еще патогенетически и иммунологически важным антигенам и токсинам. Имеет значение при этом и количественные соотношения антигенов, образующихся в ходе инфекции H.pylori.

Ранее нами было установлено, что 9-дневные куриные эмбрионы являются чувствительной моделью для размножения H.pylori (4).

Основываясь на положении, что в чувствительном организме, в отличие от роста патогенных микроорганизмов на питательных средах, экспрессия патогенетически значимых антигенов и токсинов проявляется в наибольшей степени, а куриные эмбрионы являются чувствительной моделью размножения и летального действия H.pylori, в качестве материала для получения антитоксической сыворотки был использован гомогенат жидкостей и тканей куриных эмбрионов, зараженных VAC-A⁺, CAG-A⁺ штаммом H.pylori NCTC 11637.

Полученная после гипериммунизации кроликов сыворотка содержала антитела к комплексу патогенетически значимых антигенов и токсинов H.pylori, преимущественно к высокомолекулярным белкам с мМ от 90 до 120-140 кДа, к которым относятся VAC-A и CAG-A белки. Последний, как известно, обладает особенно выраженной иммуногенностью.

Сконструированный на основе этих сывороток и стабилизированного формалином и нагреванием стафилококка штамма Cowan I диагностикум, обозначенный нами "Нр-tox-диагностикум", при постановке реакции коагглютинации на планшете позволяет выявлять наличие антигенов крупномолекулярных белков H.pylori (в том числе, очевидно, VAC-A и CAG-A белков) в биологическом материале (кал, слюна, сыворотка крови, ЦИК) у инфицированных людей.

Хеликобактерный tox-диагностикум для РКА разработан впервые. Он позволяет выявлять комплекс наиболее важных патогенетически значимых антигенов и токсинов у H.pylori инфицированных людей в период обострения болезни и размножения бактерий в организме, верифицировать таким образом факт участия H.pylori в инфекционном процессе, а также оценивать эффективность лечения. Способ определения высокомолекулярных белков H.pylori непосредственно в биологическом материале прост, неинвазивен, безопасен (поэтому может быть использован у детей и пожилых людей), непродолжителен во времени (18-24 часа), экономичен. Метод может применяться в научных исследованиях, изучении патогенеза и иммунитета.

Целью настоящей работы является разработка способа получения тест-системы для определения патогенетически значимых белковых антигенов H.pylori с высокой молекулярной массой, в том числе вакуолизирующего токсина VAC-A и ассоциированного с ним белка CAG-A, непосредственно в биологическом материале (кал, слюна, сыворотка крови) у H.pylori инфицированных людей.

Техническим результатом, достигаемым при использовании разработанного способа, является получение диагностикума для выявления в реакции коагглютинации (РКА) высокомолекулярных белков мМ 90-120-140 кДа, в том числе, вероятно, VAC-A и цитотоксинассоциированного белка CAG-А, в копрофильтрате, слюне, сыворотке крови, что позволяет не только диагностировать инфицированность H.pylori (VAC-A и CAG-A белки являются маркерами H.pylori), но и определять возможность их экспрессии в организме. Кроме того, выявление токсинов H.pylori в составе циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке больных язвенной болезнью дополнительно свидетельствует об образовании специфических антител к этим белкам.

Способ определения высокомолекулярных белков H.pylori не требует проведения эндоскопии, осуществляется in vitro путем постановки реакции коагглютинации на иммунологических планшетах, прост в постановке, ускоряет проведение анализа, экономичен. Он достигается тем, что используют штамм H.pylori I группы VAC-A⁺, CAG-A⁺ (например, H.pylori NCTC 11637). В качестве материала для иммунизации кроликов используют эмбриональную жидкость 9-дневных куриных эмбрионов, зараженных внутрижелточно агаровой культурой H.pylori и погибших через 1-2 суток после их размножения. Эмбриональную жидкость обрабатывают 0,11% глютаральдегидом и полученным "токсоидом" иммунизируют кроликов. Кровь берут после третьего цикла (8 инъекций) гипериммунизации.

На основе полученной сыворотки готовят коагглютинирующий диагностякум; реакцию ставят на иммунологических планшетах с U-образным дном лунок в двух рядах с различными разведениями исследуемого материала от 1:4 до 1:4096 и выше (при анализе сыворотки).

В первый (опытный) ряд вносят диагностикум, во второй ряд (контрольный) - взвесь несенсибилизированного стафилококка и результат учитывают по появлению "зонтика" на дне лунки и разнице титров коагглютинации в I и II рядах. Положительной на наличие цитотоксинассоциированных белков H.pylori считается разница титров в 4 и более раз в опытном и контрольном рядах.

Тест-система представляет собой комплект, включающий две емкости: 1 заполнена специфическим H.pylori "tox-диагностикумом"; 2 - не сенсибилизированным стафилококком Cowan I.

Способ получения диагностикума для выявления высокомолекулярных белков, в том числе токсинов, в биологических жидкостях и его возможное использование представлены в примерах.

Пример 1. Приготовление полного комплекса патогенетически значимых антигенов и токсинов Helicobacter pylori.

Куриные эмбрионы 9-дневного возраста заражают внутрь желточного мешка культурой штамма Н.pylori NCTC №11637, выращенной на Columbia agar с добавлением 5% лошадиной крови. Смыв 3-5 суточной культуры вводят в количестве 30 млн м.т. в эмбрионы, которые инкубируют во влажной камере при 37С в течение двух суток.

Лизированный эмбрион с желточной жидкостью и белком гомогенизируют, освобождают от крупных частиц центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30 мин, разливают в стерильные ампулы и хранят при -20С.

Этот препарат - эмбриональный гомогенат (ЭГ) содержит полный комплекс белковых антигенов и токсинов H.pylori при размножении бактерий в развивающихся эмбрионах, представляющих для него, по-видимому, оптимальные условия для жизнедеятельности (богатый набор питательных веществ, наличие эритроцитов и, следовательно, гемина, достаточные микроаэрофильные и температурные условия).

Методом электрофореза в полиакриламидном геле нами установлено, что в составе эмбрионального гомогената содержится не менее 14-16 белковых антигенов, различающихся по величине молекулярной массы (мМ) и выраженности (интенсивности) образуемых ими линий (фиг.1).

Все электрофоретическое поле проявленных антигенов было условно разделено на три зоны: I - зона высокомолекулярных белков с мМ 90 и более кДа; II - зона среднемолекулярных белков с мМ 67-43 кДа; III - зона низкомолекулярных белков с мМ 33-14 кДа. В I зоне обнаружены 3 мажорных белка (возможно CAG-A с мМ 120-140 кДа и VAC-A с мМ около 90 кДа), во II зоне выявлено несколько минорных белков, среди которых могут находиться белки жгутиков (мМ 57 кДа) и Ure А, и в III - низкомолекулярные белки, среди которых определяется мажорный белок, возможно Ure В, мМ которого около 30 кДа.

В лиофилизированной культуре H.pylori 11637 нами обнаружено около 7 белков: один - в первой зоне; 2-3 - во второй зоне и 3-6 - в третьей зоне электрофореграммы.

Во второй зоне определялся также белок (альбумин) сыворотки новорожденных телят, использовавшийся при лиофильной сушке штамма.

В эмбриональном гомогенате специфический липополисахарид (ЛПС -O-антиген) H.pylori методом иммуноэлектрофореза и преципитации в геле с сыворотками против гретой культуры H.pylori (O-антисыворотка) не выявлялся; в реакции коагглютинации на стекле с диагностикумом, приготовленным на основе этой сыворотки, обнаруживался в разведении 1:42-1:84.

Таким образом, эмбриональный гомогенат куриных эмбрионов, зараженных культурой H.pylori 11637, после размножения бактерий и гибели эмбрионов содержал в основном комплекс патогенетически значимых мажорных компонентов крупномолекулярных белков с мМ более 90 кДа, в том числе, очевидно, токсин VAC-A и CAG-A белок.

Экстракт жидкостей незараженных эмбрионов и куриных яиц эти крупномолекулярные белки не содержали.

Пример 2. Получение сыворотки против полного комплекса антигенов и токсинов Helicobacter pylori.

Для иммунизации кроликов использовали эмбриональную жидкость (гомогенат) зараженных и погибших эмбрионов, обработанную 0,11% глютаральдегидом.

Эмбриональный гомогенат (токсоид) в количестве 0,5 мл, смешанный с 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда, вводили кроликам внутрикожно в несколько точек спины двукратно с интервалом в две недели, затем через две недели - 0,5 мл токсоида подкожно, через неделю - 1,0 мл токсоида внутривенно. Второй и третий циклы иммунизации состояли из двукратных внутривенных введений токсоида по 1,0 мл. Кровь брали через 7-10 суток после каждого цикла иммунизации.

Исследование сывороток против эмбрионального гомогената методом преципитации в агаре, иммуноэлектрофореза в агаре, электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблота показало, что полученные сыворотки содержали антитела преимущественно против крупномолекулярных белков H.pylori с мМ более 90 кДа, имели небольшое количество антител к белкам среднемолекулярным и практически не содержали антител к низкомолекулярным белкам и O-антигену H.pylori. (фиг.2). Последнее согласуется с литературными данными о слабой иммуногенности O-антигена. Не были обнаружены также антитела к антигенам человека I(0) группы крови.

Таким образом, полученная нами сыворотка содержала в своем составе преимущественно антитела к крупномолекулярным белкам с мМ 90 и более кДа, в том числе, очевидно к VAC-A и CAG-A белкам.

Напротив, сыворотки против прогретых культур H.pylori содержали только антитела к термостабильному O-антигену и практически не имели антител к белковым антигенам.

Пример 3. Конструирование Helicobacter pylori tox-диагностикума и постановка реакции коагглютинации (РКА) на планшете.

Подбор разведении сывороток для РКА на планшете проводят следующим образом.

На основе 5% взвеси формалинизированных (0,5% формальдегида, 37С, 3 часа) и прогретых (80С, 1 час) стафилококков и сывороток против эмбрионального гомогената, взятого в разных разведениях (1:5, 1:10, 1:15, 1:20 и т.д.), готовят пробные диагностикумы из расчета:

0,1 мл сыворотки в разных разведениях;

0,9 мл 5% взвеси стабилизированных стафилококков;

9,0 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ), рН 7,2.

Взвесь осторожно перемешивают в течение нескольких минут и проверяют полученные диагностикумы в РКА на планшетах.

Для этого в каждый ряд лунок с U-образным дном иммунологического планшета вносят по 0,075 мл ФСБ. Тест-антиген (негретый эмбриональный гомогенат) закапывают в первые 5 вертикальных лунок по 0,025 мл и затем в каждом ряду титруют последовательно четырехкратно, перенося в следующие лунки по 0,025 мл из предыдущего разведения. Из каждой седьмой лунки горизонтального ряда 0,025 мл жидкости выбрасывают. Каждая восьмая лунка с ФСБ остается контрольной (1-й контроль). После титрования тест антигена во все лунки первого ряда добавляют tox-диагностикум, изготовленный на основе сыворотки в разведении 1:500, в лунки второго ряда - диагностикум с разведением сыворотки 1:1000, в лунки третьего ряда - диагностикум с разведением сыворотки 1:1500, в четвертый ряд - диагностикум с разведением сыворотки 1:2000 и т.д. В последний ряд вместо диагностикума добавляют по 0,025 мл 5% взвеси несенсибилизированного стафилококка (2-й контроль).

Планшеты встряхивают осторожным постукиванием по краю планшета в разных направлениях и оставляют в термостате во влажной камере (в целлофановых пакетах) при 37С на 2 часа, после чего переносят в условия комнатной температуры до утра. Учет реакции проводят через 1-2 суток по появлению равномерного агглютината - “зонтика” на дне лунки, в наклонном положение планшета, не стекающего к нижнему краю лунки (фиг.3).

За оптимальное разведение сыворотки при получении диагностикума для РКА на планшете принимается то разведение, которое дает максимальный титр с тест антигеном и не дает реакции в двух контрольных лунках (1 - контроль диагностикума с ФСБ, 2 - контроль тест антигена со взвесью несенсибилизированного стафилококка).

Из фиг.3 видно, что оптимальным разведением сыворотки для получения диагностикума является 1:2000. Этот диагностикум выявляет в исследуемом материале крупномолекулярные белки H.pylori в титре 1:64.

Пример 4. Изготовление диагностикумов для определения высокомолекулярных белков Helicobacter pylori в реакции коагглютинации на планшете (конечный этап).

Готовые диагностикумы в необходимом количестве получают на основе сывороток, отобранных при исследовании пробных диагностикумов, используя оптимальные разведения сывороток.

Технология получения описана в примере 3. Коротко она заключается в следующем.

Если при испытании пробных диагностикумов оптимальным конечным разведением сыворотки, например, является 1:2000, то исходную сыворотку разводят 1:20, берут ее в количестве 0,1 мл, смешивают с 0,9 мл 5% взвеси стабилизированного формалином (0,5% формалин, 3 часа) и нагреванием (80С, 1 час) стафилококка Cowan I, разводят 9 мл ФСБ (рН 7,2). При необходимости большего количества диагностикума эти объемы увеличивают в нужное число раз.

Чувствительность диагностикума исследуют, используя исходный эмбриональный лизат в различных разведениях (табл.1).

Специфичность Нр-диагностикума была испытана с биологическим материалом (слюна, кал) больных с хроническим гастритом и язвой двенадцатиперстной кишки в период обострения и ремиссии.

При клинически выраженном заболевании в кале и/или слюне этих больных при положительной реакции коагглютинации на стекле на O-антиген H.pylori в этих же пробах выявлялась положительная РКА на планшетах с tox-диагностикумом. В период ремиссии H.pylori в РКА на стекле не определялся. При отсутствии размножения H.pylori РКА с tox-диагностикумом отсутствовала.

Были исследованы также пробы кала от больных шигеллезом, сальмонеллезом, иерсиниозом, кампилобактериозом, диагноз которых был поставлен на основе клинических данных и положительной РКА на термостабильный O-антиген соответствующих возбудителей.

В желточной жидкости некоторых куриных яиц обнаруживался O-антиген H.pylori. Однако в желтке этих яиц реакция на токсин была отрицательной. Это, вероятно, можно объяснить отсутствием условий для размножения этих бактерий и экспрессии токсинов.

Представленные в табл.2 данные свидетельствуют о специфичности Нр-tox-диагностикума.

Как видно из табл.1, Hp-tox-диагностикум, приготовленный на основе aнти-tox-кроличьей сыворотки, взятой в разведении 1:2000, дает положительную РКА на планшетах с tox-антигеном до разведения 1:800, что свидетельствует о его достаточно высокой чувствительности.

Пример 5. Использование tox-диагностикума при обострении не язвенной диспепсии, ассоциированной с Helicobacter pylori.

Проведены систематические продолжительные проспективные исследования у двух больных: с неязвенной диспепсией и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, подтвержденных обнаружением O-антигена, являющегося маркером Н.р., в реакции коагглютинации на стекле. Первый больной наблюдался в течение 1,5 лет. Было исследовано за этот период 200 проб слюны и 274 пробы кала.

Установлено, что в период обострения наблюдался высокий подъем титров высокомолекулярных белков (ВМБ) H.pylori, в период реконвалесценции уровень ВМБ H.pylori снижался и практически не выявлялся в период ремиссии (фиг.4).

У второго больного, оперированного по поводу язвы желудка 35 лет назад и страдающего периодическими обострениями неязвенного гастрита, было исследовано в течение 1,5 лет 73 пробы слюны и 42 пробы кала. Повышенный уровень ВМБ H.pylori отмечался в период обострения и снижался в период ремиссии (фиг.5).

Пример 6. Использование tox-диагностикума для выявления высокомолекулярных белков Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью 12-перстной кишки до и после лечения.

Были исследованы больные с язвенной болезнью 12-перстной кишки (ЯБДК) в период обострения: до лечения, в период лечения и в различные сроки после него (фиг.6, 7, 8).

Показано, что в период обострения (до лечения) у всех больных отмечался высокий уровень ВМБ H.pylori в слюне и кале, который коррелировал с размножением возбудителя, о чем свидетельствует положительная РКА на стекле на O-антиген H.pylori.

В период лечения и в ближайшие 1,5 месяца после него уровень ВМБ H.pylori постепенно снижался, однако сохранялся еще на достаточно высоком уровне. И лишь в отдаленные сроки 1-2 года после лечения при успешной эрадикационной терапии уровень ВМБ H.pylori снижался до низких или отрицательных показателей. При неэффективной терапии продолжал оставаться на высоком уровне.

Таким образом, РКА с tox-диагностикумом для выявления ВМБ хеликобактеров позволяет выявлять подъем этих патогенетически значимых антигенов в период обострения ЯБДК, верифицировать инфицированность и способность штамма H.pylori экспрессировать ВМБ H.pylori, в том числе, вероятно, VAC-A и CAG-A белки, дает возможность оценивать эффективность эрадикационной терапии.

Литература

1. Кишкун А.А. Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции Helicobacter pylori. - Лабораторная медицина, 2000, №3, с. 37-44.

2. Makristathis A., Paschiuq E., Schutze К. et al. Detection of Helicobacter pylori in stool specimens by PCR and antigen enzyme immunoassay. - J. Cl. Microb., 1998, v. 36, №9, р. 2772-74.

3. Salama S.M., Wefuan J.N., Shiro-Koulla S. et al. Value of whole-cell antigen extracts for serological detection of Helicobacter pylori. - J. Cl. Microb., 1993, v.31, №12, p. 3331-3332.

4. Белая Ю.А., Белая О.Ф. Реакция коагглютинации. Сигнальный метод диагностики кишечных зооантропонозов, контроля продуктов питания, кормов, объектов окружающей среды. - М., 2001, 50 с.