способ определения псоралена

Формула изобретения

Способ определения псоралена, включающий обработку анализируемой пробы химическими реагентами с последующим измерением физико-химических параметров полученной смеси, отличающийся тем, что пробу растворяют в диметилформамиде, обработку проводят растворами сульфата железа (II) и перекиси водорода в среде фосфатного буфера с последующим измерением максимума интенсивности хемилюминесценции полученой смеси.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к способам качественного и количественного определения лекарственного вещества псоралена, применяющимся в химических, биологических, фармацевтических и фармакокинетических лабораториях для контроля качества препаратов на основе псоралена, растительного сырья, его содержащего, для разработки индивидуальных и оптимальных схем назначения этих препаратов конкретным пациентам, нуждающимся в PUVA-терапии.

Известен способ количественного определения псоралена, включающий обработку анализируемой пробы химическим реагентом с последующим измерением физико-химических параметров полученной смеси (“Фармацевтичнiй журнал”, 1975 г., №4, с.45-47).

Недостатки способа состоят в его низкой избирательности, т. к. аналогичным образом реагируют фенолы, флавоноиды, оксикоричные кислоты и другие природные соединения, невысокой точности (относительная ошибка составляет 4%). Чувствительность способа, позволяющего определить псорален, составляет 20 мкг/мл.

Наиболее близким к предлагаемому способу является “Способ определения псоралена”, включающий обработку анализируемой пробы химическим реагентом с последующим измерением физико-химических параметров полученной смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и селективности способа, анализируемую пробу обрабатывают водно-спиртовыми растворами брома и гидроокиси аммония, с последующим измерением флуоресценции полученной смеси (А.А. Хабаров, О.А. Григорьев, В.П. Георгиевский, Г.А. Дрозд, Л.П. Хабарова. Авторское свидетельство SU №1049809, G 01 № 33/48; G 01 № 21/78. Приоритет изобретения 06.08.81, зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 22.06.83, опубликовано 23.10.83 в Бюл. №39).

Существующий способ определения псоралена имеет следующие недостатки. Имеет узкий диапазон измеряемых концентраций псоралена в объеме анализируемой пробы, что связано с тем, что прямолинейная зависимость между интенсивностью флуоресценции и концентрацией псоралена лежит в сравнительно невысоком интервале его концентраций - от 0,01 до 10 мкг/мл. Это требует многочисленных разбавлений при исследовании лекарственных форм псоралена - таблеток по 0,01 г и 0,1% спиртового раствора. Необходимо проводить измерения интенсивности флуоресценции псоралена при двух светофильтрах (первичном и вторичном) с определенным значением пропускаемых длин волн. В качестве растворителя для определения псоралена использован этиловый спирт в определенном соотношении с дистиллированной водой, в то время как псорален трудно растворим в этаноле и мало растворим в воде. Это не позволяет проводить определения псоралена при высоких его концентрациях.

Задачей изобретения является расширение диапазона измеряемых концентраций псоралена в различных объектах исследования, подбор более эффективного растворителя для определения псоралена, замена флуоресцентного метода детектирования при определении псоралена другим физико-химическим методом, позволяющим устранить недостатки известного способа.

Задача достигается путем использования псоралена в роли активатора (индуктора) хемилюминесценции, по максимуму интенсивности которой определяют содержание его в различных объектах.

Способ осуществляется следующим образом.

В кювету для измерения хемилюминесценции последовательно добавляют 0,4 мл раствора сульфата железа (II) с концентрацией 0,01 ммоль/л, 0,2 мл фосфатного буфера, 0,2 мл раствора в диметилформамиде пробы, содержащей псорален и 0,2 мл 2% раствора перекиси водорода. Определяют максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (число импульсов) и время (в секундах), в котором регистрировалось это значение на биохемилюминометре. Параллельно проводят определение в контрольном опыте. Рассчитывают значение максимума интенсивности хемилюминесценции псоралена за вычетом результатов контрольного опыта. (Для контрольного опыта осуществляет такую же последовательность операций, но добавляемый раствор пробы с псораленом заменяют таким же объемом диметилформамида). Содержание псоралена в пробе рассчитывают по калибровочному графику.

- Для качественного определения псоралена - о наличии в пробе псоралена свидетельствует увеличение максимума интенсивности хемилюминесценции.

- Для количественного определения псоралена в различных объектах -содержание псоралена в аналитической пробе определяют по калибровочному графику.

Пример №1. Проведение анализа псоралена на биохемилюминометре марки БХЛ-06.

В кювету для измерения хемилюминесценции последовательно добавляют 0,4 мл раствора сульфата железа (II) с концентрацией 0,01 ммоль/л, 0,2 мл фосфатного буфера, 0,2 мл раствора в диметилформамиде пробы, содержащей псорален, и 0,2 мл 2% раствора перекиси водорода. Определяют максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (число импульсов) и время (в секундах), в котором регистрировалось это значение на биохемилюминометре. Параллельно проводят определение в контрольном опыте. Рассчитывают значение максимума интенсивности хемилюминесценции псоралена за вычетом результатов контрольного опыта. (Для контрольного опыта осуществляют такую же последовательность операций, но добавляемый раствор пробы с псораленом заменяют таким же объемом диметилформамида). Содержание псоралена в пробе определяют по калибровочному графику.

- Подготовка биохемилюминометра марки БХЛ-06 к определению псоралена:

подключают биохемилюминометр БХЛ-06 к электрической сети и прогревают его в течение 15-30 мин. Клавишу “КАЛИБР” кюветного блока устанавливают в положение “ВЫКЛ”, таким же образом отключают термостатирование и перемешивание. Переключатель “СЧЕТ.АНАЛ.” кюветного блока переключают в положение “СЧЕТ”. Задают на измерительном блоке команду периода измерения шума нажатием клавиш ПЕ1=30 и периода измерения сигнала ПЕ2=30. Затем просчитывают несколько раз уровень шума путем включения режима измерения клавишами РЕ1=. Если разброс значений шума не составляет более 100 импульсов, начинают работу. Если разброс значений больше 100 импульсов, подключают систему водяного охлаждения фотоэлектронного умножителя.

Нами работа проводилась при комнатной температуре, без термостатирования кюветы и фотоэлектронного умножителя.

Пример №2. Определение псоралена в таблетках по 0,01 г.

Точную навеску мелкоизмельченных таблеток, соответствующую среднему весу одной таблетки (около 0,05 г), помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и прибавляют 15-20 мл диметилформамида, встряхивают 3-5 мин и доводят объем диметилформамидом до метки. 0,2 мл полученного раствора используют в качестве пробы и проводят анализ, как указано в примере №1. Содержание псоралена определяют по калибровочному графику в диапазоне концентраций от 10 до 100 мкг/мл и пересчитывают на 1 таблетку.

Пример №3. Определение псоралена в 0,1% растворе препарата.

В пробирку помещают 1 мл 0,1% раствора препарата и добавляют 1 мл диметилформамида. 0,2 мл полученного раствора используют в качестве пробы, анализ которой проводят аналогично примеру №1. Содержание псоралена определяют по калибровочному графику в диапазоне концентраций от 10 до 100 мкг/мл и пересчитывают на лекарственную форму.

Пример №4. Определение псоралена в растительном сырье (плодах псоралеи костянковой).

2,0 г мелкоизмельченных плодов псоралеи костянковой экстрагируют 100 мл смеси этилового спирта и хлороформа, взятых в соотношении 3:7. 0,1 мл наносят на хроматографическую пластину “Silufol”, высушивают пластину на воздухе в течение 10 минут и хроматографируют восходящим методом в системе растворителей, состоящей из диэтилового эфира, петролейного эфира и этилацетата (9:9:1). После высушивания на воздухе хроматограммы в течение 5 мин, в ультрафиолетовом свете устанавливают локализацию зоны псоралена с Rf=0,56, отмеченную по стандарту псоралена, количественно переносят в пробирку и элюируют анализируемое вещество 1 мл диметилформамида 2-3 мин. 0,2 мл полученного элюата используют в качестве пробы, анализ которой проводят аналогично примеру №1. Содержание псоралена определяют по калибровочному графику в диапазоне концентраций от 10 до 100 мкг/мл и пересчитывают на 1 г лекарственного растительного сырья - плодов псоралеи костянковой.

Пример №5. Определение псоралена в крови.

Пробу крови (5-10 мл), полученную от пациента, помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин. К 1 мл полученной сыворотки прибавляют 1 мл диметилформамида. 0,2 мл полученного раствора используют в качестве пробы, анализ которой проводят аналогично примеру №1. Для контрольного опыта пробу крови (5-10 мл), полученную от того же пациента, но до начала приема препаратов псоралена, помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин. К 1 мл полученной сыворотки прибавляют 1 мл диметилформамида. 0,2 мл полученного раствора используют для контрольного опыта, который проводят аналогично. Содержание псоралена определяют по калибровочному графику в диапазоне концентраций от 0,1 до 1 мкг/мл и пересчитывают на 1 мл крови.

Пример №6. Определение псоралена в моче.

К 1 мл мочи, полученной от пациента, добавляют 1 мл диметилформамида. 0,2 мл полученного раствора используют в качестве пробы, анализ которой проводят аналогично примеру №1. Для контрольного опыта к 1 мл мочи, полученной от того же пациента, но до начала приема препаратов псоралена, прибавляют 1 мл диметилформамида. 0,2 мл полученного раствора используют для контрольного опыта, который проводят аналогично. Содержание псоралена определяют по калибровочному графику в диапазоне концентраций от 1 до 10 мкг/мл и пересчитывают на 1 мл мочи.

Таким образом, по сравнению с прототипом хемилюминесцентный способ определения псоралена позволяет:

- расширить диапазон измеряемых концентраций псоралена в объеме анализируемой пробы (во флуоресцентном способе он составляет от 0,01 до 10 мкг/мл, при хемилюминесцентном способе от 0,01 до 400 мкг/мл);

- не использовать светофильтры (во флуоресцентном способе необходимо проводить измерения интенсивности флуоресценции псоралена при двух светофильтрах, первичном и вторичном, с определенным значением пропускаемых длин волн, в хемилюминесцентном способе - светофильтры вообще не предусмотрены);

- заменить используемый в анализе растворитель на более эффективный (во флуоресцентном способе в качестве растворителя для определения псоралена применена смесь этилового спирта с дистиллированной водой в определенном соотношении, в то время как псорален трудно растворим в этаноле и мало растворим в воде, а в среде других растворителей флуоресценция не возникает или минимальна, в хемилюминесцентном способе - диметилформамид, обладающий высокой растворяющей способностью).