рекомбинантная плазмидная днк ptrcte-oph и продуцент фермента органофосфатгидролазы
Классы МПК: | C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала C12N15/52 гены, кодирующие ферменты или проферменты C12N15/70 векторы или системы экспрессий, специально приспособленные для Ecoli |
Автор(ы): | Варфоломеев С.Д. (RU), Ефременко Е.Н. (RU), Алиев Т.К. (RU), Вотчицева Ю.А. (RU) |
Патентообладатель(и): | Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2002-11-26 публикация патента:
20.07.2004 |
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Оно представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую ДНК процессированной формы фермента органофосфатгидролазы (ОРН), trc-промотор Escherichia coli и синтетический участок - усилитель трансляции, обуславливающие биосинтез фермента ОРН, а также штамм Escherichia coli - продуцент этого белка. Рекомбинантный фермент может быть использован для производства препаратов на основе ОРН, предназначенных для деградации фосфорорганических соединений, а также для их аналитического определения. Изобретение решает задачу создания генно-инженерной конструкции и штамма клеток, которые обеспечивают получение значительных количеств активной растворимой формы органофосфатгидролазы в цитоплазме клеток путем индуцибельного синтеза фермента. Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pTrcTE-OPH, кодирующей индуцибельный синтез ОРН и штамма Escherichia coli DH5/pTrcTE-OPH, обеспечивающего синтез этого белка с уровнем экспрессии, позволяющим получать до 12 мг очищенного белка из 1 г влажной биомассы. Индуцибельный высокий уровень синтеза целевого полипептида обеспечивается тем, что предлагаемая плазмида pTrcTE-OPH отличается от известной наличием trc-промотора Е.coli и синтетического усилителя трансляции гена 10 бактериофага Т7. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 4 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4
Формула изобретения
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рТrcTE-ОРН, кодирующая полипептид со свойствами органофосфатгидролазы с молекулярной массой 3,46 Мd (5,243 т.п.о.), включающая Сla I/Hind III-фрагмент ДНК плазмиды рТrcTEGF длиной 4,232 т.п.о., trc - промотор Е.coli, синтетический усилитель трансляции TREN гена 10 бактериофага Т7, ген bla -лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой рТrcTE-ОРН клеток к ампициллину, участок ori инициации репликации, ДНК длиной 1,011 т.п.о., кодирующую аминокислотную последовательность зрелой формы органофосфатгидролазы, представленную на фиг.3, фланкированную сайтами рестрикции Сla I и Hind III, и содержащая уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: Neo I - 265, Есо RI - 270, Kрn I - 286, Хba I - 340, Сla I - 377, Hind III-1389.2. Штамм бактерии Escherichia coli DH5/рТrcTE-ОРН №25 (Центральная коллекция микроорганизмов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина - Ю.А.Овчинникова РАН) - продуцент полипептида со свойствами органофосфатгидролазы.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую ДНК процессированной формы фермента органофосфатгидролазы, trc-промотор Escherichia coli и синтетический участок - усилитель трансляции, обуславливающие биосинтез фермента органофосфатгидролазы, а также штамм Escherichia coli - продуцент этого белка.Органофосфатгидролаза (ОРН) (арилдиалкилфосфатаза, параоксоназа, фосфотриэстераза, ЕС 3.1.8.1) - фермент, катализирующий гидролиз эфирной связи в триэфирах фосфорной кислоты - является металлзависимым ферментом и содержит по два иона Zn2+ или Со2+ на субъединицу. Фермент в разной степени способен катализировать гидролиз Р-O, P-F и P-S связей в триэфирах фосфорной кислоты [Ефременко Е.Н., Сергеева B.C. Органофосфатгидролаза - фермент, катализирующий деградацию фосфорсодержащих отравляющих веществ и пестицидов // Известия АН. Сер. Хим., №10, с.1743-1749 (2001)]. Показано, что органофосфатгидролаза не содержит гликозидных остатков [Munnecke D.M. Enzymic detoxification of waste organophosphate pesticides // J. Agric. Food Chem., V.28, p.105-111 (1980)].Биологическая роль фермента заключается в деградации фосфорорганических нейротоксинов, таких как параоксон, паратион, кумафос, малатион и т.д.Рекомбинантная органофосфатгидролаза находит широкое применение в лабораторных исследованиях. На основе этого фермента изготовляются различные биосенсоры, а также изучаются возможности оптимизации условий гидролиза фосфорорганических соединений [Mulchandani P., Chen W., Mulchandani A. Flow injection amperometric enzyme biosensor for direct determination of organophosphate nerve agents // Environ. Sci. Technol., V.35, p.2562-2565 (2001); Simonian A.L., Efremenko E.N., Wild J.R. Discriminative detection of neurotoxins in multi-component samples // Anal. Chemica Acta, V.444, p.179-186 (2001)].Ген ОРН первоначально был выделен из обитающих в загрязненных пестицидами почвах бактериальных клеток Pseudomonas diminuta и Flavobacterium sp. [Munnecke D.M. Enzymic detoxification of waste organophosphate pesticides // J. Agric. Food Chem., V.28, p.105-111 (1980); Mulbry W.W., Karns J.S., Kearney P.C., Nelson J.O, McDaniel C.S., Wild J.R. Identification of a plasmid-borne parathion hydrolase gene from Flavobacterium sp. by southern hybridization with opd from Pseudomonas diminuta // Appl. Environ Microbiol, V.51, p.926-930 (1986); Dave K.I., Miller L.L., Wild J.R. Characterization of organophosphorus hydrolases and the genetic manipulation of the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta // Chem. - Biol. Interact., V.87, p.55-68 (1993)].Природные штаммы, обладающие органофосфатгидролазной активностью, не могут быть рассмотрены в качестве продуцентов данного фермента ввиду крайне низких уровней его синтеза в клетках (0,0085 мг белка из 1 г клеток).Была предпринята попытка создания продуцента ОРН на основе культуры тканей личинок насекомых (клетки sf9, Spodoptera frugiperda), которые были инфицированы рекомбинантным бакуловирусом А5В, несущим ген ОРН [Dumas D.P., Caldwell S.R., Wild J.R., Raushel E.M. Purification and properties of the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta // J. Biol. Chem., V.264, p.19659-19665 (1989)]. Для накопления фермента внутри клеток их культивирование проводили в течение 4 суток при конечном накоплении 5-6 г/л клеточной биомассы. Последующее выделение ОРН позволило получить авторам этого продуцента 2,7 мг белка из 8 г клеток, что означает получение 0,34 мг белка из 1 г клеток.Низкий выход фермента, длительная процедура накопления биомассы, многостадийность процесса очистки белкового препарата, включающая 4 стадии различных типов хроматографии, свидетельствуют об очевидной невозможности технологической реализации процесса получения ОРН с использованием указанного продуцента.Известны попытки конструирования эффективных генно-инженерных продуцентов ОРН на основе клеток микроорганизмов.Ген ОРН был клонирован из Flavobacterium sp.(ATTC 27551) в клетках Streptomyces lividans, фермент был очищен до гомогенного состояния. Авторы разрабатывали способы увеличения выхода внеклеточной ОРН из рекомбинантных клеток Streptomyces lividans. Для этого использовались богатые питательные среды, содержащие 85 г/л триптона и 60 г/л глюкозы, с подпиткой культуры во время ее ферментации (по 0,57 л раствора, содержащего 133 г/л глюкозы и 167 г/л триптона) [Payne G.F., DelaCruz N., Copella S.J. Improved production of geterologous protein from Streptomyces lividans // Appl. Microbiol. Biotechnol., V.33, p.395-400 (1990)]. Для обеспечения эффективной секреции ОРН из клеток Streptomyces lividans была создана генетическая конструкция, в которой нативную сигнальную последовательность -галактозидазы из Streptomyces заменили на сигнальную последовательность из Flavobacterium. Это привело к увеличению содержания ОРН во внеклеточной культуральной жидкости до 25 мг/л при наличие в среде 10 г/л клеток, что означает, что выход фермента составлял 2,5 мг внеклеточного белка из 1 г клеток.При этом секретируемый фермент составлял 2% от всех секретируемых в среду клеточных белков, что приводило к серьезным технологическим трудностям и увеличению числа стадий при его выделении. Дополнительные сложности в процесс очистки внеклеточного фермента вносила богатая по своему белковому составу питательная среда. Секретируемый белок содержал дополнительную сигнальную последовательность, удаление которой требовало проведения дополнительной стадии обработки белка.Для создания продуцента рекомбинантной ОРН в ряде работ были использованы клетки E.coli.Для создания генно-инженерного штамма, обладающего ОРН активностью, клетки E.coli трансформировали плазмидой рJK33, содержащей ген ОРН [Omburo G.A., Kuo J.M., Mullins L.S., Raushel F.M. Characterization of the zinc binding site of bacterial phosphotriesterase // J. Biol. Chem., V.267, p.13278-13283 (1992)]. Использованная плазмида обеспечивала внутриклеточный синтез модифицированного белка ОРН, в котором первые 33 были заменены на 5 следущих аминокислот: Met-Ile-Thr-Asn-Ser-. Синтезируемый фермент накапливался в растворимом виде в клетках, при этом его выход после очистки и выделения в гомогенном состоянии составил 298 мг из 160 г клеток, что означает, что удельный выход был 1,87 мг белка из 1 г клеток.Для накопления необходимого количества биомассы требовалось длительное культивирование клеток (38 часов), а для индукции синтеза фермента необходимо было применение высокой концентрации дорогостоящего индуктора - изопропил--D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) - 1 мМ. Последние два фактора определяли экономическую неэффективность этого продуцента.Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является генно-инженерная конструкция и штамм для получения органофосфатгидролазы, предложенные авторами изобретения (United States Patent No.5589386; кл. C 12 S 13/00; C 12 N 15/00; C 12 N 01/20; C 12 N 01/14, 1996). Для реализации способа гидролиза фосфорорганических соединений авторами прототипа предлагаются сконструированные экспрессионные плазмиды с термоиндуцибельным промотором для получения ОРН и ее метионинового аналога, синтез которого кодируется ДНК последовательностью ОРН с делецией 29 аминокислот с N-конца последовательности, которыми трансформируют клетки E.coli, Bacillus и Streptomyces. Предлагаемые в прототипе плазмиды pCMS75 (ATCC №67778) и pCMS77 (ATCC №67779), трансформированные в клетки E.coli Fm5, позволяют получать наибольшее количество ОРН, причем в случае плазмиды pCMS77 фермент синтезируется в виде телец включения. Суммарная активность клеточного экстракта E.coli (pCMS75) в 10 раз выше, чем активность клеточного экстракта E.coli (pCMS77). В данном прототипе предлагается метод гидролиза ингибиторов холинэстеразы, состоящих из фосфорорганических соединений, заключающийся в том, что проводится обработка этих ингибиторов выделенной и очищенной зрелой формой ОРН и ее аналогом, не содержащим инициирующего аминокислотного остатка метионина. Удельная активность ОРН, выраженная в ед/мг белка, увеличивается в случае продуцирования ее микроорганизмами при их культивировании в среде, содержащей более чем 0,15 мМ, но не больше 3,0 мМ любого из металлов, выбранного из ряда: кобальт, цинк или смеси кобальта с цинком. Заявленный в прототипе метод позволяет гидролизовать следующие ингибиторы холинэстеразы: диизопропилфторфосфат, изопропилметилфторфосфат и пинаколилметилфторфосфат.В тексте прототипа не указан выход фермента из 1 г клеток, но приведена его максимальная удельная активность, которая составляет 1000 ед/мг белка.Недостатками конструкции pCMS77 является преимущественное накопление фермента в неактивном нерастворимом состоянии в составе телец включения, а также технологические сложности, связанные с использованием термоиндуцибельного промотора и требующие изменения температурного режима ведения процесса в ходе культивирования.Предлагаемое изобретение решает задачу создания генно-инженерной конструкции и штамма клеток, которые обеспечивают получение значительных количеств активной растворимой формы органофосфатгидролазы в цитоплазме клеток путем индуцибельного синтеза фермента с помощью индуктора ИПТГ.Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рТrсТЕ-ОРН, кодирующей индуцибельный синтез фермента органофосфатгидролазы, и штамма Escherichia coli DH5/pTrcTE-OPH, обеспечивающего синтез этого белка с уровнем экспрессии, позволяющим получать не менее 12 мг очищенного белка из 1 г влажной биомассы.Индуцибельный высокий уровень синтеза целевого полипептида обеспечивается тем, что предлагаемая плазмида рТrсТЕ-ОРН отличается от известной наличием trc-промотора Е.coli и синтетического усилителя трансляции гена 10 бактериофага Т7.Рекомбинантная плазмидная ДНК рТrсТЕ-ОРН, кодирующая фермент органофосфатгидролазу, характеризуется следующими признаками:имеет молекулярную массу 3,46 Md (5,243 т.п.о.);кодирует аминокислотную последовательность фермента органофосфатгидролазы;состоит из Cla I/Hind III - фрагмента ДНК плазмиды pTrcTE-Lep (Патент RU 2185438 С2, кл. С 12 N 15/12, 1/21, 2002) длиной 4,682 т.п.о., содержащего trc-промотор Е.coli, синтетический усилитель трансляции TREN гена 10 бактериофага Т7, ген blа -лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой рТrсТЕ-ОРН клеток к ампициллину, и участок ori инициации репликации; а также из ДНК фермента органофосфатгидролазы длиной 1,011 т.п.о., фланкированного сайтами рестрикции Cla I и Hind III;содержит: trc-промотор Е.coli, уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: Nco I - 265, Есо М - 270, Крn I - 286, Xba I - 340, Cla I - 377, Hind III - 1389.Особенностью предложенной плазмидной конструкции является наличие trc-промотора Е.coli, контролирующего синтез ДНК фермента ОРН, а для усиления трансляции используется синтетический усилитель трансляции, что в совокупности обеспечивает индуцибельный синтез целевого белка с надежной регуляцией и высоким выходом, достигаемым при малых концентрациях индуктора.Для получения штамма-продуцента фермента органофосфатгидролазы трансформируют компетентные клетки Escherichia coli DH5 рекомбинантной плазмидой рТrсТЕ-ОРН.Полученный штамм Escherichia coli DH5/рTrcTE-OPH характеризуется следующими признаками.Морфологические признаки. Клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, 13-5 мкм, подвижные.Культуральные признаки. При росте на агаризованной среде LB (Состав среды LB: триптон - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 5,0 г/л; NaCl - 5,0 г/л; и 1,7% бактоагара) колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые, край ровный, диаметр колоний 1-3 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидкой среде LB (триптон - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 5,0 г/л; NaCl - 5,0 г/л) характеризуется ровным помутнением с образованием легкого осадка.Физико-биохимические признаки. Клетки растут при температуре 4-42С при оптимуме рН 6,8-7,2. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена -лактамазы.Штамм Е.coli DH5/рTrcTE-OPH обеспечивает индуцибельный синтез фермента органофосфатгидролазы с высоким содержанием растворимой формы фермента в цитоплазме, что позволяет получать не менее 12 мг очищенного белка из 1 г влажной биомассы. В данном штамме достигается более высокий выход растворимой формы целевого белка при использовании небольших количеств индуктора. При этом в процессе индукции не требуется изменение температурного режима культивирования клеток. Совокупность перечисленных свойств штамма Е.coli DH5/рTrcTE-OPH делает получение рекомбинантной органофосфатгидролазы высокотехнологичным процессом.Полученный штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина - Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук под номером 25.На фиг.1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды рТrсТЕ-ОРН; на фиг.2 - нуклеотидная последовательность ДНК фермента органофосфатгидролазы с прилегающими регуляторными элементами: trc - промотор (1-30 п.о.), усилитель трансляции TREN (93-186 п.о.), ген органофосфатгидролазы (190-1201 п.о.); инициирующий и терминирующий кодоны подчеркнуты, в рамки взяты сайты рестриктаз: Есо RI, Cla I и Hind III; на фиг.3 - аминокислотная последовательность фермента органофосфатгидролазы, кодируемого рекомбинантной плазмидой рТrсТЕ- ОРН; на фиг.4 - электрофореграмма лизатов клеток штамма-реципиента Е.coli DH 5 (дорожка 1), штамма-продуцента Е.coli DH5/рTrcTE-OPH (дорожка 2), белковых стандартов молекулярного веса (дорожка 3) в 10%-ном полиакриламидном геле (стрелкой указан фермент органофосфатгидролаза).Изобретение иллюстрируется следующими примерами.Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рТrсТЕ-ОРН.Культуру Pseudomonas diminuta VKM В-1297 объемом 100 мл центрифугируют 15 мин 3000 об/мин и осадок ресуспендируют в 10 мл ТЕ буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 5 мМ ЭДТА). После этого добавляют 1 мл раствора лизоцима (10 мг/мл). Суспензию замораживают при -70С, инкубируют на водяной бане при 20С до полного оттаивания клеток и выдерживают во льду 1 ч для разрушения клеточных стенок бактерий. Добавляют 2 мл 0,5% раствора SDS, содержащего 0,4 М ЭДТА и 2 мл раствора протеиназы К (1 мг/мл). Инкубируют 1 ч при 60С, проводят фенольную экстракцию, после чего осаждают ДНК этиловым спиртом. Осадок растворяют примерно в 1 мл ТЕ буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 1 мМ ЭДТА).Добавляют РНКазу А до концентрации 50 мкг/мл, инкубируют 2 ч при 4С, осторожно перемешивая. Повторяют фенольную экстракцию, переосаждают ДНК этанолом, растворяют осадок в 1 мл ТЕ буфера.Полученную ДНК из Pseudomonas diminuta VKM В-1297 используют для амплификации методом полимеразной цепной реакции гена органофосфатгидролазы. Для этого к 5 мкл раствора ДНК (10 нг/мкл) прибавляют по 100 пмоль праймера FOR-Cla с нуклеотидной последовательностью СТТ ССА TCG АТА TGA GAG GAT CGC АТС и 100 пмоль праймера REV-Hind с нуклеотидной последовательностью ССА САА AGC TTC ATG ACG CCC GCA AGG ТС, 8 мкл смеси, содержащей 2,5 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 10 мкл 10-кратного буфера (100 мМ трис-HCl, рН 8,8, 500 мМ КСl, 15 мМ MgCl2), 2 ед. Taq ДНК-полимеразы и воду до 100 мкл. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят в следующем режиме: денатурация - 1 мин, 94С; отжиг - 1 мин., 55С; достройка - 1 мин 30 с, 72С; количество циклов - 35. Праймер FOR-Cla представляет собой 27-звенный олигонуклеотид, в состав которого входят сайт узнавания рестриктазы Cla I, стартовый ATG-кодон и 13 нуклеотидов 5"-области ДНК органофосфатгидролазы. Праймер REV-Hind представляет собой 29-звенный олигонуклеотид, содержащий сайт узнавания рестриктазы Hind III, а также последовательность, комплементарную стоп-кодону гена органофосфатгидролазы и прилегающим 15 нуклеотидам кодирующей области.Реакционную смесь после прохождения ПЦР экстрагируют равным объемом хлороформа, после чего осаждают этиловым спиртом. После центрифугирования и высушивания ДНК растворяют в 20 мкл 10 мМ триса-HСl, 1мМ ЭДТА (рН 8,0).Амплифицированную ДНК (5 мкл) обрабатывают 10 ед. рестриктазы Cla I и 15 ед. рестриктазы Hind III (Fermentas, Литва) в течение 1 ч при 37С в 20 мкл буферного раствора, содержащего 33 мМ трис-ацетата (рН 7,9), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия, и из полученного гидролизата выделяют фрагменты ДНК органофосфатгидролазы длиной 1,011 т.п.о. (Cla I - Hind III фрагмент) переносом их из 1,5%-ного агарозного геля на DEAE-мембрану NA-45.Плазмидную ДНК pTrcTE-Lep длиной (5 мкг) размером 4,682 т.п.о., содержащей trc-промотор и усилитель трансляции TREN бактериофага Т7, обрабатывают 10 ед. рестриктазы Cla I и 15 ед. рестриктазы Hind III в течение 2 ч при 37С в 30 мкл буферного раствора, содержащего 33 мМ трис-ацетата (рН 7,9), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия, и из полученного гидролизата выделяют векторную часть плазмидной ДНК длиной 4,232 т.п.о. переносом ее из 0,8%-ного агарозного геля на DEAE-мембрану NA-45.Cla I - Hind III фрагмент ДНК фермента ОРН длиной 1,011 т.п.о. (0,02 мкг) и 0,05 мкг векторной части плазмидной ДНК pTrcTE-Lep длиной 4,232 т.п.о. соединяют при помощи лигазной реакции в течение 3 ч при 10С в 15 мкл раствора, содержащего 40 мМ трис-НСl (рН 7,8), 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ аденозинтрифосфата и 2 ед. Вейса Т4 ДНК-лигазы.Реакционную смесь (5 мкл) используют для трансформации 200 мкл компетентных клеток XL-1 Blue. 1/10 клеток, использованных для трансформации, высевают на LB-агар, содержащий 75 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК, содержащую фрагмент ДНК фермента ОРН.Окончательно структуру рекомбинантной ДНК рТrсТЕ-ОРН подтверждают определением нуклеотидной последовательности в области встроенной ДНК фермента органофосфатгидролазы.Пример 2. Получение штамма-продуцента фермента органофосфатгидролазы.Рекомбинантной плазмидной ДНК рТrсТЕ-ОРН трансформируют компетентные клетки Escherichia coli DH5 [F- (Ф80d(lacZ)M15) recA1 endA1 gyrA96 thi1 hsdR17(r-km+k) supE44 relA1 deoR (lacZYA-argF)] и получают штамм-продуцент фермента органофосфатгидролазы.Пример 3. Выделение, очистка и исследование свойств рекомбинантного фермента органофосфатгидролазы.Для накопления биомассы клеток используют жидкую питательную среду ТУYЕ (триптон - 12,0 г/л, дрожжевой экстракт - 24,0 г/л, глицерин - 4,0 мл/л, КН2РO4 - 6,95 г/л, К2НРO4 3Н2O - 12,54 г/л, рН среды 7,0), в которую добавляют СоСl2 6Н2О до концентрации 237 мг/л. Перед посевом клеток в среду добавляют раствор ампициллина (концентрация в среде 100 мкг/мл).Для получения инокулята производят посев культуры петлей с чашек Петри в 20 мл среды LB. 12-часовой инокулят вносят в колбу, содержащую 100 мл полноценной питательной среды, культуру выращивают при 30С и постоянном перемешивании (200 об/мин) до тех пор, пока оптическая плотность при длине волны 540 нм не достигнет 0,6, после чего добавляют ИПТГ до концентрации 0,2 мМ. Клетки культивируют в течение 21 ч. Полученную биомассу отделяют центрифугированием (5000 g, 15 мин), взвешивают и ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,0 (массовое соотношение биомасса:буфер - 1:5). Клетки разрушают обработкой ультразвуком (частота 44 кГц) 4 раза по 45 с, между обработками биомассу выдерживают в течение 1 мин во льду. Осадок отделяют центрифугированием (15000 g, 30 мин). К супернатанту добавляют 10% раствор сульфата стрептомицина в 25 мМ TRIS буфере, рН 7,0 (соотношение объемов супернатанта и раствора сульфата стрептомицина - 1:9), выпавший осадок отделяют центрифугированием (15000 g, 30 мин). К супернатанту добавляют сульфат аммония до его конечной концентрации 45% (258 мг/мл раствора белка), затем образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (15000 g, 40 мин). Ресуспендируют осадок, содержащий ОРН, в 40 мл фосфатного буфера (10 мМ, рН 7,0). Полученный раствор подвергают диализу против 2 л 10 мМ фосфатного буфера, рН 6,9. Раствор, содержащий ОРН, наносят на 100 мл колонку с SP-сефарозой (Pharmacia) (скорость нанесения 0,5 мл/мин), уравновешенной тем же фосфатным буфером (рН 6,9), затем через колонку пропускают градиент раствора КСl (от 0 до 0,5 М в фосфатном буфере, рН 6,9).Полученные фракции, содержащие ОРН, объединяют и подвергают диализу против 50 мМ трис-НСl буфера, (рН 8,3), затем наносят на 10 мл колонку с DEAE (Pharmacia), предварительно уравновешенную тем же буфером.В процессе очистки из 1 г влажной биомассы получают 12 мг высокоочищенного фермента со средней удельной активностью 5820 ед/мг белка. Выход фермента составляет 69% от исходного количества ОРН, синтезированного клетками (табл.1).За скоростью исследуемой реакции следят спектрофотометрически на спектрофотометрах, снабженных термостатируемыми кюветными отделениями, по накоплению продукта 4-нитрофенолят аниона (=17000 моль-1см-1, рН 9,0, =405 нм). Для определения каталитической активности органофосфатгидролазы в водных растворах используют 0,05 М CHES буфер (рН 9,0). В качестве субстрата используют 1 мМ водные растворы параоксона, паратиона и метил-паратиона.Каталитическую реакцию инициируют внесением в кювету с буфером и субстратом раствора органофосфатгидролазы в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,0). Концентрация фермента в кювете составляет 10-10-10-9 М.За единицу ферментативной активности принимают такое количество фермента, которое необходимо для того, чтобы гидролизовать 1 мМ субстрата за 1 мин при рН 9,0 и 20С.Расчет скоростей ферментативной реакции проводят по начальным линейным участкам кинетических кривых (Vo=tg). Максимальную скорость ферментативной реакции (Vm) и константу Михаэлиса (Km) определяют с использованием двойных обратных координат 1/vo-1[S] (Лайнуивера-Берка). Кинетические характеристики рекомбинантной органофосфатгидролазы приведены в табл.2. рН-оптимум действия фермента составляет 9,0. Таким образом, заявляемое техническое решение представляет собой плазмиду уникальной конструкции для микробного синтеза ОРН и штамм E.coli, обеспечивающий экспрессию данной плазмиды, позволяющий получить полипептид со свойствами, идентичными свойствам природной ОРН, и обеспечивающий супервысокий выход растворимого высокоактивного фермента (не менее 12 мг из 1 г влажной биомассы) в течение довольно короткого периода времени (21 ч). Биосинтез полипептида индуцируется добавлением в среду невысоких концентраций ИПТГ (0,2 мМ), при этом не требуется изменения температурных условий культивирования клеток. Предлагаемое решение позволяет получать ОРН в виде растворимого белка с высокой активностью и в таком количестве, которые более чем в 5 раз превосходят все известные аналоги и решение, заявленное в прототипе. Все это позволяет значительно повысить технологичность и экономичность процесса получения высокоактивного рекомбинантного фермента органофосфатгидролазы.Рекомбинантный фермент может быть использован для приготовления наборов для аналитического определения фосфорорганических соединений, а также для производства препаратов на основе ОРН, предназначенных для деградации фосфорорганических соединений.Класс C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала
Класс C12N15/52 гены, кодирующие ферменты или проферменты
Класс C12N15/70 векторы или системы экспрессий, специально приспособленные для Ecoli