способ выделения лейкоцитов крови для хемилюминесцентного анализа

Формула изобретения

Способ выделения лейкоцитов крови для хемилюминесцентного анализа, включающий забор крови в силиконизированные пробирки, разрушение эритроцитов, отделение осадка лейкоцитов центрифугированием, отмывание лейкоцитов, отличающийся тем, что забор крови производят с трилоном Б, лизис эритроцитов осуществляют при соотношении крови, дистиллированной воды и буферного раствора 1:8:1, в качестве буферного раствора используют стандартный раствор Хэнкса без фенолового красного с добавлением хлороформа, отмывают лейкоциты 0,02%-ным раствором Трилона Б.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии, а именно к разделу иммунологии. Оно может быть использовано для хемилюминесцентного анализа в медицине и ветеринарии.

Известен “Способ получения лимфоцитарных суспензий из лимфоузлов крупного рогатого скота”, заявка № 810814, C 12 N 7/00, G 01 N 37/54.

Способ осуществляют путем начесывания из ткани лимфоузлов суспензии клеток ex tempore распределения по градиенту плотности фиколла и центрифугирования 30-40 мин, а в качестве буферного раствора используют смесь 0,0001-0,0002 н. раствор MgCl₂+0,1-0,2 н. раствор NaCl.

Однако предложенный метод позволяет выделить только один тип “белых” клеток - лимфоциты, требует больших затрат и убоя животных.

Также известен способ R L. Spooner et al, Eridence for possible major histocompatibility complex (BLA) in cattle, I.j. Immunogenetic, 1978.

Кровь берут с 0,1 М этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) при рН 7,0, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин, затем добавляют 6 ч дистиллированной воды на 1 ч. центрифугата для лизиса эритроцитов. Суспензию белых клеток крови дважды отмывают 0,15 М раствором при 200 g в течение 10 мин. Из 1000 мл крови получают около 3 мл плотной суспензии лейкоцитов.

Указанный способ адсорбции связан с взятием большого количества крови у животных (2000 мл для однократной адсорбции, 10000 мл - для трехкратной адсорбции 20 мл антисыворотки), что отрицательно сказывается на состоянии животных-доноров. Кроме того, при использовании дистиллированной воды для лизиса эритроцитов в суспензии лейкоцитов оказывается большое количество мертвых клеток (20-30%).

Из описанных в литературе наиболее близким к изобретению является “Способ выделения суспензии лейкоцитов для хемилюминесцентного анализа”, который включает забор крови в силиконизированные пробирки, лизис эритроцитов, отделение осадка лейкоцитов центрифугированием, отмывание лейкоцитов фосфатно-солевым буфером, ресуспендирование в растворе Хэнкса, патент RU 2140432. Недостатком способа является низкий выход жизнеспособных лейкоцитов.

Немаловажную роль при бактериальных инфекциях во взаимодействии иммунокомпетентных клеток играют фагоциты, которые перерабатывают антиген (микроб, чужеродная клетка), переводя его в более иммуногенную форму и участвуя тем самым в специфической сенсибилизации соответствующих лимфоидных элементов гуморальной и клеточной систем иммунитета. Необходимо получение смеси полиморфно-ядерных лейкоцитов с преобладанием нейтрофилов для использования в хемилюминесцентном анализе.

Задачей изобретения является повышение выхода жизнеспособных лейкоцитов и предотвращение их склеивания.

Способ осуществляется следующим образом. Забор крови с трилоном Б производят в силиконизированные пробирки. Разрушение эритроцитов осуществляют путем гипотонического лизиса при соотношении крови, дистиллированной воды и буферного раствора 1:8:1.

В качестве буферного раствора используют стандартный раствор Хэнкса без фенолового красного с добавлением хлороформа:

Концентрированный раствор А

Бидистиллированная вода 200 мл

Хлорид натрия (NaCl) 40,0 г

Хлорид калия (КСl) 2,0 г

Сульфат магния (MgSO₄·7Н₂О) 1,0 г

Хлорид кальция (СаСl₂), разведенный в

25 мл бидистиллированной воды 0,7 г

Хлороформ (для консервации) 0,5 мл

Бидистиллированная вода До 250 мл

Концентрированный раствор Б

Бидистиллированная вода 200 мл

Двузамещенный фосфорнокислый натрий

(Nа₂НРО₄·12Н₂О) 0,76 г

Однозамещенный фосфорнокислый калий

(КН₂РО₄) 0,3 г

Глюкоза 5,0 г

Хлороформ (для консервации) 0,5 мл

Бидистиллированная вода До 250 мл

Раствор В

Бикарбонат натрия (NаНСО₃) 1,4 г

Рабочий раствор готовится путем смешивания жидкостей А+Б+бидистиллированная вода в соотношении 1 часть + 1 часть + 18 частей. Раствор пропускают через фильтр, разливают и автоклавируют в течение 10 мин под давлением 0,7 атм. Затем добавляют жидкость В. Полученный раствор Хэнкса имеет рН 7,4-7,6. Состав Хэнкса составлен таким образом, что он уравновешивается воздухом, а не СО₂.

Центрифугируют при 1200 об/мин в течение 15 минут. Дополнительно лейкоциты отмывают 0,02%-ным раствором трилона Б.

Центрифугируют при вышеуказанном режиме, надосадочную жидкость сливают, суспезию лейкоцитов вносят в стабилизирующий раствор. В камере Горяева 1% трипановым синим определяют жизнеспособность лейкоцитов, при этом процент живых клеток должно быть не менее 90-95% в концентрации 210⁶ кл/мл.

Отличительными признаками предложенного способа являются: забор крови производят с трилоном Б, лизис эритроцитов осуществляют при соотношении крови, дистиллированной воды и буферного раствора 1:8:1, в качестве буферного раствора используют стандартный раствор Хенкса без фенолового красного с добавлением хлороформа, отмывают лейкоциты 0,02%-ным раствором Трилона Б.

Трилон Б обладает свойством ускорять осаждение эритроцитов. Дополнительное отмывание лейкоцитов стандартным раствором трилона Б обеспечивает получение однородной взвеси клеток, т.к. в основе действия этого стандартного раствора лежит способность связывать комплексы, содержащие кальций. В результате связывания ионов кальция и магния межклеточные связи ослабевают и тогда с помощью слабого механического воздействия можно получить однородную взвесь клеток.

Предлагаемый стандартный раствор Хенкса без фенолового красного с добавлением хлороформа в качестве буфера обладает способностью поддерживать рН (водородный показатель) на одном уровне, восстанавливая изотоничность, этим самым обеспечивает благоприятную среду для лейкоцитов, что способствует повышению их жизнеспособности.

Совокупность всех признаков обеспечивает достижение поставленной задачи, а именно повышение их склеивания.

В таблице 1 приведена сравнительная оценка жизнеспособности лейкоцитов

Из таблицы видно, что выход лейкоцитов предлагаемым способом составляет 90-95%, форменные элементы представлены смесью полиморфно-ядерных лейкоцитов с преобладанием нейтрофилов.

Пример 1. Брали 0,5%-ный раствор гидролизата лактальбумина, получаемый при ферментативном гидролизе белка молока, который приготовлен на основе растворов А, Б Хэнкса подогревом до температуры кипения.

Из таблицы 2 видно, что выход лейкоцитов при использовании 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина на 5-10% ниже, чем при использовании предлагаемого раствора Хэнкса без фенолового красного с добавлением хлороформа.

Пример 2. Брали раствор Хэнкса с феноловым красным, с 0,2-0,5%-ным содержанием фенолового красного, используемого для консервации. В данном случае фенол является токсичным для выделяемых клеток.

Из таблицы 3 видно, что выход лейкоцитов при использовании Хэнкса с феноловым красным на 5-10% ниже, чем при использовании предлагаемого раствора Хэнкса без фенолового красного с добавлением хлороформа.

Пример 3. Брали среду 199 (Паркера), содержащую аминокислоты, витамины, предшественники нуклеиновых кислот, дополнительные факторы роста, источники липидов и раствор Эрла с добавлением азотнокислого железа.

Состав сбалансированного солевого раствора Эрла, г/л:

Фенолрот 0,02

NaCl 6,8

КСl 0,40

СаСl₂ (безводный) 0,20

MgSО₄·7Н₂О 0,20

NaH₂PО₄·2H₂О 0,14

Глюкоза 1,0

NаНСО₃ 2,2

Из таблицы 4 видно, что выход жизнеспособных лейкоцитов при использовании среды 199 на 5-10% ниже, чем при использовании предлагаемого стандартного раствора.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить выход жизнеспособных лейкоцитов на 30-35% по сравнению с известными способами в предотвращает их склеивание.