способ прогнозирования оптимального температурного режима проведения гипертермии у гнойно-септических больных

Формула изобретения

1. Способ определения оптимального температурного режима проведения гипертермии у гнойно-септических больных, отличающийся тем, что проводят исследование микроорганизмов при разных температурных режимах от 40 до 43С, с определением оптимальной температуры, при которой рост микроорганизмов наименьший, сохраняется их максимальная чувствительность к антибиотикам, а пролиферативная активность лимфоцитов крови больного наименее отличается от исходной.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что исследование микроорганизмов проводят путем использования культурального метода, а оценку пролиферативной активности лимфоцитов - путем реакции бласттрансформации.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что оптимальный температурный режим проведения гипертермии определяют, сопоставляя температуру наименьшего роста микроорганизмов, их максимальной чувствительности к антибиотикам с температурой оптимальной пролиферативной активности лимфоцитов.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что определение температурного режима проводят у каждого больного перед сеансом гипертермии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, гнойной хирургии, и может быть использовано при лечении гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде.

Известны различные способы исследования микробной флоры при гнойных осложнениях для идентификации возбудителя и определения ее чувствительности с целью проведения целенаправленной антибактериальной терапии.

Культуральное исследование включает посев на искусственные питательные среды, выделение и идентификацию чистой культуры микроорганизмов, определение чувствительности к антибактериальным препаратам, определение минимальной ингибирующей концентрации препарата в отношении выявленного возбудителя [3, 4].

В соответствии с Методическими материалами по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств МЗ СССР для оценки влияния фармакологических средств на иммунный статус изучается:

- влияние на гуморальный иммунный ответ (определение антител в сыворотке крови, метод Ерне и Нордин, ГНТ);

- влияние на клеточный иммунный ответ (ГЗТ, реакция торможения миграции макрофагов, РТПХ);

- воздействие на моноциты и макрофаги (спонтанная миграция макрофагов, фагоцитарная активность);

- влияние на систему комплемента;

- воздействие на пролиферацию и кооперацию Т- и В-лимфоцитов (РБТЛ под влиянием Т- и В- клеточных митогенов, оценка митогенных свойств исследуемого препарата, кооперация Т- и В-лимфоцитов);

- митостатическое и лимфотоксическое действие;

- аллергизирующее действие.

Наиболее близкими к заявленному способу являются унифицированные бактериологические (культуральные) методы исследования [2], а также способ оценки митостатических и лимфотоксических свойств лекарственных препаратов по пролиферации Т- и В-лимфоцитов [1].

Данные методы не позволяют оценить функциональные свойства микроорганизмов и лимфоцитов крови больного при повышении температуры, поэтому в условиях гипертермии при проведении стандартного исследования мы не можем оценить реальную патогенность возбудителя.

Задача изобретения: разработка эффективного и безопасного способа проведения гипертермии и оптимизация адаптационных реакций со стороны клеток иммунной системы в постгипертермическом периоде.

При решении поставленной задачи имеет место положительный лечебный эффект. Способ позволяет определить оптимальный режим для проведения гипертермии индивидуально у каждого больного в целях повышения эффективности антибактериальной терапии, а также для модуляции биохимических свойств микроорганизмов и прогнозировать интенсивность развития адаптационных реакций со стороны клеток иммунной системы; в результате этого улучшаются результаты лечения послеоперационных гнойно-септических осложнений.

При использовании способа имеет место экономический эффект, который заключается в сокращении стоимости лечения больных с гнойно-септическими послеоперационными осложнениями за счет уменьшения использования дорогостоящих антибактериальных препаратов, сокращения сроков нетрудоспособности больного.

При использовании способа имеет место социальный эффект - уменьшается риск инвалидизации пациентов.

Технический результат достигается за счет того, что при проведении бактериологического метода исследования возбудителя гнойно-септических осложнений при разных температурных режимах определяют температуру, при которой отмечен минимальный рост культуры возбудителя и при этом сохраняется максимальная чувствительность его к антибиотикам. Оценивают изменение биохимических свойств, что в свою очередь отражает изменения патогенности выделенного возбудителя. Полученные данные и температурный режим сопоставляются; одновременно оценивают, как изменяется по сравнению с исходной пролиферация лимфоцитов крови больного in vitro при полученной температуре и будут ли достаточны возможности иммунной системы, ее ответ при гипертермии.

Поставленная задача решается за счет того, что проводят исследование микроорганизмов при разных температурных режимах, регистрируют температуру, при которой рост микроорганизмов наименьший; одновременно определяют температуру, при которой сохраняется максимальная чувствительность к антибиотикам. Выбирают оптимальные температурные условия, при которых сохраняется наименее отличающаяся от исходной пролиферативная активность лимфоцитов крови больного. Определяют температуру гипертермии, сопоставляя температуру наименьшего роста микроорганизмов, максимальную чувствительность к антибиотикам с температурой оптимальной пролиферативной активности лимфоцитов. Определение температурного режима проводят у каждого больного перед сеансом гипертермии.

Способ осуществляется следующим образом.

При возникновении гнойно-септических осложнений у больного в послеоперационном периоде проводится исследование раневого отделяемого для идентификации возбудителя. После взятия мазка из раны для выделения возбудителя производят посевы на питательные среды [3, 4]. Контрольная культура выращивается при 37С, опытная - при различных температурных режимах (40,0; 40,5; 41,0; 41,5; 42,0; 42,5; 43С). По окончании периода культивирования определяют размер колоний, их морфологию. Например, колонии золотистого стафилококка имеют ярко-золотистый цвет. Для определения лецитиназной активности используют селективную среду - желточно-солевой агар (ЖСА). При расщеплении лецитовителлина вокруг лецитиназоположительных колоний на поверхности среды образуется радужный венчик.

Протеолитическую активность оценивали по отношению к протеину молока на молочно-солевом агаре по величине зоны просветления вокруг колонии. Выделение чистой культуры золотистого стафилококка проводили повторным высевом из идентифицированной колонии на простом агаре. Биохимическая идентификация золотистого стафилококка проводилась по следующим параметрам:

- плазмокоагуляция: при заражении кроличьей плазмы и инкубации в течение 18 часов плазма становится желеобразной, так как под действием фермента плазмокоагулазы активируется естественная система свертывания крови. Реакцию учитывают через 1, 2, 4 и 18 часов при инкубации в термостате при 37С. Отсутствие свертывания плазмы через 18 часов расценивается как отрицательная реакция;

- определение ДНК-азы: под действием ДНК-азы, добавленной в плотную среду, высокополимерная ДНК распадается на фрагменты, при этом мутная среда становится прозрачной. (Вокруг культуры - прозрачная зона, в 4 раза превышающая зону микробного роста.);

- ферментация маннита: в анаэробных условиях при окислении маннита образуется уксусная кислота, которая закисляет среду, что выявляется при помощи индикатора (появляется желтое окрашивание). При внесении культуры в столбик среды и последующей инкубации изменяется цвет питательной среды из розового в желтый;

- хлопьеобразование: при внесении культуры золотистого стафилококка в кроличью плазму рост в ней происходит неравномерно, хлопьями, в виде “снежной бури”.

При наличии обязательного положительного теста на плазмокоагулазу, а также положительных результатов указанных выше тестов делается заключение об идентификации золотистого стафилококка.

Чувствительность к антибиотикам определяли на среде АГВ. Микробная суспензия, разведенная до необходимой концентрации (5 млн микробных тел в 5 мл 0,9% р-ра хлорида натрия) по стандарту мутности, наслаивается на чашку Петри со средой, подсушивается в термостате в течение 15 мин. Диски с антибиотиками накладываются на культуру стафилококков и культивируются. Чувствительность к данному антибиотику определяется по величине зоны задержки роста вокруг диска при инкубации в термостате в течение 18-20 часов при 37С. По окончании этого срока проводят учет результатов на темной матовой поверхности. При помощи линейки измеряют зону задержки роста вокруг диска.

При величине зоны задержки роста в 15-20 мм определяется умеренная чувствительность к данному антибиотику, более 20 мм - высокая чувствительность.

При культивировании на питательных средах в термостате при 42С золотистый стафилококк утрачивал свою патогенность и по биохимическим тестам проявлял себя как эпидермальный стафилококк (отсутствовал пигмент, лецитиназа, гемолиз, отрицательная реакция плазмокоагуляции, не определялась ДНК-аза, окисления маннита в анаэробных условиях не происходило). Уменьшалось количество выросших колоний на плотных питательных средах. При определении чувствительности к антибиотикам при 42С увеличивалась зона просветления вокруг диска с антибиотиками.

Одновременно с исследованием влияния повышенной температуры на идентифицированный возбудитель раневой инфекции проводится изучение воздействия гипертермии на иммунокомпетентные клетки больного, в частности на их пролиферативную активность.

Учитывая то, что снижение количества иммунокомпетентных клеток и уменьшение их функциональной активности является неблагоприятным фактором в течении гнойного процесса, а исходная функциональная активность у каждого больного различна, предложен способ прогнозирования развития гематологических осложнений при проведении гипертермии. До проведения процедуры гипертермии у больного берется 10 мл периферической венозной крови в стерильную пробирку с добавлением гепарина. Кровь наслаивается на градиент фиколла - верографина с плотностью 1,078 г/см³ и центрифугируется при 1500 об/мин в течение 45 минут. Клетки интерфазы, полученные в результате центрифугирования, собираются, трижды отмываются в физиологическом растворе, осаждаются и используются для исследования [5]. Контрольной культурой являются интактные клетки, опытной - клетки, подвергнутые нагреванию в различных температурных режимах: (40,0; 40,5; 41,0; 41,5; 42,0; 42,5; 43С). Клетки культивируются в СО₂ 96-луночных планшетах, в асептических условиях, в концентрации 1000000/мл в питательной среде RPMI - 1640, с добавлением 2мМ L-глутамина, 80 мкг/мл гентамицина, 5% инактивированной нагреванием сыворотки крови АВ IV, 10 мМ HEPES-буфера, 510^-5 М 2 - меркаптоэтанола, в течение 72 часов, при 37С и 5% содержании CO₂ в атмосфере.

Пролиферативную активность клеток оценивали по включению меченного тритием тимидина в ДНК во время деления. За 18 часов до окончания инкубационного периода тимидин вносили в лунки в количестве 1 мк/Кюри на лунку. По окончании периода культивирования клетки собирали на стекловолокнистые фильтры при помощи 12-канального полуавтоматического харвестера. Высушенные фильтры помещали в виалы с 10 мл толуолового сцинтиллятора и проводили измерение радиоактивности в жидкостном сцинтилляционном счетчике в импульсах в минуту [6]. Пролиферативная активность в культурах, подвергнутых нагреванию, выражается в виде индекса влияния, который представляет собой отношение среднего числа имп./мин в опытной культуре к среднему числу имп./мин в контрольной культуре. При получении индекса влияния менее 0,5 делают заключение о высоком риске развития гематологических осложнений. Для проведения гипертермии выбирается тот режим, при котором происходит наименьшее снижение пролиферативной активности мононуклеарных клеток крови, и наиболее эффективный по отношению к микрооганизму.

На основании сочетания этих данных определяется оптимальная температура гипертермии для конкретного больного, при достижении которой больному внутривенно вводится антибиотик согласно полученной чувствительности.

Пример конкретного выполнения.

Больной К. 46 л. поступил 10.04.2001 г. (№ ист. 917) в отделение эндопротезирования и эндоскопической хирургии суставов Новосибирского НИИТО. При поступлении жалобы: на наличие свищей в области послеперационного рубца левого бедра с гнойным отделяемым, периодический подъем температуры до 37,2-37,4С, боли в левом бедре при ходьбе.

Из анамнеза: в 1986 г. появились боли в левом тазобедренном суставе. В 1995 г. по поводу двустороннего идиопатического коксартроза 3 ст. выполнено эндопротезирование левого тазобедренного сустава эндопротезом ЭСИ. В апреле 2001 г. по поводу асептической нестабильности эндопротеза ЭСИ левого тазобедренного сустава в НИИ травматологии и ортопедии г. Новосибирска проведено ревизионное эндопротезирование левого тазобедренного сустава с использованием индивидуальной антипротрузионнной вертлужной чашки и ревизионной бедренной ножки с костной аллопластикой и фиксацией цементом Полакрис. В послеоперационном периоде больному выполнена ревизия раны по поводу свернувшейся гематомы, санация и дренирование. Заживление вторичным натяжением. В декабре 2000 г. самопроизвольно вскрылся абсцесс в области левого бедра и сформировался свищ. Лечился в поликлинике по месту жительства. Консервативное лечение его неэффективное. При бактериологическом исследовании свищевого отделяемого обнаружен золотистый стафилококк. Чувствительность к антибиотикам ограничена. Направлен в НИИТО г. Новосибирска.

При поступлении больного проведено клинико-рентгенологическое обследование. Поставлен диагноз: Глубокая хроническая парапротезная инфекция. Хронический постимплантационный остеомиелит проксимального конца левого бедра, свищевая форма.

По результатам предоперационного обследования (общий анализ крови - эр. - 4,410¹²/л; гем. – 135 г/л; л. - 5,4 10%, э - 6, п - 3 с - 59 л - 28 м - 4; ЛИИ 0,18; абсолютное число лимфоцитов 3,0510%; СОЭ 28 мм/ч. Биохимия крови - общий белок 74 г/л; мочевина 9,0 ммоль/л; общий билирубин 2,04 мкмоль/л; К плазмы 4,0 ммоль/л; глюкоза крови 4,6 ммоль/л; АПТВ 42 с; протромбиновый индекс 98%; фибриноген 5,3 г/л; общий анализ мочи: цвет - желтый; уд. вес-1018; прозрачность - сл. мутная; белок - отр.; сахар - отр.; реакция - кислая; лейкоциты 1-3 в п/зр.; эп. плоский 0-1 в п/зр, экспрессия RGH отрицательная, экспрессия йнтерлейкина 1 и 4 отрицательная, экспрессия TNF -положительная) получены данные за вялотекущий воспалительный процесс.

Руководствуясь клиническими данными и стандартными лабораторными исследованиями, определены показания к оперативному лечению, и 18.05.2000 г. была проведена операция: Фистулотомия, ревизия эндопротеза левого тазобедренного сустава, остеонекрэктомия, санация и дренирование парапротезной области. Рана дренирована сквозными хлорвиниловыми дренажами. Рана постояно промывалась раствором бетадина. При бактериологическом исследовании раневого отделяемого выделены Е. Coli, Enterococcus faecium. На контрольных посевах из дренажей выделялась mix-инфекция: St. aureus и Ps. aeruginosae.

В связи с этим больному проведено культуральное исследование выделяемых микроорганизмов и определение их чувствительности к антибиотикам при разных температурных режимах. Одновременно проведено исследование пролиферативной активности лимфоцитов при тех же температурных режимах. Определив температурный режим, при котором рост колоний микроорганизмов минимальный (42,5С), а максимальная чувствительность при такой температуре определяется к ампицилину (диаметр 32 мм) и при этом сохраняется достаточная пролиферация лимфоцитов, не отличающаяся от исходной, проведен сеанс гипертермии. Сеанс проводился на 10 сутки после операции. Гипертермия проведена под наркозом и при достижении температуры 42,5С с экспозицией 20 минут введен внутривенно ампициллин 10 г. Дренажи удалены на 14 сутки после операции. Рана зажила первичным натяжением. В постгипертермическом периоде проводилась иммуномодулирующая терапия (полиоксидоний, тиофан, коредон, ветом). Проводились многократные пункции парапротезной области. После эвакуации пунктата (в среднем 100 мл) вводился концентрированный бетадин в объеме 10 мл. Удаляемый пунктат многократно исследовался на наличие возбудителя. Результаты исследования пунктата были отрицательные. Рентгенологический контроль области левого тазобедренного сустава и левой бедренной кости без ухудшения.

Больной в удовлетворительном состоянии 11.07.2001 г. (проведено 92 койко/дня) выписан на амбулаторное лечение. На момент выписки клинико-лабораторных данных за воспалительный процесс не выявлено. Функция левого тазобедренного сустава и спорность левой нижней конечности сохранена. Общий анализ крови: эр. 3,810¹²/л; гем 109 г/л; л 4,610%, п - 5, с - 73 л - 16 м - 6; ЛИИ 3,77; абсолютное число лимфоцитов 0,7410%; СОЭ 41 мм/ч. Биохимия крови: общий белок 60 г/л; мочевина 5,8 ммоль/л; молекулы средней массы 0,354 (норма - 300); общий билирубин 7,24 мкмоль/л; К плазмы 5,1 ммоль/л; глюкоза крови 4,9 ммоль/л; АПТВ 33 с; протромбиновый индекс 87%; фибриноген 4,0 г/л. Общий анализ мочи: цвет - желтый; уд.вес 1018; прозрачность - сл. мутная; белок отр.; сахар отр.; реакция кислая; лейкоциты 1-3 в п/зр.; эп. плоский 0-1 в п/зр.

Источники информации

1. Методические материалы по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств / МЗ СССР, Фармакологический комитет. - Москва, 1984. - С. 7-22.

2. Методические указания по применению унифицированных бактериологических (культуральных) методов исследования. - Москва, 1985.

3. Приказ Министерства Здравоохранения СССР № 720 от 18.07.1978 г. “Об улучшении медицинской помощи больным с гнойными хирургическими заболеваниями и усилении мероприятий по борьбе с внутрибольничными инфекциями”.

4. Приказ Министерства Здравоохранения СССР № 535 от 25 апреля 1985 г. “Об унифицировании микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях и лечебно-профилактических учреждений”.

5. Фримель Г. Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - С. 244-248.

6. Phillips R., Rabson A.R. The effect of interleukin 1 (IL1) containing supematants on murine thymocyte maturation // J. Clin. Lab. ImmunoL, 1983. - V. 11. P. 101-104.