способ определения активности лепрозного процесса

Формула изобретения

Способ определения активности лепрозного процесса, заключающийся в определении накопления липидов в клетках гемопоэтического происхождения, отличающийся тем, что оценивают степень накопления липидов в лейкоцитах периферической крови путем расчета среднего цитохимического коэффициента, значения которого 2,6 условных единиц и ниже свидетельствуют об активном лепрозном процессе.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования, и может быть, в частности, использовано для определения активности лепрозного процесса.

Из практики медицины известен способ определения активности лепрозного процесса лабораторными методами исследования состояния Т- и В- систем иммунитета, заключающийся в количественной и функциональной оценке состояния клеток гемопоэтического происхождения Т- и В-лимфоцитов (Селезнева С.П. Взаимосвязь особенностей клиники и иммунных нарушений у больных лепрой: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. - Москва, 1984. - 20 с.). Недостатками этого способа являются: необходимость в параллельном выполнении 7 иммунологических лабораторных методов, что требует от исследователя определенных навыков специальной профессиональной подготовки, использование периферической (как венозной, так и капиллярной) крови больного в качестве биологического материала и невозможность его длительного хранения, наличие большого количества дорогих и малодоступных реактивов, а также большая продолжительность выполнения способа, что не дает возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Известен также способ определения активности лепрозного процесса лабораторным методом исследования, заключающийся в том, что определяют зависящую от характера течения патологического процесса неспецифическую функциональную активность клеток гемопоэтического происхождения - фагоцитов периферической крови (Первухин Ю.В., Назаров К.И., Евстратова В.А., Логинов В.К., Курочкин Б.И. Функциональная активность фагоцитов у больных лепрой. // Ученые записки Института по изучению лепры. Астрахань, 1972, № 7(12), с.141-144). Недостатками этого способа являются: невозможность длительного хранения биологического материала, что диктует необходимость осуществления способа сразу после забора крови больного, строго определенное соотношение количества крови и стабилизирующего раствора, что требует применение дозаторов и усложняет осуществление способа, использование для проведения исследования взвеси неспецифического тест-микроба постоянной концентрации, многократное приготовление мазков крови после ее инкубации в постоянном температурном режиме с взвесью неспецифического тест-микроба, а следовательно, необходимость наличия стационарного термостата, возможное влияние на оцениваемый показатель сопутствующей патологии как инфекционной, так неинфекционной природы, что делает необходимым проведение дополнительных более сложных лабораторных методов исследования. Все перечисленное в итоге не позволяет получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности лепрозного процесса лабораторным методом исследования, заключающийся в том, что в клетках гемопоэтического происхождения, тканевых макрофагах лепрозной гранулемы определяют степень накопления липидов (D.S. Ridley. Skin Biopsy in Leprosy. Histological Interpretation and Clinical Application. - Basel, 1977, 57 p.). Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что оба они относятся к лабораторным методам исследования и основаны на определении степени накопления липидов клетками гемопоэтического происхождения.

Недостатками известного способа являются:

- многоэтапное осуществление способа, состоящего из забора материала от больного методом биопсии, а также других последующих этапов, а именно: фиксации материала, его обезвоживание спиртами различной концентрации, приготовления из него нескольких гистологических срезов на микротоме и их окрашивания на липиды с дополнительной окраской на кислотоустойчивые бактерии, микроскопирования при большом увеличении, что в итоге определяет большую трудоемкость и техническую сложность в осуществлении способа даже для исследователя, владеющего определенными навыками специальной профессиональной подготовки;

- большая травматичность способа вследствие многократной физической и психологической травматизации больного из-за взятия материала методом малой хирургии - биопсией участка кожного покрова со специфическими лепрозными изменениями в пределах видимо неизмененной кожи, что требует предварительного обезболивания, соблюдения правил асептики, а также оптимального выбора места, глубины и размера биопсированного участка кожи, что влияет на результат исследования;

- необходимость в использовании большого числа (не менее 22 наименований) дорогостоящих, дефицитных и токсических химических реактивов;

- большая продолжительность осуществления способа - не менее 110 часов;

- дорогостоящее техническое обеспечение способа (режущий инструментарий, микротом, микроскоп, обеспечивающий большое увеличение изучаемых гистологических срезов), что позволяет использовать способ только в условиях патоморфологической лаборатории.

Таким образом, перечисленные недостатки не позволяют получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - упрощение способа.

Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Поставленная задача решается в изобретении тем, что определяют степень накопления липидов в лейкоцитах периферической крови и по значению среднего цитохимического коэффициента (СЦК) 2,6 условных единиц и ниже судят об активности лепрозного процесса.

Упрощение способа дает возможность исключить четыре этапа осуществления способа-прототипа, а именно - забор материала от больного методом биопсии, проводки по спиртам различной концентрации, приготовления микросрезов и их окрашивания на кислотоустойчивые бактерии и микроскопирования под большим увеличением, что позволяет за более короткий период времени (приблизительно в 50 раз меньший по сравнению со способом-прототипом) осуществить индивидуальный подход к выбору дозы и длительности химиотерапии, оценки ее эффективности и возможности перевода больного на амбулаторное лечение; осуществление способа возможно во время полевой экспедиции, для чего не требуется специальной подготовки, наличия стационарного оборудования и большого числа дорогостоящих, токсических реактивов и характеризуется необходимыми для работы в полевых условиях малой травматичностью забора биологического материала и возможность его длительного хранения.

Проблема определения активности лепрозного процесса остается одной из наиболее актуальных в современной лепрологии. При этом важнейшим ее аспектом является своевременное выявление признаков активности заболевания, что, с одной стороны, способствует адекватному индивидуальному назначению противолепрозных препаратов и снижает риск развития дозазависимых побочных эффектов сульфонов, а с другой стороны, позволяет оценить эффективность проводимого лечения и возможность перевода больного на амбулаторное лечение.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Готовят препарат - мазок периферической (венозной или капиллярной) крови больного на предметном стекле по общепринятой методике (В.В.Меньшиков, 1999). Препарат высушивают на воздухе при комнатной температуре в защищенном от света месте. Далее препарат фиксируют в парах 40% формалина в течение 10 минут и окрашивают его по методу Э. Пирса (1962) раствором Судана черного В, который приготовлен был заранее следующим образом: растворяют 0,7 грамма Судана черного В в 100 миллилитрах чистого этиленгликоля при нагревании и помешивании на водяной бане до 100С в течение нескольких минут. Горячий раствор красителя пропускают через четырехслойный бумажный фильтр. Раствор красителя охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через четырехслойный бумажный фильтр еще один раз. Непосредственно окраску препарата раствором судана черного В осуществляют следующим образом: препарат переносят в сосуд с раствором красителя на 7 минут, в течение которых сосуд время от времени встряхивают. Потом препарат переносят в сосуд с 85% раствором этиленгликоля на 3 минуты, в течение которых сосуд время от времени встряхивают. Затем препарат переносят в сосуд с 50% раствором этиленгликоля на 3 минуты, на протяжении которых сосуд время от времени встряхивают. После этого препарат осторожно промывают на протяжении одной минуты в теплой (+30-35С) проточной воде. Высохший на воздухе препарат просматривают под микроскопом (иммерсионная система, объектив х90, окуляр х7 или х10). При этом 100 просмотренных лейкоцитов периферической крови в зависимости от интенсивности их специфической окраски делят на четыре группы: со слабоположительной (1+), положительной (2+), резко положительной (3+) и максимальной (4+) специфической окраской (фиг.1).

Количественное выражение результата определения степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови - средний цитохимический коэффициент (СЦК) - рассчитывают по формуле

СЦК - количественное выражение результата определения степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови в условных единицах;

А - количество лейкоцитов периферической крови в группе со слабоположительной специфической окраской (1+) в процентах к 100 просмотренным в препарате;

Б - количество лейкоцитов периферической крови в группе с положительной специфической окраской (2+) в процентах к 100 просмотренным в препарате;

В - количество лейкоцитов периферической крови в группе с резко положительной специфической окраской (3+) в процентах к 100 просмотренным в препарате;

Г - количество лейкоцитов периферической крови в группе с максимальной специфической окраской (4+) в процентах к 100 просмотренным в препарате;

1, 2, 3, 4 - число плюсов, соответствующее каждой из четырех групп, просмотренных в препарате 100 лейкоцитов периферической крови;

100 - общее количество просмотренных в препарате лейкоцитов периферической крови в процентах.

Все применявшиеся реактивы имели допустимую для лабораторных исследований категорию качества. Работа осуществлялась с использованием микроскопа отечественного производства “Микмед - 1, вариант 2”.

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием электронных таблиц MICROSOFT EXCEL с вычислением следующих статистических параметров: средней арифметической (М), среднего квадратического отклонения (S) и критерия Стьюдента.

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицей и фиг.1-3.

Из таблицы видно, что среднее значение (М) среднего цитохимического коэффициента (СЦК) у больных лепрой с признаками активности лепрозного процесса (первая группа) составило 2,0 условные единицы. С учетом среднего квадратического отклонения (S) верхняя граница допустимого интервала (М±2S) равнялась 2,6 условных единиц. Она была принята в качестве критерия, при значениях равных и ниже которого у больных лепрой определяли активный лепрозный процесс. В группе больных, у которых лепрозный процесс характеризовался отсутствием признаков активности и находился в стадии регресса (вторая группа), среднее значение цитохимического коэффициента составило 3,1 условных единиц. При этом нижняя граница доверительного интервала с учетом среднеквадратического отклонения соответствовала 2,7 условным единицам. Обследованные группы больных значительно и достоверно (Р <0,001) отличались по степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови. Таким образом, у больных лепрой с признаками активности лепрозного процесса отмечается сравнительно низкая степень накопления липидов в лейкоцитах периферической крови, что позволяет использовать данный показатель в качестве лабораторного теста для определения активности лепрозного процесса у больных лепрой.

Фиг.1 - группа лейкоцитов периферической крови с различной интенсивностью их специфической окраски:

1+ - ядро не контрастирует или слабо контрастирует; окрашивание цитоплазмы по периферии клетки в виде тонкого бледно-голубого ободка;

2+ - ядро имеет размытые контуры на фоне диффузно окрашенной в бледно-голубой цвет цитоплазмы;

3+ - ядро четко контрастированно на фоне интенсивно окрашенной в голубой цвет цитоплазмы;

4+ - ядро имеет четкие контуры; диффузное окрашивание клетки в синий цвет с максимальным расположением красителя по периферии цитоплазмы; отложение красителя в виде отдельных гранул.

Фиг.2 - единичные со слабоположительной специфической окраской лейкоциты периферической крови больного лепрой с признаками активности лепрозного процесса, что свидетельствует о низкой степени накопления в них липидов;

Фиг.3 - группа лейкоцитов периферической крови больного лепрой с отсутствием признаков активности лепрозного процесса, которые имеют слабоположительную, положительную и максимальную специфическую окраску, что свидетельствует о сравнительно более высокой степени накопления в них липидов в сравнении с больными лепрой, имеющими признаки активности лепрозного процесса.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в клинике НИИ по изучению лепры МЗ РФ на 87 больных лепрой в течение 2000-2002 годов. Из всех обследованных больных четырнадцать пациентов на момент исследования имели клинические проявления активности лепрозного процесса, которые были подтверждены лабораторными методами исследования. У остальных 73 человек заболевание характеризовалось отсутствием клинико-лабораторных признаков активности лепрозного процесса. Все больные были разделены на две группы. Первая группа - больные с признаками активности лепрозного процесса (13 человек). Во вторую группу было включено 73 больных лепрой, которые не имели на момент исследования признаков активности лепрозного процесса.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1.

Больной К-о, 1946 г.р., (история болезни № 2662). Болен лепрой с 1957 года. С октября 2001 года и по настоящее время отмечается рецидив лепры. Диагноз: лепра, лепроматозный тип, LL_S. Активный лепрозный процесс. Клинически заболевание характеризовалось наличием следующих признаков активной стадии лепрозного процесса: кожных покровы - диффузная глубокая инфильтрация, лепромы и facies leonina; верхние дыхательные пути - осиплость голоса, инфильтрация слизистой полости носа; периферическая нервная система - гипертрофия и болезненность локтевых и малоберцовых нервов. Бактериоскопический индекс (БИН) равен 2,33+. Гистологически: Лепроматозной структуры гранулема в активной стадии с наличием большого количества М. leprae. Для осуществления предлагаемого способа использовали мазок периферической крови на предметном стекле и по значению среднего цитохимического коэффициента (СЦК) определяли активность лепрозного процесса. Готовили препарат - мазок периферической крови больного на предметном стекле по общепринятой методике. Препарат высушивали при комнатной температуре в защищенном от света месте. Препарат фиксировали в течение 10 минут в парах 40% формалина. Окрашивали препарат раствором Судана черного В следующим образом. Препарат переносили в сосуд с раствором красителя на 7 минут, в течение которых сосуд время от времени встряхивали. Потом препарат переносили в сосуд с 85% раствором этиленгликоля на 3 минуты, в течение которых сосуд время от времени встряхивали. Затем препарат переносили в сосуд с 50% раствором этиленгликоля на 3 минуты, на протяжении которых сосуд время от времени встряхивали. После этого препарат осторожно промывали на протяжении одной минуты в теплой проточной воде. Высохший на воздухе препарат просматривали под микроскопом с использованием иммерсионной системы.

100 просмотренных лейкоцитов периферической крови в зависимости от интенсивности специфической окраски разделяли на группы: со слабоположительной (1+), положительной (2+), резко положительной (3+) и максимальной (4+) окраской. Количественное выражение результата определения степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови - средний цитохимический коэффициент (СЦК) - рассчитывали по формуле

Значение СЦК составило 2,6 условных единиц. Таким образом, предложенный способ позволил достоверно определить активность лепрозного процесса.

Пример 2.

Больная Ч-а, 1937 г.р., (история болезни № 3867). Больна лепрой на протяжении 15 лет. Диагноз: Лепра, лепроматозный тип, LL_S, активный лепрозный процесс. Клинически - со стороны кожных покровов, слизистых верхних дыхательных путей, периферической нервной системы - проявления активности лепрозного процесса. БИН=2,66+. Гистология: Инфильтрат лепроматозной структуры, содержащий макрофаги в различной степени жировой вакуализиции и гомогенные и зернистые М. leprae. Определение активности лепрозного процесса проводилось способом, описанным в примере 1. Значение СЦК составило 1,5 условных единицы.

Таким образом, предложенный способ позволил достоверно определить активность лепрозного процесса.

Пример 3.

Больная К-а, 1926 г.р., (история болезни № 3847). Больна лепрой с 1977 года. Диагноз: Лепра, лепроматозный тип, LL_S, стадия регресса лепрозного процесса. Клинически у больной отсутствовали проявления активности лепрозного процесса. БИН=0. Гистология: Небольшие и умеренно выраженные инфильтраты без М. leprae, состоящие из крупновакуализированных макрофагов, которые содержат в своей цитоплазме большое количество липидов. Определение активности лепрозного процесса проводилось способом, описанным в примере 1. Значение СЦК составило 2,8 условных единиц.

Таким образом, полученный результат позволил достоверно исключить активность лепрозного процесса.

Применением предложенного способа по сравнению со способом-прототипом достигается положительный результат, заключающийся в упрощении определения активности лепрозного процесса. Упрощение способа достигается исключением четырех наиболее трудоемких и продолжительных этапов осуществления способа-прототипа, а именно: забор материала от больного методом биопсии, обезвоживания спиртами различной концентрации, приготовления гистологических срезов, их окраски на кислотоустойчивые бактерии и микроскопирование при большом увеличении, что делает способ легко выполнимым даже для исследователя, не имеющего специальной подготовки. Исключение этапа забора материала от больного методом биопсии вследствие использования в предложенном способе в качестве материала от больного мазка периферической крови на предметном стекле делает предлагаемый способ малотравматичным и не требует для его осуществления предварительного обезболивания, строгого соблюдения правил асептики, оптимального выбора места, глубины и размера биопсированного участка кожи. Для осуществления предлагаемого способа необходимо наличие не более пяти доступных, недорогих и малотоксичных химических реактивов, что, в 4,5 раза меньше по сравнению со способом-прототипом. Предлагаемый способ, осуществление которого занимает не более двух часов, быстро выполним, что приблизительно в 50 раз меньше по сравнению со способом-прототипом. Для осуществления предлагаемого способа не требуется наличия обязательного для осуществления способа-прототипа дорогостоящего технического обеспечения, что позволяет осуществить предлагаемый способ, как в полевых условиях, так и в любой лаборатории. Кроме того, результаты проведенного клинического испытания предлагаемого способа свидетельствуют о его надежности и простоте выполнения, что позволяет за более короткий срок осуществить оценку эффективности проводимого лечения, а следовательно, своевременно внести необходимые коррективы в назначаемые дозы и длительность приема противолепрозных препаратов, которые потенциально обладают рядом побочных дозозависимых эффектов. Возможность осуществления предлагаемого способа в условиях полевой экспедиции будет также способствовать более быстрому решению задачи эффективного лечения больных с признаками активности лепрозного процесса, что в свою очередь позволит снизить риск и частоту развития тяжелых инвалидизирующих осложнений длительно текущего лепрозного процесса.

Таким образом, авторами предложен новый, никем ранее не предлагавшийся способ определения активности лепрозного процесса.

В дальнейшем на основании предлагаемого способа может быть разработан способ оценки противолепрозной активности лекарственных препаратов, а также способ определения эффективности противолепрозной терапии. Предлагаемый способ может быть рекомендован к клиническому использованию в противолепрозных учреждениях.