способ получения клеток млекопитающих для использования в производстве вирусов

Формула изобретения

1. Способ получения клеток млекопитающих для использования в производстве вирусов путем культивирования клеток млекопитающих, прикрепленных к субстрату, до достижения желательного объема предпроизводственной серии, когда в ходе повторяющегося прерывистого процесса а) приблизительно 80-90% клеток из предпроизводственной серии используется для получения по крайней мере одной производственной серии, и б) приблизительно 10-20% клеток предпроизводственной серии используется как посев для получения по крайней мере одной последующей предпроизводственной серии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в ходе повторяющегося прерывистого процесса а) приблизительно 80-90% клеток из предпроизводственной серии переносится для использования в получении по крайней мере одной производственной серии, и б) приблизительно 10-20% клеток предпроизводственной серии переносится для использования в качестве посева для получения по крайней мере одной последующей предпроизводственной серии.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что первая предпроизводственная серия получена из рабочего посева в результате по крайней мере одного пассажа.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что перед каждым переносом клетки отделяют от их субстрата.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение имеет отношение к методу получения клеток для использования в производстве биопродуктов.

Для производства биопродуктов, например, на клеточных линиях, необходимо получение больших количеств клеток с использованием методик постепенного увеличения в биореакторах.

В патенте США №5017490 описана такая методика постепенного увеличения, которая, в частности, обладает преимуществом низкого риска заражения культуры при пассаже. Однако этот метод неприемлем для якорных клеток (т.е. не годится для клеток, которые растут только после фиксации на субстрате) или клеток, растущих в толще субстрата (например, на пористых носителях).

В патенте США №4644912 описан метод получения якорных клеток для производства биологических продуктов (например, вирусов), начиная с рабочего клеточного посева с последующим пассированием в биореакторах последовательно возрастающих объемов: 1, 5, 25 и 150 л и заканчивая 1000-литровым биореактором или несколькими 150-литровыми биореакторами. В период между такими пассажами клетки освобождают от носителя при помощи разбавленного раствора протеазы. На последнем пассаже осуществляется заражение вирусом.

Принимая длительность среднего клеточного цикла равной приблизительно 20-24 ч, интервал между пассажами может составлять около 3-5 дней. Поэтому, для того чтобы получить значительные количества культивируемых клеток из рабочего клеточного банка производителя (РКБП), метод постепенного увеличения клеточной популяции может занять несколько недель, в зависимости от конечного объема биореактора.

В вышеупомянутых методах получения клеток каждая конечная популяция клеток получается из РКБП. При производстве больших количеств биологических продуктов появится необходимость использования нескольких параллельных культивируемых клеточных линий при наибольших объемах реактора. Такая процедура отнимает много времени и требует значительного количества биореакторов как для получения клеток, так и для производства биопродуктов.

Цель данного изобретения - обеспечение значительно более быстрого получения клеток для производства биопродуктов.

Соответственно, данное изобретение относится к методу получения клеток для использования в производстве биопродуктов путем культивирования клеток до желаемого клеточного объема предпроизводственной серии, где в результате повторяющегося прерывистого процесса:

а) часть клеток из предпроизводственной серии используется для получения по крайней мере одной производственной серии,

б) оставшаяся часть клеток предпроизводственной серии используется в качестве посева для получения по крайней мере одной последующей предпроизводственной серии.

Более конкретно, данное изобретение относится к методу получения клеток для использования в производстве биопродуктов путем культивирования клеток до желаемого клеточного объема предпроизводственной серии, где в результате повторяющегося прерывистого процесса:

а) часть клеток из предпроизводственной серии переносится для использования в получении по крайней мере одной производственной серии, и

б) оставшаяся часть клеток предпроизводственной серии переносится для использования в качестве посева для получения по крайней мере одной последующей предпроизводственной серии.

В предпочтительном воплощении данного изобретения первая предпроизводственная серия готовится из рабочего посева в результате по крайней мере одного пассажа.

В другом предпочтительном воплощении данного изобретения получаемые клетки являются якорными. В этом случае, как правило, необходимо, чтобы клетки росли на субстрате. Желательно добавление дополнительного количества субстрата в ходе повторяющегося процесса каждый раз, когда часть серии используется для получения новой серии. В предпочтительном воплощении, каждый раз перед добавлением субстрата по крайней мере часть клеток впервые отделяют от первоначального субстрата.

В данном изобретении термин “производственная серия” обозначает клеточную культуру, которая используется для производства биопродуктов.

В данном изобретении термин “предпроизводственная серия” обозначает клеточную культуру, которая используется в ходе процесса согласно данному изобретению для получения по крайней мере одной производственной серии (согласно определению, которое приведено выше) и одной последующей предпроизводственной серии.

В данном изобретении термин “биопродукт” обозначает любое вещество или организм, который может быть получен на клеточной культуре. Примером “биопродукта” служат вирусы или белки, такие как ферменты.

В данном изобретении термин “рабочий посев” обозначает некоторое количество определенного типа клеток известного происхождения сохраняемого для использования в качестве посева, из которого будут получены все культуры того же самого типа клеток.

В данном изобретении термин “якорные клетки” обозначает клетки, для эффективного роста и/или деления которых необходимо прикрепление к субстрату в соответствии с приведенным описанием.

В данном изобретении термин “субстрат” обозначает любое определенное вещество, пригодное для прикрепления клеток.

В данном изобретении термин “пассаж” обозначает последовательность действий для роста и размножения клеток, включающую по крайней мере перенос нужного количества среды культивирования в производственную емкость, инкубирование емкости в условиях, обеспечивающих рост и размножение клеток в течение времени, достаточного для эффективного роста и размножения данного типа клеток. Необязательно, пассаж может включать отделение клеток со среды культивирования и/или с субстрата через промежуток времени, достаточный для эффективного роста и размножения клеток.

Для специалиста очевидно, что метод данного изобретения значительно отличается от известных методов, согласно которым клетки продуцируются в ходе непрерывного процесса, в отличие от данного прерывистого процесса. Согласно патентным публикациям ЕРО 417532 и WО 89/08701, непрерывные системы культивирования могут также использоваться для производства вирусов. Сначала клетки растят в первом биореакторе, затем, по достижении определенной плотности, клетки из указанного первого реактора постоянно переносят во второй биореактор. В этом втором биореакторе на этих клетках растят вирусы с последующим постоянным удалением данных вирусов и этого второго биореактора.

Основной рабочий метод данного изобретения заключается в использовании материнского биореактора, из которого клетки переносят в производственный(е) биореактор(ы). В случае если клетки являются якорными, предпочтительно, чтобы они снимались с субстрата при каждом пассаже.

Для этой цели была разработана методика трипсинизации в больших биореакторах. Клетки, используемые в производстве, определяются согласно специфическому характерному номеру пассажа для так называемого обширного банка клеток (ОБК). Описанный метод обеспечивает высокую производительность, поскольку период постепенного увеличения клеточной популяции из рабочего клеточного посева (РКП) может быть значительно укорочен и требуется значительно меньшее количество биореактора, так как отпадает необходимость ведения параллельных линий продуцентов.

На чертеже представлены различные воплощения данного изобретения.

В предпочтительном воплощении клетки растят из одной ампулы РКБП до уровня первой предпроизводственной серии с использованием одного или более пассажей. Объем биореактора, используемого для предпроизводственной серии, может варьировать от нескольких литров рабочего объема до нескольких сотен литров. Затем, часть, например, 10-20% полученных таким образом клеток (например, пассаж X) используется для повторного внесения в биореактор для получения последующей предпроизводственной серии (которая представляет собой пассаж номер Х+1), в то время как основное количество клеток (пассаж Х или Х+1) переносят в реактор большего объема для того, чтобы непосредственно начать производство или сначала “внести в него” с последующим началом производства.

Известно, что при классическом производстве клеточных линий количество удвоений клеток, полученных из РКБП, к моменту сбора клеток ограничено определенными пределами. Максимальное допустимое число генераций изначально устанавливается в данной системе производства.

При использовании метода данного изобретения максимальное число клеточных пассажей может быть задано ОБК. Отсюда, число производственных пассажей (число клеточных пассажей используемое до производства биологического продукта) становится неуместным в пределах, установленных ОБК. Как следствие, максимальное число пассажей ограничивается технологическими инструкциями. В результате, определенная серия произведенных биопродуктов является конечным продуктом одного цикла постепенного увеличения клеточной популяции.

Для того чтобы убедиться в том, что клетки на стадии ОБК в ходе производства аналогичны клеткам исходного клеточного банка (ИКБ), необходимо провести специальное исследование в отношении ростовых параметров, отсутствия побочных, дополнительных и эндогенных веществ на различных стадиях, а также кариологический изоферментный анализ и т.д. После того как ОБК полностью охарактеризован, можно получить продукт с клетками при любом номере пассажа между ИКБ и ОБК, поскольку можно утверждать, что клетки остались неизменными в ходе пассирования. В результате, тестирование РКБП можно свести к проверке стерильности. Это является специфическим преимуществом метода данного изобретения.

При установленном максимальном числе пассажей можно использовать клетки на любой стадии в пределах этого числа. Отсюда, для того чтобы еще более уменьшить время, необходимое для увеличения клеточной популяции из РКБП для стадии производственного биореактора, было бы полезно сформировать стартовую популяцию клеток. Это можно осуществить, например, одним из следующих путей:

Клетки можно оставить на определенном номере пассажа в течение более продолжительного периода при комнатной температуре (17-32°С) и затем “оживлены” до логарифмического роста путем повышения температуры и замены культуральной среды, или клетки могут быть заморожены (темп.< -80°С) и затем разморожены перед перенесением в биореактор заранее определенного объема, при этом значительно укорачивается период постепенного увеличения клеточной популяции.

Метод согласно данному изобретению применим для культур клеток животных, в частности, для якорных клеток. Подходящими типами клеток являются, например, клетки хомяка (СНО, ВНК-1), обезьян (Vero), быков (MDBK), собак (MDCK), людей (СаСо, А431) или цыплят (CEF).

В данном изобретении в качестве биореактора может использоваться один или несколько, например, ферментеров с перемешиванием, ферментеров с фиксированной подложкой ферментеров с жидкой (расплавленной) подложкой, ферментеров с аэрированием или реакторов с полыми волокнами.

Клетки вышеупомянутых типов могут, а иногда и требуют, культивирования на твердой подложке, таком как микро- или макроноситель в суспензии, например, на твердой подложке, жидкой подложке или суспензии, или таких как полые волокна. Клетки могут также культивироваться в толще носителя (например, в пористом носителе).

При использовании метода данного изобретения, особенно при использовании твердой подложки, необходимо высвобождать клетки с такой твердой подложки. Это можно осуществить с помощью любого метода снятия клеток с твердой подложки. Преимущество заключается в том, что для этой цели можно применить раствор протеолитического фермента. Необязательно, когда энзиматическому высвобождению предшествует один или более подготовительных этапов, например, обработка клеток ЗФР и/или ЭДТА с тем, чтобы повысить протеолитическую эффективность, и/или для того, чтобы уменьшить необходимое количество протеолитического фермента.

Пример 1

Снятие клеток с их отделением от носителя перед переносом на следующий биореактор

Якорные клетки линии MDCK (Madin Darby Canin Kidney) (клетки почки собаки) культивировали при 37°С на микроносителе Cytodex-3 (Pharmacia, Упсала, Швеция) (5 г носителя/литр) в биореакторе с перемешиванием, объемом 4 л (“материнский биореактор”). Использовали ростовую среду EpiSerf (Life Technologies, Пэсли, Шотландия). Клетки растили до максимума 510⁶ клеток/мл культуры.

Клетки снимали с носителя трипсинизацией, используя раствор трипсин-ЭДТА (Life Technologies, Пэсли, Шотландия).

После оседания частиц носителя, 80% снятых клеток переносили в 3 других биореактора такого же размера. Во все эти “производственные” биореакторы был заранее внесен носитель (клеточный субстрат). В течение некоторого времени клетки “заселяли” носитель, после чего их использовали для производства в данных производственных биореакторах.

Оставшиеся в “материнском биореакторе” клетки заселяли оставшиеся носители Cytodex-3, после чего их культивировали до желательной клеточной плотности.

Пример 2

Снятие клеток без отделения от носителя перед переносом в следующий биореактор

Клетки культивировали, как описано в Примере 1, но после трипсинизации 80% снятых клеток вместе с носителем переносили в 3 производственных биореактора. Кроме того, подходящие носители добавляли во все биореакторы.

Пример 3

Снятие клеток без отделения от носителя после переноса в другой биореактор

Клетки культивировали, как описано в Примере 1, но 80% слипшихся клеток вносили в биореактор такого же размера, который затем использовали непосредственно для получения продукта.

Оставшиеся в материнском ферментере клетки на микроносителе снимали трипсинизацией, затем добавляли новые носители и клетки вновь заселялись на субстрате.

Пример 4

Запуск из замороженных клеток

В данном эксперименте часть культуры использовали для пополнения клеточной популяции в материнском ферментере и в нескольких дочерних ферментерах, а другую часть клеток замораживали.

Замороженные клетки (общее количество 14,410⁸ клеток) вносили в исходную среду в материнском ферментере объемом 3 л с носителем Cytodex (5 г/л) в среде EpiSerf и затем инкубировали при температуре 37°С. Остаточные криоконсерванты удаляли сменой среды в первый день культивирования.

На второй день проводили трипсинизацию, 50% клеток замораживали, а оставшиеся клетки вносили в следующий ферментер с микроносителями.

Из таблицы 1 видно, что клетки продолжают расти с нормальной скоростью в течение второго и третьего дня.

На 4 день содержимое материнского ферментера снимали трипсином и переносили на новые микроносители (10 г/л) в двух других ферментерах, следующих за материнским ферментером.

На 5 день эффективность посева составила около 85%.

Пример 5

Перенос из материнского ферментера малого объема в производственный ферментер большого объема

Клеточную популяцию доводили до больших объемов в ферментерах объемом 65 и 550 л (рабочий объем 50 и 250 л, соответственно), используя плотность микроносителя Cytodex в концентрации 5 г/л.

Как видно из таблицы 2, 90% всех клеток переносят в ферментер большого объема из ферментера объемом 50 л, в котором концентрация клеток составляет 800000 клеток/мл, из них жизнеспособными оказались 69%.

Аналогичный результат был получен в материнском ферментере объемом 50 л: приблизительно 69% клеток, используемых для увеличения популяции, были жизнеспособны.

Использовали следующую методику:

В день 0 культивирования носителям позволяли осесть в культуру объемом 50 л, после чего супернатант (куль туральную среду) удаляли и заменяли на ЗФР. Содержимое ферментера перемешивали в течение 5-15 мин. Удаляли супернатант после повторного оседания носителей. При необходимости этот этап может быть повторен.

На следующем этапе использовали ЗФР/ЭДТА (0,4 г ЭДТА/литр ЗФР). Культуру снова перемешивали в течение 5-15 мин, затем дожидались оседания носителя, удаляли супернатант, и этап с использованием ЗФР/ЭДТА повторяли до тех пор, пока клетки не округлялись и были готовы для снятия трипсином.

Затем к ЗФР/ЭДТА добавляли трипсин (конечная концентрация 0,025%) и проводили инкубацию в течение 5-15 мин. После чего переносили либо супернатант с клетками (после осаждения “голых” носителей) (как в примере 9), либо смесь клеток и носителей (80% от общей смеси).

После переноса клеток в ферментер объемом 550 л, оставшиеся клетки (т.е. 10% жизнеспособных клеток) заселяли носители, которые все еще находились в ферментере (50 л) после его заполнения культуральной средой.

Приблизительно 70% клеток были жизнеспособны.

Пример 6

Аналогичен примеру 5, но 80% культуры клеток, связанных с носителем, переносили из материнского биореактора в производственный биореактор. Получение начинали после добавления вируса.

Оставшиеся 20% клеток и носителей в материнском биореакторе снимали трипсинизацией; при добавлении нового субстрата в материнский биореактор они заселяли материнский биореактор, в то время как получение биопродукта протекало в физически отделенном производственном биореакторе.

Пример 7

Культура большого объема, полученная из замороженных клеток

Замороженные клетки оттаивали и вносили в 10-литровый (рабочий объем) ферментер (концентрация носителя Cytodex 5 г/л, культуральная среда EpiSerf), плотность внесения составила 110⁶ клеток/мл. После прикрепления клеток заменяли культуральную среду с тем, чтобы удалить остаточные криоконсерванты.

После первого дня культивирования, количество жизнеспособных клеток прикрепленных к носителю, составило 0,4510⁶ клеток/мл, из этих клеток начался рост популяции. При плотности 2,810⁶ клеток/мл клетки снимали с носителя трипсинизацией и 80% переносили в ферментере рабочего объема 50 л (концентрация носителя - 5 г/л).

Как видно из таблицы 3, на первый день количество жизнеспособных клеток после замораживания клеток составило приблизительно 45%.

Жизнеспособность от общего количества перенесенных клеток после трипсинизации составила 71,4%.