способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена

Формула изобретения

Способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена, включающий культивирование клеток Bacillus anthracis, отделение клеток и выделение антигена, отличающийся тем, что бесплазмидный штамм Bacillus anthracis 81/1 TR (pX01^-, рХ02^-) выращивают в R-среде с шуттелированием при 37С в течение 22 ч, клетки микроорганизма отделяют фильтрованием, а культуральный фильтрат концентрируют на ультрафильтрах НLР10 и РМ10, затем концентрированный культуральный фильтрат разделяют гель-хроматографией на сверхтонком сефакриле s-300, выход фракции антигена с м.м. более 150 kDa, которая элюируется в свободном объеме, регистрируют при = 280 нм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для изучения антигенной структуры сибиреязвенного микроба и идентификации различных генотипов Bacillus anthracis.

Известно, что соматические антигены B.anthracis являются перспективными для разработки видоспецифических диагностических препаратов. Эти антигены выделяют чаще всего из клеток и культуральных фильтратов (КФ) авирулентных токсинпродуцирующих штаммов В.anthracis (tox⁺ cap") (Безносов М.В., Петров Г.А. Способ получения сибиреязвенного эндоантигена. - Изобретение №1503102, 1987 г.; Ezzel J.W., Abshire J.G. Immunological analysis of cell-associated antigens B.anthracis // Inf.Immun. - 1988. - Vol. 56, №2. - P.349-356; Барков А.М., Липницкий А.В., Евтеева Е.В. Выделение и антигенная характеристика компонентов культурального фильтрата Bacillus anthracis // Биотехнология. - 2000.-№6. - С.27-33).

Недостатками приведенных способов являлись сложность и много-этапность выделения, использование методов, вызывающих денатурацию белка, низкий выход антигенов. При этом не были получены достаточно очищенные антигены, что снижало специфичность диагностических препаратов.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является заявка на изобретение №2001118137/13 (019157) (Способ получения сыворотки для идентификации возбудителя сибирской язвы. Барков А.М., Липницкий А.В., Евтеева Е.В.), на которую получено решение о выдаче патента на изобретение.

Цель изобретения - целенаправленное выделение высокомолекулярного соматического антигена B.anthracis, необходимого для более полного изучения антигенных свойств этого микроорганизма и идентификации различных генотипов B.anthracis.

Поставленная цель достигается тем, что высокомолекулярный соматический антиген выделяют из КФ бесплазмидного штамма B. anthracis 81/ITR (tox^-, cap^-), что исключает наличие в нем антигенов, относящихся к сибиреязвенному токсину и капсуле, и способствует более высокому выходу соматического антигена.

Дополнительная очистка антигена производится при разделении КФ гель-хроматографией на сверхтонком сефакриле S 300.

Отбирают фракцию 1, которая элюируется в свободном объеме (объем декстрана голубого) и представлена белковым компонентом (м.м. > 150 кDа) КФ B.anthracis 81/ITR.

При внутрикожном введении 0,1 мл этой фракции с концентрацией белка 72 мкг/мл тест на отекогенность был отрицательным, она не обладала протективными свойствами, в отличие от фракции 5 КФ токсинпродуцирующего штамма B.anthracis СТИ, которая при внутрикожном введении 80 мкг белка в 1 мл вызывала отек кожи, а при двукратном внутримышечном введении морским свинкам 100 и 150 мкг белка с неполным адъювантом Фрейнда обуславливала защиту животных при заражении высоковирулентным штаммом B.anthracis 81/1.

Антисыворотки к антигенам фракции 1 в реакции иммунодиффузии (РИД) образовывали зону преципитата, не идентичную зонам, формируемым антисывороткой к фракции 5 токсинпродуцирующего штамма B.anthracis СТИ.

Эритроцитарный диагностикум, полученный с использованием иммуноглобулинов антисыворотки к фракции 1, выявлял 25-3,1 мкг белка в 1 мл в КФ различных генотипов B.anthracis, в то время как эритроцитарный диагностикум, полученный на основе иммуноглобулинов антисыворотки к фракции 5 КФ B.anthracis СТИ, был активен только с КФ токсинпродуцирующего штамма с чувствительностью 0,75 мкг белка в 1 мл.

Результаты изучения физических, биологических, антигенных свойств дали основание считать, что фракция I КФ B.anthracis 81/ITR представлена высокомолекулярным соматическим антигеном, а антисыворотка и эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум пригодны для идентификации различных генотипов B.anthracis.

Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа.

Пример I. Получение бесклеточного культурального фильтрата B.anthracis 81/ITR.

Суточные агаровые культуры B.anthracis 81/ITR и B.anthracis СТИ засевали раздельно в десять 500 мл колб с 200 мл R-среды (Ristrooh J.D., Ivins В. Elaboration of Bacillus anthracis antigens in a new, defined culture medium. Inf/ Immun. - 1983. - V.39, №1. - P. 483-486) до содержания 10⁴-10⁵ м.к./мл. Выращивали при 37C с шуттелированием в течение 22 ч. После выращивания клетки удаляли фильтрованием КФ через фильтр ДР 045 (фирма "Amicon”). Бесклеточные культуральные фильтраты проверяли на стерильность посевом на плотные и жидкие питательные среды, которые инкубировали в течение суток при 37С. Концентрировали КФ (1800 мл) на установке ДС2 с волоконным фильтратом HLP 10 и на ультрафильтре РМ10 в 150 раз (до 12 мл).

Концентрация белка в концентрированных фильтратах соответствовала 8-10 мг/мл.

Пример 2. Разделение гель-хроматографией компонентов КФ B.anthracis 81/ITR.

Разделение компонентов B.anthracis 81/ITR и B.anthracis СТИ осуществляли в колонке 20720 мм со сверхтонким сефакрилом S 300, который уравновешивали 0,2 М NaCl с 0,025 М трис-НСl буфером рН 8,4, при скорости элюции 25 мл/ч.

В колонку вносили 2,5 мл КФ, выход фракций регистрировали при Y=280 нм с помощью спектрофотометра Uvicord S II (LKB, Швеция).

При разделении обоих фильтратов фракции элюировались в виде четырех неодинаковых по высоте пиков.

При разделении КФ B.anthracis 81/ITR основная масса белковых компонентов элюировалась в первом пике (фракция I) - высота пика 38 мА. При разделении КФ B.anthracis СТИ наиболее высоким оказался 5-й пик (фракция 5) - высота пика 28 мА. В обоих случаях высота других пиков, в том числе I пика КФ B.anthracis СТИ, не превышала 4-10 мА.

Следовательно, содержание белковых компонентов во фракции 1 КФ B.anthracis 81ATR более чем в 9 раз было выше по сравнению с фракцией 1 B.anthracis СТИ (фиг.1).

Сконцентрированные до объема разделенного КФ (12 мл) на РМ 10 1 фракция B.anthracis 81/ITR содержала белок 720 мкг/мл, 3 фракция B.anthracis СТИ - 850 мкг/мл.

Пример 3. Биологическая характеристика 1 фракции КФ B.anthracis 81ATR.

Морским свинкам внутрикожно вводили по 0,1 мл концентрированной 1 фракции B.anthracis 81/ITR и 5-й фракции КФ B.anthracis СТИ. Утолщение кожной складки более чем в 2 раза и покраснение кожи через сутки отмечали в месте введения 5-й фракции.

Для установления протективных свойств морским свинкам двукратно через 2 недели вводили по 100 и 150 мкг 1 фракции B.anthracis 81/ITR и 5 фракции B.anthracis СТИ с неполным адъювантом Фрейнда. Фракции вводили внутримышечно: первый раз - в правый пах, второй раз - в левый пах. Заражали животных 21 день после последнего введения вакцины. В область правого паха вводили 3000 и 30000 спор B.anthracis 81/1 (ДСL 25 спор).

Животные, иммунизированные 1 фракцией B.anthracis 81ATR, пали на 2-3 сут от обеих заражающих доз. Животные, иммунизированные 5 фракцией B.anthracis СТИ, выжили (5 из 6 зараженных).

Полученные результаты по биологической характеристике свидетельствуют о том, что антигены 1 фракции B.anthracis 81ЯТК не относятся к компонентам сибиреязвенного токсина - протективному антигену и отекогенному фактору.

Пример 4. Получение антисывороток к антигенам 1 фракции 81/1 TR.

Одним кроликам породы “Шиншилла” весом 2,5-3 кг вводили возрастающие дозы 1 фракции B.anthracis 81/ITR, другим - 5 фракции B.anthracis СТИ - от 250 до 750 мкг на животное. Фракции вводили с гидроокисью алюминия (AluGel, Serva) через две недели, внутрикожно, вдоль позвоночного столба и внутримышечно - в оба паха. Активность сывороток определяли в РИД с культуральными фильтратами. Использовали сыворотки иммунизированных животных при титре 1:8-1:16.

Пример 5. Идентификация антигенов 1 фракции B.anthracis 81/ITR в РИД

Идентификацию антигенов 1 фракции B.anthracis 81/ITR в РИД проводили с КФ B.anthracis 81/ITR и B.anthracis СТИ. Для установления оптимального соотношения антигенов и антител использовали цельные и разведенные КФ и сыворотки, полученные против антигенов 1 и 5 фракций.

Проведенные исследования показали, что антисыворотка к антигену фракции 1 B.anthracis 81/ITR обнаруживает антиген, который не идентичен антигенам, выявляемым антисывороткой к фракции S B.anthracis СТИ (фиг.2).

Пример 6. Идентификация антигенов фракции 1 B.anthracis 81/ITR в реакции непрямой гемагглютинации.

Иммуноглобулины из антисывороток к антигенам фракции 1 и 5 выделяли с использованием сульфата аммония и применяли их для сенсибилизации 2,5% взвеси формализированных танизированных бараньих эритроцитов. Оптимальная сенсибилизирующая доза иммуноглобулинов антисыворотки к фракции 1 составляла 500 мкг/мл (диагностикум I), иммуноглобулинов к фракции 3-700 мкг/мл (диагностикум 5).

Чувствительность и специфичность иммунодиагностикумов проверяли с КФ различных генотипов B.anthracis, которые отличались содержанием плазмид вирулентности.

Примечение: 0 - отрицательный результат с КФ в разведении 1:20

Как следует из данных таблицы, наличие антигенов, содержащихся во фракции 1 B.anthracis 81/ITR, не связано с плазмидами вирулентности (рХО1 и рХО2), а наличие антигенов, содержащихся во фракции 5 B.anthracis СТИ, обусловлено плазмидой, ответственной за токсинопродукцию.

Таким образом, культивирование в жидкой питательной среде определенного химического состава бесплазмидного штамма B.anthracis 81/ITR (tox^-, cap⁺), в отличие от токсинпродуцирующего штамма B.anthracis СТИ (tox⁺, cap^-), обуславливает более высокий выход белкового компонента, который по физическим, биологическим и антигенным свойствам может быть отнесен к высокомолекулярному дискретному соматическому антигену.

Этот антиген и антисыворотка к нему могут быть использованы для дальнейшего изучения антигенной структуры сибиреязвенного микроба и идентификации различных штаммов B.anthracis.