способ лечения ожоговых ран на основе применения культивированных клеток

Формула изобретения

Способ лечения ожоговых ран на основе применения культивированных клеток, включающий хирургическую обработку и покрытие раны культурой клеток, проведение аутодермопластики после приживления трансплантата с использованием расщепленного сетчатого лоскута, отличающийся тем, что в качестве исходного материала для культивирования клеток используют штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81), подготовленную культуру клеток используют либо в виде взвеси, либо выращенную на подложке из биосинтетического покрытия, аутодермопластику проводят расщепленным сетчатым лоскутом толщиной 0,25 мм с перфорацией 1/4:1/6.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для лечения ожогов путем применения культивированных клеток для закрытия дефектов кожи.

Ожоговый травматизм является важной медицинской и социальной проблемой. Общая летальность от ожогов в целом по России колеблется от 2,3 до 3,6%. Из 180-200 тысяч пострадавших, госпитализируемых в лечебные учреждения России, погибают ежегодно 8-10 тысяч человек.

При этом 85 - 90% - это люди трудоспособного возраста и дети (Азолов В.В. и др. Состояние и перспективы развития комбустиологии в России - ж. Комбустиология, 1999, №1).

Тяжесть течения и длительность лечения пострадавших от термических поражений делает актуальными такие задачи, как разработка новых покрытий, заменяющих кожу, либо ускоряющих эпителизацию аутотрансплантированных лоскутов. Перспективным направлением в решении этого вопроса является применение культивируемых in vitro клеток кожи, использование культивированных фибробластов и др. методы.

Известны методы лечения обожженных с применением выращенных in vitro клеток кожи. Культивирование и трансплантация многослойных пластов аутологичных кератиноцидов на раны позволяет решить сложную проблему дефицитных донорских ресурсов кожи у пострадавших с обширными и субтотальными глубокими ожогами (ж.“Онтогенез”, 1998, 29, №6, с.474-475).

Известен аллотрансплантат кожи человека, используемый для лечения ожогов и ран в качестве биологической “повязки” (пат. США №5697383, А 61 В 19/00, НКИ 128/898, публ. 16.12.97).

Известен способ лечения ожоговых ран на основе применения культивированных клеток, а именно фибробластов (“Военно-медицинский журнал”, 1991, №10, с.62-63).

Известен способ лечения раны, включающий хирургическую обработку и покрытие раны культурой клеток фибробластов человека (пат. РФ №2023424, А 61 В 17/322, С 12 N 5/00) - прототип.

После приживления фибробластов проводят аутодермопластику, для чего используют расщепленный сетчатый лоскут с перфорацией 1:6 и более, для аутодермопластики используют культуру эпидермоцитов.

Недостатками рассмотренных способов лечения ожоговых ран на основе применения культивированных клеток являются:

либо длительные сроки изготовления трансплантата (например, при использовании кератиноцитов);

либо слабый лечебный эффект из-за медленного приживания при трансплантации на ожоговые раны.

Целью изобретения является обеспечение возможности быстрого изготовления трансплантатов и повышение эффективности лечения.

Для решения поставленной задачи предлагается способ лечения ожоговых ран на основе применения культивированных клеток, включающий хирургическую обработку и покрытие раны культурой клеток, проведение аутодермопластики после приживления трансплантата с использованием расщепленного сетчатого лоскута, отличающийся тем, что в качестве исходного материала для культивирования клеток используют штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81), подготовленный трансплантат используют либо в виде взвеси, либо на подложке из биосинтетического покрытия, после закрытия ожоговой раны проводят аутодермопластику расщепленным лоскутом толщиной 0,25 мм с перфорацией 1/4-1/6.

Способ реализуется следующим образом.

Используется штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4 (81) (а.с. №1147748), зарегистрированного в качестве оригинального и сохраняемого в низкотемпературном банке - музее Екатеринбургского научно - исследовательского института вирусных инфекций Минздрава Здравоохранения Российской Федерации. (ЕНИИВИ МЗРФ).

Клетки выращены в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ.

Подготавливают взвесь клеток фибробластов из расчета 60000-80000 клеток на 1 мл среды роста. В качестве среды роста используют среду ИГЛА-МЕМ с добавлением 10%-ной сыворотки крови плодов крупного рогатого скота (КРС) с рН среды роста 7,2-7,4.

Культура клеток представляет собой морфологически однородную популяцию клеток, сохраняющую стабильный кариотип (2n не менее 75% клеток).

Препарат может быть использован либо в виде монослойной культуры (взвеси), либо в виде клеток на синтетической подложке (“Фолитерм”, “Биоколл”, “Полипор” и т.п.)

Монослойная культура имеет вид морфологически однородного слоя клеток, прикрепленных к стеклу (предметное стекло, чашки Петри) и покрытых прозрачной питательной средой.

Культуральная взвесь представляет собой мутную жидкость красновато-оранжевого цвета, содержащую 500-600 тыс. клеток в 1 мл.

Препарат в виде монослоя клеток на синтетической подложке представляет собой пленочное синтетическое покрытие для ран общей площадью 60-80 см², на поверхности которого выращены клетки с плотностью 80-100 тыс. на 1 см². Покрытие и клетки находятся в прозрачной культуральной среде и хранятся в стандартных флаконах для кровезаменителей объемом 250 мл.

Экспериментальное использование культуры этих аллофибробластов при лечении глубоких термических поражений было проведено на базе детского ожогового отделения городской детской больницы №9 г. Екатеринбурга. Пролечено 12 больных с термическими поражениями III-IV степени с общей площадью поражения от 4 до 56%. Культура аллофибробластов применялась либо в виде взвеси, либо на подложке на основе биосинтетического покрытия “Полипор”.

Подготовку раны проводили путем некрэктомии - в сроки до 5 суток при обширных глубоких ожогах, либо проводили предоперационную резекцию грануляционной ткани. Проводили бактериоскопию раны. Показания к операции: титр микробных антител не более 100000 на 1 грамм ткани.

Аллофибробласты извлекали из куртуральной среды 199, центрифугировали при 2500 об/мин в течение 5 минут, затем клетки ресуспендировали в физиологическом растворе.

Взвесь переносили на подготовленную рану в концентрации 50-60 тыс. клеток на 1 см², затем проводили аутодермопластику расщепленным лоскутом толщиной 0,25 мм с перфорацией 1/4-1/6.

Перевязку производили на следующие сутки, и далее - по мере необходимости.

В случае использования культуры клеток на подложке матриксы с культивированными аллофибробластами извлекают из чашек Петри пинцетом и накладывают на раневую поверхность стороной с фиксированным слоем фибробластов. При этом матриксы плотно располагают один к другому.

Раневую поверхность после наложения матриксов закрывают повязкой, состоящей из двух слоев: парафинизированной сетки и влажно-высыхающих повязок. В качестве раствора используют 500 мл фурацилина 1:5000, антибиотик, согласно чувствительности бактерий при посеве с раневой поверхности, в количестве 1 г и 125 мг гидрокортизоновой эмульсии.

Положительные результаты получены в 92% случаев. Отмечено достоверное сокращение сроков эпителизации ран на 20%. В группе детей с локальными глубокими поражениями отмечено достоверное сокращение койко - дней на 10%. Во всех случаях не получено аллергических и других общих и местных патологических реакций.

При наблюдении за пациентами в отдаленный период не обнаружено каких-либо патологических сдвигов в развитии органов и систем.

Таким образом, использование предложенного способа позволяет повысить эффективность лечения тяжелых больных с термическими травмами, с длительно незаживающими гранулированными ранами. Кроме того, предложенный способ позволяет решить задачу острого дефицита донорских ресурсов кожи.