способ оценки эффективности антибактериальной терапии c. pneumoniae у больных бронхиальной астмой

Формула изобретения

Способ оценки эффективности антибактериальной терапии С. pneumoniae у больных бронхиальной астмой путем иммунологического анализа периферической крови, отличающийся тем, что определяют методом непрямой иммунофлюоресценции субпопуляционый состав лимфоцитов и при содержании СD4+-лимфоцитов менее 36,67% и СD95-лимфоцитов менее 57,95% через 3-4 недели после окончания лечения антибактериальную терапию, направленную на эрадикацию возбудителя, считают эффективной.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, иммунологии.

Известен способ оценки эффективности антибактериальной терапии С. pneumoniae методом иммуноферментного анализа, который основан на определении титров антител в сыворотке крови больных к родоспецифичным белкам наружной мембраны хламидийной клетки IgG, IgM, IgA. Метод позволяет определить стадию заболевания, обосновать необходимость антибактериального лечения и оценить его эффективность. При этом по антителам в сыворотке крови IgM и IgG или IgA и IgG в диагностических титрах судят о наличии острой инфекции. По сравнению с микробиологическим методами исследования, ИФА обладает преимуществом автоматизации и высокой пропускной способности. Время проведения теста 4-6 часов. Для оценки достоверности результатов ИФА не требуется применения высококвалифицированной экспертизы, что и послужило одной из причин широкого использования этих тестов для эпидемиологической оценки распространенности респираторного хламидиоза (Кротов С.А., Кротова В.А., Юрьев С.Ю. Хламидиозы: эпидемиология, характеристика возбудителя, методы лабораторной диагностики, лечение генитального хламидиоза. - Кольцово. ЗАО “Вектор-Бест”. - 2000. - 68 с.

Недостатки и ограничения. Требует специального оснащения и навыков в работе с иммуноферментными диагностическими системами, относительно невысокая специфичность. Кроме того, у больных с гипогаммаглобулинемией уровень антител может не достигать диагностического, а у некоторых больных после окончания курса антибактериальной терапии в крови держится диагностический уровень антител в течение длительного времени (до 4-6 мес).

Этиотропное лечение хламидийной инфекции (антибактериальная терапия) не всегда приводит к полной эрадикации возбудителя из организма. Кроме того. доступные специфические методики выявления возбудителя могут давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты обследования. На сегодняшний день отсутствуют критерии, учитывающие состояние иммунной системы при хламидийной инфекции, роль которой в патогенезе заболевания велика.

Сущность изобретения состоит в том, что в периферической крови больных бронхиальной астмой на фоне инфицированности Chlamydophila pneumoniae определяют методом непрямой иммунофлюоресценции субпопуляционный состав лимфоцитов и при снижении содержания CD4+-лимфоцитов менее 36,67% и СD95-лимфоцитов менее 57,95% через 3-4 недели после окончания лечения антибактериальную терапию, направленную на эрадикацию возбудителя, следует считать эффективной, т.к. у больных имеется положительная клиническая динамика (улучшение общего самочувствия, исчезновение кашля, экспираторной одышки, при аускультации - исчезновение хрипов в легких).

Способ осуществляется следующим образом. Из пробы (4-5 мл) гепаринизированной крови, взятой натощак у больных бронхиальной астмой до антибактериальной терапии и через 3-4 недели после окончания, выделяли лимфоциты на градиенте фиколл-верографина, затем 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносили в лунки 96-луночпого круглодонного планшета. К клеткам добавляли 5 мкл тестируемых моноклональных антител (CD4, CD95) и инкубировали 30-45 мин при +4°С. Затем добавляли 150 мкл раствора Хенкса и центрифугировали 5 мин при 200 g. После удаления супернатанта вносили 50 мкл раствора Хенкса, клетки суспендировали, добавляли 150 мкл раствора Хенкса и центрифугировали 5 мин при 200 g. К осадку отмытых клеток добавляли 50 мкл F(аb~)₂ - фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100 (для разведения использовали раствор Хенкса, содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия). Клетки суспендировали и инкубировали 30 мин при +4°С, затем клетки 2 раза отмывали, как указано выше. Окрашенные клетки анализировали с помощью люминесцентного микроскопа. Клетки суспендировали, переносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и препарат просматривали под иммерсией с увеличением (3; объектив 90). Количество антигенпозитивных клеток определяли как % флюоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флюоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали препараты, подготовленные аналогичным образом, но без обработки моноклональными антителами.

До лечения содержание СD4-лимфоцитов у больных бронхиальной астмой на фоне инфицированности С. pneumoniae составляло от 37,01% до 40,43%, a CD95-лимфоцитов от 81,47 до 94,67%, а через 3-4 недели после антибактериальной терапии, направленной на эрадикацию С. pneumoniae, содержание CD4 и CD95 лимфоцитов снижалось и составляло менее 36,67% и менее 57,95% соответственно, р<0,05, что позволило считать проведенную терапию эффективной.

Поэтому иммунологические критерии оценки эффективности антибактериальной терапии хламидийной инфекции являются более доступными и достоверными, позволяющими оценить результаты терапии уже через 3-4 недели от последнего приема антибактериального препарата.

Пример 1. Больная Е., 4 лет. Мать обратилась с жалобами на периодические приступы удушья, возникающие по ночам. Больна в течение 2 лет. При объективном исследовании выявляется одышка экспираторного характера, перкуторно - коробочный оттенок перкуторного звука, при аускультации - ослабление дыхания, рассеянные сухие хрипы над всей поверхностью легких. В общем анализе крови отмечается эозинофилия, в иммунограмме - повышение содержания общего IgE в сыворотке крови до 138,7 МЕ/мл. Содержание CD4 и CD95 лимфоцитов составило 42 и 88% соответственно. Также выявлено содержание IgM в титре 1:200 (положительный) и IgG в титре 1:20 (диагностический) к С. pneumoniae. Больная получала антибактериальную терапию рокситромицином в возрастной дозе в течение 10 дней. Отмечалась положительная клиническая динамика: улучшение общего самочувствия, исчезновение одышки и сухих хрипов в легких. Через 3 недели при контрольном обследовании было выявлено содержание CD4 и CD95 лимфоцитов 34 и 56% соответственно при отсутствии антител к С. pneumoniae.

Пример 2. Больная К., 5 лет. Мать обратилась с жалобами на приступы ночного кашля. Наблюдаются у педиатра в течение 1 года. Следует отметить наследственную отягощенность со стороны матери (бронхиальная астма) и наличие у ребенка сопутствующего атопического дерматита. При объективном исследовании выявляется одышка экспираторного характера, перкуторно - коробочный оттенок перкуторного звука, при аускультации - ослабление дыхания, рассеянные сухие хрипы над всей поверхностью легких. В общем анализе крови отмечается эозинофилия, в иммунограмме - повышение содержания общего IgE в сыворотке крови до 179,9 МЕ/мл. Содержание CD4 и CD95 лимфоцитов составило 41 и 92% соответственно. Также выявлено содержание IgM в титре 1:200 (положительный) и IgG в титре 1:40 (диагностический) к С. pneumoniae. Больная получала антибактериальную терапию рокситромицином в возрастной дозе в течение 10 дней. Отмечалась положительная клиническая динамика: улучшение общего самочувствия, исчезновение одышки и сухих хрипов в легких. Через 4 недели при контрольном обследовании было выявлено содержание CD4 и CD95 лимфоцитов 35 и 51% соответственно при отсутствии антител к С. pneumoniae.

Всего указанным способом обследовано 120 детей раннего и дошкольного возраста с бронхиальной астмой легкой степени, из них 67 была выявлена ассоциация с С. pneumoniae, у 18 из которых после лечения нормализовались показатели иммунной системы. Отсутствие возбудителя подтверждали отсутствием антител IgM и IgG в сыворотке крови, определяемого методом иммуноферментного анализа.

В норме содержание CD4 и CD95 лимфоцитов составляет 39±5% и 52±11% соответственно.

Предлагаемый способ прост и информативен. Он позволяет быстро и объективно в течение 2,5 часов после взятия крови оценить состояние иммунной системы при хламидийной инфекции (С. pneumoniae), ассоциированной с бронхиальной астмой, что важно для установления необходимости дальнейшего лечения, выбора препарата и оценки эффективности антибактеральной терапии.

Способ оценки эффективности антибактериальной терапии Chlamydophila pneumoniae у больных бронхиальной астмой.

Динамика изменения содержание CD4+ и СD95+-лимфоцитов в периферической крови больных бронхиальной астмой после эффективной антибактериальной терапии приведена в таблице.