способ определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных

Формула изобретения

Способ определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран эритроцитов сельскохозяйственных животных (СХЖ), включающий получение осадка эритроцитов из венозной крови, проведение полного водного гемолиза эритроцитов, получение мембран с помощью центрифугирования, приготовления опытных образцов на основе водной взвеси мембран и исследования ПОЛ в присутствии и без присутствия в опытной пробе прооксидантов: раствора соли Мора, аскорбиновой кислоты, а также осаждением трихлоруксусной кислотой (ТХУ), с последующим проведением цветной реакции с тиабарбитуровой кислотой (ТБК) для измерения оптической плотности при 532 или 540 нм и расчетом результатов, отличающийся тем, что гемолиз эритроцитов проводят ледяной водой, в качестве опытных образцов берут взвесь эритроцитов в 6,7 раза меньше по объему, чем в стандартном методе, для проведения цветной реакции используют горячую ТБК, а расчет скорости образования продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов СХЖ производят по формуле

и ,

где Х1 - скорость образования малонового диальдегида (МДА) в присутствии прооксидантов (индуцированное ПОЛ);

Х2 - скорость образования МДА в отсутствии прооксидантов (спонтанное ПОЛ), в нмоль/ч;

0,156 - уровень экстинкции 1 нмоль МДА при 532 нм;

Е1 и Е2 - оптическая плотность соответственно с добавлением и без добавления прооксидантов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к гематологии, а именно к лабораторньм способам определения скорости перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных.

Существует способ определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов, который основан на измерении содержания образующегося при окислении мембранных липидов малонового диальдегида (МДА) по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (Строев Е.М., Макарова В.Г. "Практикум по биологической химии": Учебное пособие для фармац. вузов и фак. -М: Высш. шк., 1986.-С.211-213). Указанный способ был взят в качестве прототипа.

Способ включает получение осадка эритроцитов путем центрифугирования образцов крови; 3-кратную промывку осадка эритроцитов физиологическим раствором хлористого натрия и переосаждение в том же режиме центрифугирования; проведение полного гемолиза эритроцитов путем добавления к 0,5 мл осадка эритроцитов равного объема дистиллированной воды и выдерживания в течение 30 мин; получение образцов мембран эритроцитов из гемолизированных эритроцитов с помощью центрифугирования и осторожного отбора пипеткой надосадочной жидкости с серой прослойкой мембран эритроцитов; подготовку трех опытных образцов: в первую пробирку вносят по 0,3 мл раствора соли Мора (4х10^-5 М свежеприготовленный раствор), трис-буфера (трис-НСl буфер, 0,04 М раствор с рН 7,4), аскорбиновой кислоты (2,6 мМ свежеприготовленный раствор) и 0,1 мл полученной взвеси мембран эритроцитов, во вторую пробирку приливают 0,3 мл трис-буфера, 0,6 мл дистиллированной воды и 0,1 мл взвеси мембран эритроцитов, в третью (контроль) добавляют те же реактивы, что и в первую пробирку, после чего сразу приливают 1 мл трихлоруксусной кислоты. Далее инкубируют образцы 20 мин в водяной бане при 37С, останавливают реакцию, добавляя в обе опытные пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, все пробы центрифугируют, сливают надосадочную жидкость (2 мл), прибавляют по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещают образцы на 10 мин в кипящую водяную баню и охлаждают в ледяной воде. Измеряют величину оптической плотности полученных проб против контроля на спектрофотометре при длине волны 532 нм или фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см и рассчитывают скорость перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов по формулам

и ,

где X1 - скорость образования в пробе МДА в присуствии прооксидантов: соли Мора и аскорбиновой кислоты (индуцированное перекисное окисление липидов), нмоль в час; Х2 - скорость образования в пробе МДА в отсуствии прооксидантов (спонтанное перекисное окисление липидов), нмоль в час; 3 - объем пробы, мл; 6 - коэффициент пересчета на 1 час; 0,156 - экстинция 1 нмоля малонового диальдегида при 532 нм; Е1 и Е2 - оптическая плотность соответственно первой и второй проб против контроля.

Недостатком этого способа является то, что при его использовании для определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных отмечено появление осадка (взвеси) после взаимодействия находящихся в сливе веществ с тиобарбитуровой кислотой, что сказывается на результатах измерения оптической плотности. При этом отсутствует повторяемость результатов при анализе одной и той же пробы.

Задачей настоящего изобретения является подбор оптимального объема образцов мембран эритроцитов сельскохозяйственных животных, который может быть использован для инкубации, и уточнение условий проведения последующих этапов для выявления продуктов реакции перекисного окисления липидов, что в итоге позволит обеспечить повторяемость результатов определения продуктов реакции и повысить точность. В этом состоит технический результат.

Технический результат изобретения достигается за счет проведения водного гемолиза эритроцитов ледяной водой, уменьшения объема взвеси эритроцитов в опытных образцах (в 6,7 раза по сравнению с прототипом), использования горячей тиабарбитуровой кислоты для проведения цветной реакции и уточнения формулы расчета результата.

Способ осуществляется следующим образом:

- получают кровь из яремной вены животных с использованием антикоагулянта;

- кровь центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, осаждая эритроциты;

- полученный осадок эритроцитов промывают 0,9% раствором хлористого натрия до исчезновения окраски в надосадочной жидкости и переосаждают в том же режиме центрифугирования;

- осуществляют полный гемолиз эритроцитов: в чистую центрифужную пробирку отбирают по 0,5 мл осадка эритроцитов и приливают из пипетки сильной струей равный объем охлажденной до 0С дистиллированной воды и оставляют стоять в течение 30 мин;

- получают образцы мембран эритроцитов - пробы центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин, осторожно отсасывают надосадочную жидкость с серой прослойкой мембран эритроцитов и переносят в чистую пробирку;

- осуществляют инкубацию образцов мембран эритроцитов - на каждый образец мембран готовят 3 пробирки: в первую пробирку вносят по 0,6 мл раствора соли Мора (4х10^-5 М свежеприготовленный раствор), аскорбиновой кислоты (2,6 мМ свежеприготовленный раствор), 0,77 мл трис-буфера (трис-НСl буфер, 0,04 М раствор с рН 7,4), и 0,03 мл полученной взвеси мембран эритроцитов; во вторую пробирку приливают 0,77 мл трис-буфера, 0,03 мл взвеси мембран эритроцитов и 1,2 мл дистиллированной воды; в третью (контроль) добавляют те же реактивы, что и в первую пробирку, после чего сразу приливают 2 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты; подготовленные пробы помещают в термостатат и инкубируют в течение 20 мин при 37С;

- останавливают реакцию путем добавления в опытные пробирки по 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты;

- проводят подготовку содержимого проб для цветной реакции - все образцы центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин, затем осторожно пипеткой с удлиненным концом отбирают надосадочную жидкость;

- осуществляют цветную реакцию: отмеряют по 3,0 мл полученной надосадочной жидкости в теплые пробирки, в каждую из которых прибавляют по 1,5 мл 0,8% свежеприготовленного горячего раствора тиобарбитуровой кислоты, и помещают пробы на 10 мин в кипящую водяную баню. После инкубации пробирки охлаждают в ледяной воде;

- измеряют величину оптической плотности опытных проб против контроля на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см и рассчитывают скорость образования конечного продукта перекидного окисления липидов - малонового диальдегида по формулам

и ,

где X1 - скорость образования в пробе МДА в присуствии прооксидантов - соли Мора и аскорбиновой кислоты (индуцированное перекисное окисление липидов), нмоль в час; Х2 - скорость образования в пробе МДА в отсуствии прооксидантов (спонтанное перекисное окисление липидов), нмоль в час; 4,0 - общий объем среды для инкубации полученных образцов мембран, мл; 3,0 - объем пробы для проведения цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой, мл; 4,5 - объем пробы, мл, взятый для фотометрирования; 6 - коэффициент пересчета на 1 час; 0,156 - экстанция 1 нмоль МДА при 532 нм; Е1 и Е2 - оптическая плотность соответственно первой и второй проб против контроля.

Эксперименты по определению скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных проводили на телочках двух-шестимесячного возраста фермы Выльгородской научно-экспериментальной станции Коми научного центра УрО РАН (г. Сыктывкар).

Пример 1. В ходе проведения экспериментов было отмечено, что содержимое проб после реакции тиобарбитуровой кислоты с продуктами, которые образовывались после инкубации пробы мембран эритроцитов телочек из расчета 0,1 мл на 1,0 мл инкубационной среды или 0,2 мл на 2,0 мл среды при 37С в течение 20 мин, был мутным и содержал частички осадка. Появление осадка в пробе сказывалось на результатах анализа при фотометрировании. Поэтому было проведено исследование скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в образцах мембран эритроцитов у телочек в зависимости от изменения объема свежеполученных образцов мембран, взятого для проведения инкубации. Получили, что максимальная скорость образования продуктов перекисного окисления липидов или малонового диальдегида наблюдается при добавлении в инкубационную среду объемом 2,0 мл 0,03 мл препарата мембран эритроцитов (табл. 1).

Пример 2. В ходе проведения экспериментов доказана необходимость в проведении аккуратного отбора надосадочной жидкости после остановки реакции образования продуктов перекисного окисления липидов в образцах мембран эритроцитов животных добавлением в инкубационную среду 40% трихлоруксусной кислоты и их последующем центрифугировании в течение 15 мин. Отмечено, что после прохождения этой реакции на стенках пробирок появляется легкий сероватый налет, который при сливе содержимого из пробирок легко попадает в надосадочную жидкость. В связи с этим величины скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в 1,5-3,0 раза превышают показатели, полученные при аккуратном отборе проб (табл. 2).

Пример 3. При использовании способа, взятого в качестве прототипа для определения скорости образования продуктов реакций перекисного окисления липидов, отмечается разброс в величинах при параллельном исследовании одной пробы мембран (табл. 3, животные №№1 и 2). Предлагаемый нами способ обеспечивает оптимальную вероятность совпадения результатов, полученных при анализе одних и тех же образцов мембран эритроцитов у животных (табл. 3, животные №№3-6).

Примечание: * - для определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов телочек использовали способ, взятый в качестве прототипа

Пример 4. Способ для определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных использовали для выявления продуктов перекисного окисления липидов в образцах мембран эритроцитов телочек, содержащихся с первого дня жизни в разных условиях двигательной нагрузки: принудительного движения на установке с движущим полом - дважды в день по 30 мин со скоростью 20 м в минуту или на свободном содержании. Получили, что скорость образования ТБК-активных продуктов в мембранах эритроцитов телочек 125-дневного возраста, находящихся с первого дня жизни в условиях принудительного движения, в 3,5 раза и более превышает скорость образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов у телочек 107-дневного возраста, содержащихся с первого дня жизни в стандартных клетках на свободном содержании (табл. 4.).

Таким образом, предлагаемый способ определения скорости перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных может быть использован для выявления особенностей функционирования эритроцитарных мембран животных в процессе адаптации их организма к изменению условий содержания (влияние интенсивности двигательной нагрузки, температурного режима, включение новых кормов в рацион и т.д.).