способ получения сорбента для определения гликозилированных белков крови

Формула изобретения

1. Способ получения сорбента для определения гликозилированных белков крови, включающий стабилизацию поливинилового спирта глютаровым альдегидом и иммобилизацию раствором аминофенилборной кислоты, отличающийся тем, что стабилизированный поливиниловый спирт окисляют перманганатом щелочного металла в щелочной среде, а затем иммобилизацию раствором аминофенилборной кислоты ведут в присутствии конденсирующего агента.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для иммобилизации используют раствор аминофенилборной кислоты в воде, органическом растворителе или их смеси.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве конденсирующего агента используют N,N"-дициклогексилкарбодиимид, 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид, мето-п-толуолсульфонат или хлоргидрат, 1,1"-карбонилдиимидазол, 1-этил-3(3-диметиламинопропил) карбодиимид или N-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области химии, в частности к способам получения аффинных сорбентов и их использованию в хроматографии.

Известен способ получения сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина, в соответствии с которым раствор поливинилового спирта (ПВС) окисляют перйодатом натрия и проводят реакцию с раствором глутарового альдегида при рН 1 и температуре 37С в течение 48 ч. Полученный продукт обрабатывают раствором аминофенилборной кислоты (АФБК) в карбонатном буфере при рН 9,6 в течение 18 часов при комнатной температуре (патент РФ №2093525, опубл. 20.10.97, МПК⁶ C 08 F 30/60).

Недостатками известного способа являются сложность и длительность процесса, а также способность полученного сорбента окисляться и окрашиваться в процессе использования, что не позволяет осуществлять визуальный контроль разделения гликозилированного и негликозилированного гемоглобина.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ (прототип) получения сорбента, включающий смешение 8-12% раствора поливинилового спирта с 26% водным раствором глутарового альдегида при их объемном соотношении (4,5-5,5):1, добавление концентрированной соляной кислоты до рН 1,0±0,1, обработку полученного носителя раствором аминофенилборной кислоты в фосфатном буфере при рН 7,4±0,5, в течение 10-14 часов, добавление боргидрида натрия в течение 4 часов, добавление хлоргидратагидроксиламина, выдержку в течение 10-14 часов и отделение сорбента. При этом процесс ведут до содержания связанного бора в сорбенте 0,37-0,45 мас.% (патент РФ №2094117, опубл. 1997.10.27, МПК⁶ B 01 J 20/30).

Недостатками способа-прототипа являются длительность процесса, использование повышенного количества АФБК, а также появление окраски на сорбенте в процессе использования за счет протекания процесса окисления, что не позволяет осуществлять более 20 анализов на 1 мл сорбента.

Задачей изобретения является разработка способа получения сорбента для определения гликозилированных белков крови на основе поливинилового спирта, сшитого глутаровым альдегидом с иммобилизованной аминофенилборной кислотой, характеризующегося высокой разделительной способностью и обладающего повышенной устойчивостью к окислению, а также сокращение расхода АФБК.

Поставленная задача решается описываемым способом получения сорбента, включающим стабилизацию ПВС водным раствором глутарового альдегида, окисление полученного продукта перманганатом щелочного металла в щелочной среде и последующую иммобилизацию раствором аминофенилборной кислоты в присутствии конденсирующего агента.

При этом окисление ПВС, стабилизированного глутаровым альдегидом, проводят перманганатом щелочного металла, взятым в количестве 2,5-12,5 мас.% относительно исходного ПВС в течение 10-14 часов, а модификацию окисленного продукта ведут раствором АФБК (взятой в количестве 3-15 мас.% относительно исходного ПВС) в присутствии конденсирующего агента (1-60 мас.% относительно исходного ПВС) в слабокислой среде.

В качестве конденсирующего агента используют N,N"-дициклогексилкарбодиимид, 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид мето-п-толуолсульфонат или хлоргидрат, 1,1"-карбодиимидазол, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид или N-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин, а для иммобилизации используют раствор аминофенилборной кислоты в воде, органическом растворителе или их смеси.

Выше приведены предпочтительные соотношения между компонентами, конкретные условия проведения процесса иммобилизации определяются, в частности, выбором конденсирующего агента.

Сущность процесса заключается в том, что в результате сшивки поливинилового

спирта [-СН₂-СН(ОН)-]_n с глутаровым альдегидом СНО-(СН₂)₃-СНО получают фрагмент матрицы носителя, содержащей, наряду с мостиковыми сшивками глутарового альдегида, остатки глутарового альдегида, прореагировавшего только одной альдегидной группой. Последующее окисление этих альдегидных групп и присутствующих в исходном поливининиловом спирте фрагментов с расположеннными рядом гидроксильными группами, перманганатом щелочного металла приводит к образованию на их месте карбоксильных групп. Затем на носитель иммобилизуют с помощью конденсирующего агента аминофенилборную кислоту:

[-СООН+NН₂-(С₆Н₄)-В(ОН)₂ конденсирующий агент]-СО-NН-(С₆Н₄)-В(ОН)₂+Н₂O

Заявляемый способ позволяет получить устойчивый к окислению сорбент, который, несмотря на небольшое содержание бора (0,08-0,2 мас.%), позволяет обеспечить высокую разделительную способность при определении гликозилированных белков крови, например, гемоглобина или альбумина, минимизируя при этом затраты АФБК.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

а. Получение ПВС, стабилизированного глутаровым альдегидом.

К 100 г ПВС-16/1 приливают 1000 мл воды и нагревают при перемешивании при 80С до полного растворения ПВС, после чего раствор охлаждают при перемешивании.

К раствору ПВС добавляют соляную кислоту до рН 1 и помещают в колбу с мешалкой, а затем начинают интенсивно перемешивать. При интенсивном перемешивании добавляют 350 мл 25% раствора глутарового альдегида. Смесь интенсивно перемешивают 12 часов, затем отфильтровывают полимер, промывают его водой до исчезновения запаха альдегида.

Полученный полимер дробят, промывают водой до нейтральной реакции, растирают на 0,1 мм сите и отфильтровывают через плотный фильтр.

б. Окисление ПВС, стабилизированного глутаровым альдегидом.

К полученному продукту приливают 400 мл 0.1М КМnO₄ (3 г) и 150 мл 2М NaOH, перемешивают в течение 2 ч, фильтруют через стеклянный фильтр и промывают водой. Получают 750 мл окисленного ПВС - матрицы сорбента.

в. Модификация окисленного ПВС аминофенилборной кислотой.

15 г АФБК растворяют в 1200 мл воды, раствор подщелачивают до рН 6 и охлаждают до 5С. В раствор вносят весь полимер, при перемешивании устанавливают рН 6 и вносят 30 г конденсирующего агента 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимида мето-п-толуолсульфоната. Перемешивают 4 часа, затем промывают сорбент водой, 5% содой и снова водой. Содержание бора в полученном образце составляет 0,2%.

Пример 2

Аналогично примеру 1, но используют 3 г АФБК, процесс иммобилизации ведут при рН 4, а в качестве конденсирующего агента используют 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид гидрохлорид в количестве 10 г. Получают продукт с содержанием бора 0,08%.

Пример 3

Аналогично примеру 1, но для окисления используют NaMnO₄, процесс иммобилизации ведут при рН 5, а в качестве конденсирующего агента используют 1,1"-карбонилдиимидазол. Содержание бора 0,15%.

Пример 4

Аналогично примеру 1, но для окисления используют 1667 мл 0,1М КМnO₄ (12,5 г), а в качестве конденсирующего агента используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид. Содержание бора 0,15%.

Пример 5

Аналогично примеру 1, но в качестве конденсирующего агента используют N-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин. Содержание бора 0,18%.

Пример 6

Аналогично примеру 1, но в качестве конденсирующего агента используют дициклогексилкарбодиимид, а процесс иммобилизации ведут в присутствии 500 мл диметилформамида. Содержание бора в продукте составляет 0,15%.

Пример 7

Аналогично примеру 1, но на стадии иммобилизации АФБК в качестве растворителя используют диоксан в количестве 1000 мл. Содержание бора 0,2%.

Пример 8

Аналогично примеру 1, но на стадии иммобилизации 10 г АФБК моногидрата растворяют в смеси 600 мл воды с 600 мл диметилформамида, подщелачивают до рН 5, охлаждают до 5С. В раствор вносят весь полимер, при перемешивании устанавливают рН 5 и через каждый час порциями по 5 г вносят 25 г 1,1"-карбонилдиимидазола, поддерживая рН в области 5-6 и температуру реакционной смеси около 5С. Перемешивают 6 часов и оставляют на ночь. На следующий день промывают сорбент водой, 5% содой и снова водой. Содержание бора 0,14%.

Определение гликозилированного гемоглобина.

Сорбенты, полученные в условиях примеров 1-8, использовали для проведения анализов с использованием стандарта - “Контрольный образец”, 11,0-14,0% HbA (содержание гликозилированного гемоглобина - GHb - 15%).

Для определения гликозилированного гемоглобина в микроколонку, снабженную фильтром, загружают 1 мл полученного сорбента, вносят 10 мл рабочего буфера 1 и дают жидкости стечь в емкость для сбора негликозилированного гемоглобина (емкость А).

На верхний фильтр наносят 0,05 мл исследуемых гемолизатов, выдерживают 1-2 мин, затем в микроколонку вносят 0,05 мл рабочего буфера 1, выдерживают 5-10 мин, добавляют 10 мл рабочего буфера 1 и собирают жидкость в ту же емкость А.

Затем заменяют емкость, вносят в микроколонку 5 мл рабочего буфера 2 и дают жидкости стечь в емкость для сбора гликозилированного гемоглобина (емкость Б).

Рабочий буфер 1: ацетат аммония 0,25 М; хлорид магния 50 мМ; азид натрия 8 мМ, рН 8,1±0,1.

Рабочий буфер 2: ацетат аммония 0,25 М; хлорид магния 50 мМ; сорбитол 0,2 М; азид натрия 8 мМ, рН 8,1±0,1.

Для регенерации сорбента микроколонку промывают 5 мл регенерирующего раствора (уксусная кислота, 0,5%), а затем 5 мл дистиллированной воды (или 5 мл рабочего буфера 1). Микроколонка готова для проведения следующего анализа.

Содержание гликозилированного гемоглобина (GHb) вычисляют по следующей формуле:

%GHb=1005D₄₁₄(Б)/(5D₄₁₄(Б)+20,1D₄₁₄(A))

или

%GHb=(100D₄₁₄(Б)/D₄₁₄(Б)+4,02 D₄₁₄(A)),

где: D₄₁₄(Б) - оптическая плотность фракции Б при 414 нм;

D₄₁₄(A) - оптическая плотность фракции А при 414 нм;

20,1; 5 - объемы фракции А и Б соответственно;

100 - пересчетный коэффициент для вычисления процентного содержания.

Результаты анализов с использованием стандарта - “Контрольный образец”, 11,0-14,0% HbA₁ (GHb 15%) представлены в таблице.

Аналогичным образом получаемый заявляемым способом патент может быть использован для анализа других гликозилированных белков крови, а также сахаров и их производных.

Таким образом, сорбент, получаемый предложенным способом, обладает высокой разделительной способностью при определении гликозилированных белков крови и повышенной устойчивостью к окислению и появлению окраски. Это позволяет использовать визуальный контроль за процессом разделения гемоглобина, а также увеличить количество анализов на единицу (1 мл) сорбента до 50.

При этом способ отличается простотой и позволяет уменьшить расход АФБК почти в 2 раза.