способ определения цитотоксического эффекта и ростстимулирующей активности веществ для доклинических испытаний

Формула изобретения

Способ определения цитотоксического эффекта и ростстимулирующей активности вещества, включающий подготовку проб препарата, выращивание тестируемых клеток на питательной среде, подсчет живых клеток и сравнение с контролем в культурах без добавления препарата, отличающийся тем, что в качестве тестируемых клеток используют тест-систему, состоящую из четырех культур млекопитающих, а именно диплоидных фибробластов человека, диплоидных миобластов человека, минимальных гипотом и гибридом, при этом после выращивания клеток их окрашивают органическим красителем для подсчета жизнеспособных клеток и определяют показатель цитотоксического эффекта и ростстимулирующей активности испытуемого вещества.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к клеточной биологии и биохимии, а именно к определению биологической активности веществ (БАВ), которые прямо повреждают ДНК или влияют на работу генетического аппарата, например антибиотиков, алкалоидов, детергентов, мембранотропных и гормоноподобных веществ. Областью применения изобретения являются фармакология, медицина.

Известны способы определения БАВ, основанные на введении животному испытуемого вещества и наблюдении у него обменных процессов, например липидного обмена (пат. США № 4440786). Этот способ позволяет определить БАВ по реакции живого организма в целом, которая состоит как из непосредственного действия БАВ на клеточные мембраны, так и опосредственного действия на них через другие системы организма. Это не позволяет определить прямое действие БАВ на клетку. Недостатком этого способа является необходимость использования для их реализации животных.

Известен способ определения БАВ, при котором определяют их антиокислительную активность с использованием хрусталика глаза млекопитающих (пат. США № 4615877). Способ сложен, малоинформативен, т.к. позволяет определить БАВ только в отношении антиокислительной активности. Он не позволяет выявить влияние БАВ на метоболизм малонового альдегида. Способ требует забоя животного.

Известен способ определения биологической активности вещества, включающий приготовление контрольного и рабочего биологического препарата клеточной субстанции живого организма, добавление испытуемого вещества в рабочий биологический препарат, инкубацию контрольного и рабочего биологических препаратов, определение в них показателей метоболизма, в качестве одного из которых используют содержание в биологическом препарате малонового альдегида, сравнение показателей метоболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах и суждение о степени биологической активности испытуемого вещества заданной концентрации по величине изменений показателей метоболизма (пат. РФ № 2008680). В качестве клеточной субстанции биологических препаратов использовали свежеприготовленные эритроциты, в качестве показателей метоболизма дополнительно использовали степень гемолиза эритроцитов, интенсивность деградации малонового альдегида и антиоксидантную активность. Этот способ недостаточно информативен, имеет недостаточно высокую достоверность и сложен. Для осуществления способа необходимо использовать животных и забивать их.

Известен способ выявления токсичности химических реагентов на культурах фибропластов кожи и легких эмбриона человека для определения повреждающего действия химических соединений на метоболизм клеток соединительной ткани человека в культуре (пат. РФ № 2079130). При этом в способе оценивается активность лактатдегидрогеназы, как индикатора нарушений целостности клеточных мембран, активность ДТ-даифоразы, как фермента детоксикационной защиты, а также уровень индуцированного перекисного окисления в качестве показателя устойчивости к стрессу на клеточном уровне.

Известны способы оценки токсичности биологических объектов, включающие исследование воздействия вещества на суспензию подвижных биологических микрообъектов с последующей оценкой токсичности по изменению подвижности объектов во времени непосредственно после добавления исследуемого вещества (пат. РФ № 1725120). В качестве микрообъектов используют суспензию сперматозоидов быка в глюкоцитратном растворе. Способ недостаточно точен.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому объекту является способ определения биологической активности препарата, который включает подготовку проб препарата, выращивание тестируемых клеток на питательной среде, подсчет живых клеток и сравнение с контролем в культурах без добавления препарата (пат. РФ № 2154270). При этом клетки выращивают на среде МЕМ с эмбриональной телячьей сывороткой до получения монослоя, затем среду культивирования удаляют и добавляют раствор трипсина, после чего в культуру добавляют раствор Версена и инкубируют при 37С в течение 10 мин, далее открепившиеся клетки собирают и отмывают 2 раза от раствора Версена путем центрифугирования и подсчитывают число живых клеток, после чего определяют уровень включений ³H-тимидина пролиферирующими клетками, при этом препарат считается обладающим биологической активностью, если степень подавления суммарного включения ³H-тимидина и/или адгезии составляет не менее 50% от контрольного уровня в культурах без добавления препарата.

Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в создании высокоэффективного способа определения БАВ за счет расширения информативности способа, повышения достоверности и упрощения способа. При этом возможно определение на клеточном уровне токсических и стимулирующих эффектов от действия БАВ.

Поставленная цель достигается за счет использования способа определения биологической активности веществ, включающего подготовку проб препарата, выращивание тестируемых клеток на питательной среде, подсчет живых клеток и сравнение с контролем в культурах без добавления препарата. В качестве тестируемых клеток используют тест-систему, состоящую из четырех культур млекопитающих, а именно диплоидных фибробластов человека, диплоидных миобластов человека, минимальных гипотом и гибридом. После выращивания клеток их окрашивают органическим красителем и определяют показатель цитотоксического эффекта и ростстимулирующей активности испытуемого вещества.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Построение калибровочной кривой.

Клеточные культуры, используемые в биотест-системе: нормальные (диплоидные) фибропласты и миобласты человека; гепатомные клетки человека линии НЕР G2 и гепатомные клетки сирийского хомячка линии ГТ-11Б; гибридомные клетки мышь/мышь линии 12D5 и линии MLC-1. Отбирают 4-5 штаммов клеточных культур. Культивирование клеток проводят в питательной среде DMEM с добавлением 5% сыворотки крупного рогатого скота и 5% сыворотки пуповинной крови человека или 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки выращивают в 96-луночных планшетах. В стандартных условиях роста за 14 суток плотность насыщения культуры достигает 100 тыс. клеток на 1 см². Клетки окрашивают метиленовым синим, или кристаллическим фиолетовым, или красителем Гимзы, или МТТ. Затем окрашенные клетки дважды споласкивают холодной водой и краситель элюируют 50%-ным раствором этанола. Измерение оптической плотности материала лунок проводят на электрофотометре “ЭФОС 9305” при 594 нм. Строят калибровочные кривые с определенным красителем. Для построения кривой зависимости между интенсивностью окрашивания клеток в лунках метиленовым синим и количеством просеянных клеток в этих лунках результаты обрабатывают с помощью известной компьютерной программы. Аналогично строят калибровочную кривую по результатам окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым, красителем Гимзы, красителем МТТ.

Пример 2. Определение цитотоксического эффекта.

При изучении цитотоксического влияния различных препаратов с помощью окрашивания любым органическим красителем схема использования предлагаемой биотест-системы остается такой же, как и при построении калибровочной кривой, за исключением того, что у образцов клеточных культур, высеянных на 96-луночные платы, через сутки роста культуральную среду меняют на свежую, содержащую исследуемый препарат в различных концентрациях с тем, чтобы получить зависимость “доза-эффект”. Лунки двух вертикальных рядов служат контролем, в них исследуемое вещество не добавляется. Далее проводят 96-часовой рост клеток и окрашивание красителем, а также измерение оптической плотности материала лунок выполняют как в примере 1. Результаты определения оптической плотности обрабатывают с помощью компьютерной программы Sigma-Plot. Параллельно все пробы микроскопировались с помощью МБИ-3, ЛОМО, адаптированного как инвертированный микроскоп с помощью специальной насадки, для оценки морфологического состояния растущих клеток.

Результаты эксперимента см. на фиг. 1, где представлено цитотоксическое влияние аминогликозидного антибиотика генетицина (кривая “доза-эффект”) на культивируемые фибробласты (1), миобласты (2), гибридомные (3) и гепатомные (4) клетки, окраска кристаллическим фиолетовым и МТТ. По оси ординат - относительная оптическая плотность проб в процентах, отражающая количество живых клеток, выращенных без добавок антибиотика, по оси абсцисс - концентрация генетицина в пробах.

Пример 3. Определение ростстимулирующей активности БАВ.

Пример проводят аналогично примеру 1 за исключением, что высеянную на 96-луночные платы культуры через сутки после посева культуральную среду меняют на свежую, не содержащую сыворотку. На бессывороточной среде клетки культивируются в течение двух суток. По истечении двух суток среда вновь меняется на свежую, содержащую не 10% сыворотки как при посеве, а только 3% сыворотки и к пробам добавляют исследуемый препарат в различных концентрациях. Лунки двух вертикальных рядов, содержащие среду с 3% сывороткой, служат контролем - в них исследуемое вещество не добавляется. В качестве дополнительного контроля используют еще один вертикальный ряд лунок, где к пробам после удаления бессывороточной среды добавляется вновь бессывороточная среда без препарата. Далее проводят 96-часовой рост клеток и окрашивание красителем также, как описано в примере 1. Затем краситель удаляют, лунки дважды промывают и каждую лунку заполняют 100 мкл элюирующего раствора. Плату инкубируют при комнатной температуре 15 мин при непрерывном перемешивании. Итоговое измерение оптической плотности проводят на фотометре “ЭФОС 9305” при длине волны 594 нм либо 620 нм. Параллельно все пробы микроскопировались с помощью МБИ-3, ЛОМО, адаптированного как инвертированный микроскоп с помощью специальной насадки, для оценки морфологического состояния растущих клеток,

Результаты эксперимента см. фиг. 2, где представлено ростстимулирующее влияние стероидного препарата дексаметазона на культивируемые фибробласты (1), миобласты (2), гепатомные (3) и гибридомные (4) клетки, окраска кристаллическим фиолетовым и МТТ. По оси ординат - относительная оптическая плотность проб в процентах, отражающая количество живых клеток в пробе; за 100% принята оптическая плотность клеток, выращенных без добавок дексаметазона, по оси абсцисс - концентрации дексаметазона в пробах.

Предлагаемый способ определения биологической активности препарата позволяет определить цитотоксические и ростстимулирующие эффекты БАВ, обеспечивает высокую информативность анализа и является более экономичным, чем применение лабораторных животных при сопоставимых уровнях информативности, позволяет определять различные количественные показатели, включая LD₅₀ и LD₁₀₀.