способ прогнозирования тяжести течения алкоголизма

Формула изобретения

Способ прогнозирования тяжести течения алкоголизма путем проведения клинико-генетических исследований, отличающийся тем, что определяют генотип 7/10-1 по гену тирозингидроксилазы и при его отсутствии прогнозируют неблагоприятное течение алкоголизма.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к наркологии.

Известен способ прогнозирования тяжести течения алкоголизма путем проведения клинических исследований (Алкоголизм. Руководство для врачей. Под ред. Г. В.Морозова, В.Е.Рожнова, Э.А.Бабаяна. М., 1983). Недостатками этого способа являются его длительность, субъективность, зависимость точности прогноза от квалификации врача.

Известны методы клинико-биохимического (Alcohol Clin Exp Res 1998 Арr; 22(2): 524-7. Clinical characteristics and disease course of alcoholics with inactive aldehyde dehydrogenase-2. Murayama M., Matsushita S., Muramatsu T., Higuchi S. ) и клинико-генетического (Biol Psychiatry 1997 Feb 15;41(4): 386-93 Association of the D2 dopamine receptor Al allele with alcoholism: medical severity of alcoholism and type of controls. Lawford B.E., Young R. M. , Rowell J.A., Gibson J.N., Feeney G.F., Ritchie T.L., Synduiko K., Noble E.P.) исследования тяжести течения алкоголизма.

Недостатками этих методов является констатация настоящего статуса больного и невозможность прогнозирования тяжести течения алкоголизма.

Техническим результатом является устранение вышеуказанных недостатков, повышение сроков прогноза, его точности и объективности, а также опережение клинического прогноза.

Указанный результат достигается тем, что определяют генотип 7/10-1 по гену тирозингидроксилазы и при его отсутствии прогнозируют неблагоприятное течение алкоголизма.

Не вытекает из известного уровня техники тот факт, что отсутствие генотипа 7/10-1 по гену тирозингидроксилазы может служить прогностическим критерием неблагоприятного течения алкоголизма.

Способ определяют следующим образом:

В образце крови исследуемого, полученном путем венепункции, проводят генотипирование по полиморфному локусу HUMTH01 гена тирозингидроксилазы (ТГ). Локус представляет собой многократные повторы короткой последовательности нуклеотидов вида (ТСАТ)n, где n - число повторов. Значения n составляют от 5 до 11, соответственно количеству повторов именуются и аллели (варианты) гена ТГ по этому локусу - А5, А6... и до А11. Выделяют также А 10-1, или "несовершенный аллель А10", когда в результате делеции одного основания в структуре пятого повтора локус приобретает следующий вид: (ТСАТ)4(САТ)(ТСАТ)5(10). Генотипы пациентов по локусу HUMTH01 обозначаются как сочетание аллелей, например генотип 7/10-1 означает, что ДНК пациента содержит алели А7 и А10-1 одновременно, т.е. одна из цепей ДНК несет ген ТГ с семикратным повтором, другая - с несовершенным десятикратным.

Для генотипирования пациентов, т.е. выявления, какие аллели и генотипы гена ТГ по локусу HUMTH01 несет ДНК пациента, используют методику полимеразной цепной реакции (ПЦР)(Polymeropoulos H, Xiao H, Rath D.Merril С. Tetranucleotide repeat polymorphism at the human tyro-sine hydroxylase gene (TH). Nucleic Acid Res. 1991.19:3753), с помощью которой фрагменты ДНК, содержащие полиморфный локус, амплифицируют и их концентрация становится достаточной для разделения с помощью электрофореза. Материалом для исследования являются образцы ДНК, выделенные из цельной венозной крови контрольных индивидуумов и больных алкоголизмом. Выделение геномной ДНК из свежей крови, полученной с помощью венепункции, проводят методом фенольной экстракции с некоторыми модификациями (Strauss WM. Preparation of genomic DNA from mammalian tissue. In "Current Protocols in Molucular Biology (Ausubel FM et al., Eds.) Boston. MA /pp.2.2.1-2.2.3,1990).

Область интрона 1 гена ТГ амплифицируют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР каждого образца ДНК проводят в конечном объеме 25 мкл, в стандартной реакционной смеси в присутствии 12 pmol каждого праймера с использованием 2,5U термофильной Taq-полимеразы используются оригинальные олигонуклеотидные праймеры RF 5" - АТТ CAA AGG GTA TCT GGG CTC TGG-3" и RR 5" - GTG GGC TGA AAA GCT CCC GAT TAT-3" в концентрации 10M. Реакцию проводят при следующих условиях: 94С 5 минут; 94С 1 минута-64С 1 минута-72С 2 минуты: 30 циклов; 72С 3 минуты.

Для анализа ПЦР-фрагментов области 1 интрона гена ТГ используют константный денатурирующий акриламидный гель (6% акриламид (37,5:1), 7М мочевина). Электрофорез выполняют при следующих условиях: 60W, 2 часа. Гель окрашивают серебром по следующей методике: гель фиксируют в растворе 10% этилового спирта в течение 30 минут. После последующей 5 минутной обработки раствором 1% азотной кислоты гель промывают дистиллированной водой трижды по 5 минут. Окраску геля проводят раствором серебра в течение 20 минут. Гель проявляют 3% раствором Na₂CO₃ с добавлением формамида. Реакцию останавливают 5% раствором уксусной кислоты.

При необнаружении генотипа 7/10-1 прогнозируют неблагоприятное течение алкоголизма.

Пример 1: Больной К., 29 лет, поступил в клинику НИИ наркологии МЗ РФ 18.04. 2001 г. с диагнозом "хронический алкоголизм 2 стадии" в состоянии начальной фазы абстинентного синдрома.

Жалобы: тошнота, рвота, слабость, сердцебиение, боли в суставах, головокружение, диарея, "видения" по ночам, бессонница. Отмечает острое желание выпить спиртного.

Анамнез: первая проба алкоголя в 12 лет, сопровождалась ощущением эйфории. Систематическое потребление с 15 лет: 2-3 раза в неделю массированый прием (водка в объеме до 1 литра). Выраженный абстинентный синдром сформировался к 18 годам.

Характер потребления: истинные запои до 5 недель со "светлыми промежутками" 5-8 дней. Первично госпитализирован в возрасте 19 лет. Терапевтических ремиссий нет. Число госпитализаций по поводу алкоголизма на момент исследования - 8.

Проведено генотипирование образца ДНК больного по локусу HUMTH01 гена тирозингидроксилазы. Генотип 7/10-1 не обнаружен.

Таким образом, у данного больного неблагоприятное течение алкоголизма совпадает с отсутствием генотипа 7/10-1.

Пример 2: Больной Б., 53 года, поступил в клинику НИИ наркологии МЗ РФ 2.02.2001 г. с диагнозом "хронический алкоголизм 2 стадии" в состоянии начальной фазы абстинентного синдрома.

Жалобы: тошнота, рвота, слабость, головокружение, бессонница.

Отмечает желание выпить спиртного.

Анамнез: первая проба алкоголя в 14 лет. Систематическое потребление с 25 лет: 2-3 раза в месяц. Абстинентный синдром сформировался к 45 годам.

Характер потребления: псевдозапои до 4 дней. Связывает с "плохим настроением" и "подходящей компанией". Первично госпитализирован в возрасте 49 лет. Терапевтическая ремиссия составила 14 месяцев. Число госпитализаций по поводу алкоголизма на момент исследования - 1.

Проведено генотипирование образца ДНК больного по локусу HUMTH01 генатирозингидроксилазы. Обнаружен генотип 7/10-1.

Таким образом, у данного больного относительно благоприятное течение алкоголизма совпадает с наличием генотипа 7/10-1.

Предлагаемым способом проведено исследование 143 больных с диагнозом 2-3 стадии алкоголизма. Совпадение клинического и лабораторного прогноза выявлено в 73% случаев.

Предлагаемый способ прогнозирования тяжести течения алкоголизма имеет преимущества перед известными способами, заключающиеся в повышении точности и объективности прогноза, сокращении сроков прогноза, что имеет значение для выбора адекватной тактики лечения алкоголизма. Одновременно выявлен генетический маркер благоприятного течения алкоголизма: наличие генотипа 7/10-1 по локусу HUMTH01 гена тирозингидроксилазы, по-видимому, выполняющий роль протектора.