измерение и использование межмолекулярного взаимодействия

Формула изобретения

1. Способ определения аффинности партнеров по связыванию по отношению друг к другу или аффинности свойства одного из партнеров по связыванию, зависящего от аффинности, содержащий следующие этапы: приведение в контакт партнеров по связыванию, один из которых иммобилизирован на поверхности, сообщение поверхности колебательного движения с амплитудой, значение которой возрастает до значения, при котором появляется явление диссоциации и регистрация явления диссоциации.

2. Способ выделения искомого аналита из состава, содержащий этапы, на которых приводят состав в контакт с иммобилизированным на поверхности партнером по связыванию с аналитом и сообщают поверхности колебательное движение с возрастающей амплитудой для избирательного удаления аналита или других компонентов состава с поверхности.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют интенсивность связывания между партнерами по связыванию.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют наличие другого партнера по связыванию.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что другой партнер по связыванию является частицей или иммобилизирован на частице.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что дополнительно определяют размер или наличие частицы.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что лиганд или любой из партнеров по связыванию представляет собой белок, антитело, антиген, фермент, ингибитор фермента или полинуклеотид.

8. Способ по пп.1-6, отличающийся тем, что лиганд или партнер по связыванию представляет собой клетку, бактерию, вирус, прион или фаг.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что различные партнеры по связыванию иммобилизированы в разных местах поверхности.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что явление диссоциации регистрируют по акустическому излучению.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что поверхность является частью пьезоэлектрического преобразователя или акустического преобразователя.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что преобразователь представляет собой микровесы на кристалле кварца или устройство поверхностной акустической волны.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что его осуществляют в жидкой среде.

14. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что его осуществляют в воздушной среде.

15. Способ по п.10, отличающийся тем, что средство возбуждения колебаний сообщает поверхности колебательное движение с частотой, соответствующей одной основной резонансной частоте, и средство регистрации регистрирует акустическое излучение вблизи другой моды.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что поверхность является частью микровесов на кристалле кварца (МКК), которые колеблются при возбуждения их на его резонансной частоте, причем МКК регистрирует акустическое излучение на его третьей гармонике.

17. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что поверхность осуществляет колебания в плоскости поверхности.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что при сообщении поверхности колебательного движения, колебания поверхности осуществляют с монотонно увеличивающейся амплитудой.

19. Устройство для определения аффинности партнеров по связыванию по отношению друг к другу, содержащее поверхность, на которой иммобилизирован один из партнеров по связыванию, средство возбуждения колебательного движения поверхности с возрастающей амплитудой и средство регистрации явления диссоциации.

20. Устройство по п.19, отличающееся тем, что средство регистрации выполнено с возможностью регистрации сигнала акустического излучения.

21. Устройство по п.19 или 20, отличающееся тем, что иммобилизированный партнер по связыванию представляет собой белок, антитело, антиген, фермент, ингибитор фермента или полинуклеотид.

22. Устройство по любому из пп.19-21, отличающееся тем, что иммобилизированный партнер по связыванию представляет собой клетку, бактерию, вирус, прион или фаг.

23. Устройство по любому из пп.19-22, отличающееся тем, что различные партнеры по связыванию иммобилизированы в разных местах поверхности.

24. Устройство по любому из пп.19-23, отличающееся тем, что средство возбуждения колебаний и средство регистрации содержит пьезоэлектрический преобразователь или акустический преобразователь.

25. Устройство по п.24, отличающееся тем, что преобразователь представляет собой микровесы на кристалле кварца или устройство поверхностной акустической волны.

26. Устройство по любому из пп.19-25, отличающееся тем, что средство возбуждения колебаний выполнено с возможностью сообщения поверхности колебательного движения с частотой, соответствующей одной основной резонансной частоте, и средство регистрации выполнено с возможностью регистрации акустического излучения вблизи другой моды.

27. Устройство по п.26, отличающееся тем, что средство возбуждения колебаний и средство обнаружения содержит микровесы на кристалле кварца (МКК), причем средство возбуждения колебаний выполнено с возможностью возбуждения МКК на его резонансной частоте и средство регистрации выполнено с возможностью регистрации акустического излучения на его третьей гармонике.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к способам измерения межмолекулярных взаимодействий и разделения, сортировки и калибровки частиц. В частности, изобретение относится к измерению аффинности различных партнеров по связыванию по отношению друг к другу, например, при взаимодействии антитело-антиген.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Специфическое распознавание молекул это фундаментальный процесс, лежащий в основе взаимодействий фермент-лиганд, взаимодействий антитело-антиген и связывания молекул с рецепторами. Распознавание молекул осуществляется посредством нековалентных взаимодействий, например, электростатического взаимодействия (водородные связи) и гидрофобных взаимодействий. Результаты термодинамических измерений констант связи и изменения свободной энергии, энтальпии и энтропии проливают свет на молекулярную основу распознавания, особенно в сочетании с информацией, полученной методом дифракции рентгеновских лучей и, по возможности, сайт-специфического мутагенеза.

Прямые измерения интенсивности взаимодействия производили методами микроскопии межатомных взаимодействий (МАВ), а также с помощью устройства поверхностных сил. Поскольку метод МАВ основан на измерении силы разрыва связи, недостаток этого метода состоит в том, что измерение можно производить однократно. До сих пор МАВ использовали для изучения взаимодействий авидин-биотин (Florin et al. , Science, 1995; 264:415), гибридизации ДНК (Boland et al. , PNAS, 1995; 92: 5291), взаимодействий антитело-антиген (Dammer et al. , Biophys. J., 1996; 70:2437) и адгезионных гликопротеинов (Dammer et al., Science, 1995; 267:1173).

Разделение биологических молекул на основе их относительной аффинности к лигандам является общеизвестным методом. Например, в аффинной хроматографии, компоненты, подлежащие разделению, пропускают по колонне, содержащей специфический лиганд. Нужный компонент избирательно и сильно связывается с колонной и удерживается на колонне при удалении остальных компонентов. На последующем этапе связанный материал можно удалить с колонны.

Технологии отделения являются важной частью многих экспериментальных исследований. Желательно повысить чувствительность или избирательность этих методов.

В работе Kolomenskii et al., J. Appl., Phys., 1998; 84 (4):2404-10 раскрыты исследования очистки и адгезии поверхности, проведенные с использованием поверхностных акустических импульсов, генерируемых лазером. В этих исследованиях применяли импульсы постоянной энергии с низкой частотой повторения (20 Гц). Поскольку процедура осуществляется в вакууме, она непригодна для коммерческого применения. Для регистрации удаления частиц использовали оптический микроскоп, который не позволяет различать частицы разных размеров.

В патентной заявке WO-A-98/45692 раскрыто использование датчика на основе пьезоэлектрического кристалла для определения образования/диссоциации клатратных гидратов. В работе Kurosawa et al., Chem. Pharm. Bull., 1990; 38(5):1117-20 сообщается об использовании такого датчика для регистрации агглютинации латексного носителя антител. В патентной заявке WO-A-98/40739 также раскрыт подобный датчик, содержащий пластину, на которой иммобилизированы специфические связывающиеся объекты, используемые для указания наличия клеток в среде. Эти датчики используют, измеряя изменение резонансной частоты при постоянном напряжении.

В настоящее время, по возможности, большинство вирусов обнаруживают посредством культуры образца в клетках, поскольку этот способ обеспечивает чувствительность, хотя и требует больших затрат времени. Прямое обнаружение вирусной ДНК или РНК в клинических образцах можно осуществлять с использованием PCR и специфических праймеров, приспособленных для нужного вируса. Поскольку PCR предусматривает этап усиления, возникает серьезная проблема перекрестного загрязнения, что затрудняет применение надежных способов количественного анализа. Существуют и другие прямые способы, в том числе электронная микроскопия, иммунная электронная микроскопия и способы, основанные на обнаружении антигенов с помощью иммобилизированного на антителе фермента. Эти способы нередко оказываются недостаточно чувствительными и, потому, для их осуществления требуется относительно большое количество вирусных частиц.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В основе настоящего изобретения лежит тот факт, что связи между искомой молекулой или искомой молекулой, присоединенной к частицам, и поверхностью можно разрушать, увеличивая амплитуду механических колебаний поверхности, что приводит к отрыву искомой молекулы или частицы от поверхности. Необходимое для этого ускорение, а следовательно, сила, определяется различными факторами, в том числе массой молекулы или частицы, характером связи с поверхностью и геометрической формой или размером искомой молекулы или частицы. Таким образом, настоящее изобретение можно использовать для отделения или калибровки различных искомых молекул или для регистрации их наличия.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения способ выделения искомого аналита из состава содержит этапы, на которых

(i) приводят состав в контакт с иммобилизированным на поверхности партнером по связыванию с аналитом и

(ii) сообщают поверхности колебательное движение с возрастающей амплитудой для избирательного удаления аналита или других компонентов состава с поверхности.

Кроме того, настоящее изобретение можно использовать при осуществлении способа определения наличия или размера частиц или аффинности партнеров по связыванию по отношению друг к другу. Согласно второму аспекту изобретения этот способ содержит этапы, на которых

(i) приводят в контакт партнеры по связыванию, один из которых иммобилизирован на поверхности,

(ii) сообщают поверхности колебательное движение с возрастающей амплитудой и

(iii) регистрируют явление диссоциации.

Согласно этому второму аспекту изобретение можно применять к различным физическим и химическим связям, начиная с относительно слабых взаимодействий, например водородных связей, и заканчивая ковалентными связями.

Устройство, пригодное для использования согласно настоящему изобретению, содержит поверхность, на которой иммобилизирован один партнер по связыванию, средство возбуждения колебания поверхности с возрастающей амплитудой и средство регистрации явления диссоциации.

В частности, устройство может содержать акустическое преобразовательное устройство (АПУ), например микровесы на кристалле кварца (МКК) или устройство поверхностной акустической волны или любой пьезоэлектрический материал, который можно приводить в колебания, например, прилагая переменное напряжение или магнитное поле. Эти устройства дешевы по сравнению с МАВ, и их можно мультиплексировать. Другое преимущество использования такого устройства состоит в том, что происходит одновременное разрушение большого количества связей, а это приводит к возбуждению регистрируемых звуковых волн и острых шумовых пиков при определенных значениях ускорения (напряжения, подаваемого на АПУ). Еще одно преимущество состоит в том, что АПУ можно использовать в качестве чувствительного микрофона для регистрации акустического излучения, когда происходит явление диссоциации.

В соответствии с уровнем техники в большинстве экспериментов с использованием АПУ изменения резонансной частоты или фазы измеряли при постоянном напряжении на АПУ. Настоящее изобретение, напротив, предусматривает увеличение возбуждающего напряжения, а следовательно, амплитуды колебаний АПУ.

Настоящее изобретение имеет широкую область применения в процессах отделения, сортировки и калибровки. Приведенные ниже Примеры свидетельствуют о том, что в воздушной среде сферы, маркированные стрептавидином, можно отделять от нормальных латексных сфер, подавая на МКК с биотинилированной поверхностью возбуждающее напряжение свыше 0.1 В, но ниже 6 В. Нормальные латексные сферы отрываются от поверхности, тогда как сферы, маркированные стрептавидином, остаются присоединенными к поверхности (посредством более сильной связи стрептавидин-биотин). Это открывает новые возможности для использования технологии отделения, основанной на приложении переменной силы в течение определенного интервала времени, которую можно применять, например, для калибровки и сортировки частиц, калибровки клеток, пэннинга фага, а также для конструирования новых биодатчиков. Такой способ отделения не требует больших затрат и легко подается мультиплексированию и автоматизации. Он, например, дает возможность осаждать различные искомые объекты в различных позициях на одни и те же микровесы и скринировать библиотеку лигандов по отношению сразу к нескольким искомым объектам. Еще одной областью применения является обнаружение и анализ вирусных частиц фиксированного размера. Существенно также, что настоящее изобретение предусматривает новый способ исследования сил, участвующих в молекулярном распознавании, обеспечивающий чувствительность и возможность количественных измерений.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает использование устройства датчика, которому можно сообщать колебательное движение. Датчику можно сообщать колебательное движение различными способами, например, с помощью устройств поверхностных акустических волн, резонансных устройств на кристалле кварца, устройств на основе моды акустической пластины и гибкой пластины в виде тонкой мембраны.

Коммерчески доступны датчики многих разных типов, пригодных для использования в изобретении. Описание датчиков, которые можно использовать в настоящем изобретении, содержится в работе Acoustic Wave Sensors, Ballantine et al. , (1997) Academic Press. Датчик, предпочтительно, представляет собой устройство поверхностной акустической волны или, что более предпочтительно, микровесы на кристалле кварца (МКК).

МКК обычно представляет собой диск из кристаллического кварца с золотыми электродами на верхней и нижней поверхностях. При подаче на электроды переменного напряжения он испытывает колебания сдвига вследствие пьезоэлектрического эффекта. Возрастание напряжения приводит к увеличению амплитуды колебаний МКК.

Кристалл кварца также является чувствительным микрофоном, и его можно использовать для регистрации акустического излучения, возникающего в результате явления отрыва. Технически проще возбуждать колебания на частоте, соответствующей одной основной резонансной частоте, и регистрировать акустическое излучение вблизи другой моды. Например, МКК возбуждают на их резонансной частоте и регистрируют акустическое излучение на ее третьей гармонике.

В целях иллюстрации термин "аналит" можно использовать для описания связывающего партнера или компонента, который входит в контакт со связывающим партнером, иммобилизированным на поверхности. После установления контакта аналит связывается с датчиком посредством межмолекулярного взаимодействия и подвергается ускорению, а следовательно, воздействию силы, приложенной к аналиту. По мере возрастания амплитуды колебаний, при достижении силой определенного порога, происходит разрыв связи. Ранее связанная частица аналита получает возможность перекатываться по поверхности.

Аналит может представлять собой микроскопический объект, способный удерживаться на датчике посредством межмолекулярного взаимодействия. Аналит может представлять собой протеин, антитело, антиген, фермент, ингибитор фермента или полинуклеотид. Аналит может также представлять собой более крупную частицу, например бактерию, клетку, вирус, прион или фаг. Другие примеры частиц, которые особенно пригодны для использования в настоящем изобретении, включают в себя микросферы из любого материала, например кварца, золота или латекса, или большие макромолекулы, например плазмиды. Связывающий партнер, иммобилизированный на поверхности, может относиться к тому же типу и его можно выбирать соответственно и в зависимости от подходящей физической или химической связи.

Диссоциацию более мелких аналитов предпочтительно регистрируют по акустическому излучению. Более крупные частицы можно также регистрировать оптическими средствами, например, с помощью микроскопии.

Согласно первому аспекту изобретения отделение осуществляют путем иммобилизации искомой молекулы на поверхности датчика за счет взаимодействия с партнером по связыванию. Затем поверхность можно привести в колебательное движение, чтобы отрывать молекулы от поверхности датчика. При этом постоянно увеличивают амплитуду колебаний, а следовательно, ускорение, чтобы, либо удалить с поверхности искомую молекулу, либо удалить с поверхности другие компоненты смеси, оставив искомую молекулу, связанной с поверхностью. Согласно предпочтительному варианту осуществления для сообщения поверхности датчика колебательного движения используют пьезоэлектрическое устройство акустической волны, например МКК. То же самое пьезоэлектрическое устройство можно использовать в качестве микрофона для регистрации акустического шума, порожденного явлением отрыва.

Метод отделения можно применять для выделения молекул, которые сильно взаимодействуют конкретным партнером по связыванию. Например, этот метод можно применять для выделения клеток конкретными рецепторными молекулами, экспрессированными на поверхности клетки, или для выделения антител с сильной аффинностью к конкретному лиганду.

Разные лиганды можно разместить в разных местах поверхности с помощью, например, контактной печати или с использованием масок или фотолитографии. Это дает возможность скринировать смесь в отношении сразу нескольких сильно связывающих партнеров с помощью нескольких разных лигандов. В частности, изобретение можно использовать применительно к пластинкам, на которых иммобилиэированы различные материалы, например рецепторы. В более общем случае пластинки могут демонстрировать материалы, позволяющие тестировать различные инфекции, патогены, прионы, пищевые аллергены, вирусы, бактерии и т.д., при осуществлении клинического тестирования человека или животного и при гигиеническом мониторинге пищи и воды. Кроме того, изобретение можно использовать для скринирования библиотеки, фагового отображения и т.д.

Второй аспект настоящего изобретения предусматривает способ определения наличия или размера частиц, или уровней аффинности молекул по отношению друг к другу. Предпочтительно, одну молекулу иммобилизируют на поверхности датчика, а другую молекулу иммобилизируют на частице, например микросфере. Затем частицу присоединяют к датчику посредством изучаемого межмолекулярного взаимодействия. Функционализированные частицы приводят в колебательное движение, подавая на датчик напряжение. По мере возрастания амплитуды сила достигает критического значения, при котором происходит разрыв связей. В этот момент можно, с помощью чувствительного усилителя регистрировать характерный шум и наблюдать движение частиц, например, с помощью оптического микроскопа. Величина сигнала зависит от количества частиц, связанных с поверхностью датчика. Обычно, когда МКК используют в соответствии с описанным ниже Примером 1, совместно с физически абсорбированными микросферами, шум регистрируют при напряжении 0.1-1.0 В, в зависимости от размера микросфер, при этом можно наблюдать под микроскопом, как микросферы скользят по поверхности и отрываются от нее. Можно построить график зависимости уровня генерируемого шума от амплитуды (или приложенного напряжения), который будет представлять собой спектр силы отрыва. С помощью графика можно определить момент разрыва связи, поскольку он соответствует пику шума. Таким образом, можно определить критическое напряжение, при котором происходит разрыв связи. Надлежащие калибровочные эксперименты с использованием частиц с известными плотностью и силой связи позволяют использовать этот способ для количественных измерений. Кроме того, высота пика акустического излучения является мерой количества связанных частиц.

Настоящее изобретение можно использовать для изучения межмолекулярного взаимодействия, и, в особенности, для изучения взаимодействий фермент/лиганд, взаимодействий антитело-антиген и взаимодействий рецептор/лиганд или взаимодействия между макромолекулой и ее природным партнером по связыванию. Данный способ также можно применять для изучения явлений гибридизации между полинуклеотидами. Таким образом, согласно первому аспекту изобретения в качестве лиганда может выступать, например, белок, антитело или антиген, фермент, ингибитор фермента, полинуклеотид или большая макромолекула, например, большая плазмида или вирус. Согласно второму аспекту изобретения с поверхностью или частицей может быть связан любой материал.

Ниже приведены Примеры, иллюстрирующие изобретение. Согласно этим Примерам, для измерения сил слипания между поверхностью и малой частицей используют спектроскопию силы отрыва. Для этого поверхности с находящимися на ней микрочастицами сообщают колебательное движение с монотонно возрастающей амплитудой и, следовательно, возрастающим ускорением. Для этого поверхность приводят в движение посредством пьезоэлектрического устройства акустической волны, в данном случае микровесов на кристалле кварца (МКК). По мере возрастания амплитуды возрастает ускорение, а значит, и сила, приложенная к частице. Разрыв всех связей, соединяющих частицу с поверхностью, порождает акустический шум, и то же пьезоэлектрическое устройство используют в качестве чувствительного микрофона для регистрации этого шума, порожденного явлением разрыва. На фиг.1 показана схема устройства, используемого в Примерах 1-5; на фиг.8 схема предпочтительного устройства показана в более общем виде.

В частности, схема, показанная на фиг.1, содержит пьезоэлектрический преобразователь 10, генератор 11 чисто синусоидального сигнала частоты f, генератор 12 частоты 3f+f, фильтр 13 частоты 3f+f, блок 14 синхронного усилителя и аналого-цифрового преобразователя и компьютер 15, ввод данных в который и вывод управляющего сигнала из которого обозначены стрелками. Согласно Примерам 1-5, f= 14.2 МГц и f=82 кГц. Частицы 16 находятся на поверхности подложки.

На фиг. 8 показаны пьезоэлектрический преобразователь 21 (например, устройство МКК, ПАВ и т.п.) и усилитель 22 с переменным коэффициентом усиления, снабженный входом 23 и выходом 24, способный выдавать выходной сигнал с плавно растущей амплитудой под управлением сигнала 25. Схема также содержит полосовой приемник 26 (например, аналогичный радиоприемнику ОБП) и аналого-цифровой преобразователь 27 или несколько таких преобразователей, откуда данные поступают в линию 28. Кроме того, схема содержит устройство 29 управления, записи и обработки сигнала данных (например, компьютер или специализированный процессор ЦСП). Контакт, указанный пунктирной линией 30, можно заменить более оптимизированным средством фильтрации и подключения, в качестве которого может выступать, например, пассивный LCR-контур.

В схеме, показанной на фиг.8, усилитель 22 совместно с преобразователем 21, а также необязательным средством 30 фильтрации/подключения обеспечивают простой колебательный контур, в котором колебания происходят, предпочтительно, на частоте эффективной работы преобразователя; для МКК это может быть основная частота последовательного резонанса. Эта частота колебаний (F) равна, например, 14 МГц. Амплитуда напряжения возбуждения на выходе 24 плавно возрастает под управлением контроллера 29, осуществляемым по линии управления 25. Исходящий сигнал акустического излучения в точке 30 можно очищать посредством необязательного фильтра/соединителя, после чего подавать на вход полосового приемника 26. На основании критерия максимального отношения сигнал-шум в качестве рабочей полосы частот приемника можно выбирать, например, резонансную моду, находящуюся вблизи третьей гармоники (3*F+F), например, 42.082 МГц.

Единичные или квадратурные выходные сигналы преобразуются аналого-цифровым преобразователем 27 или несколькими преобразователями с высоким динамическим диапазоном. Затем данные подвергают дальнейшей цифровой обработке на блоке 29, извлекая полезный сигнал, который записывают и/или представляют наблюдателю. Усилитель 22 можно дополнительно оборудовать пассивным выходным и/или входным фильтром(ами), чтобы повысить отношение сигнал-шум, а также чтобы гарантировать, что колебательный контур работает на правильной частоте и с правильным сдвигом фазы тока относительно напряжения на преобразователе.

На фиг.9 показан предпочтительный вариант датчика на основе ПАВ, используемый в изобретении. Он содержит средство 31 генерации напряжения РЧ на выходе 32 с повышающейся амплитудой, которое поступает на электроды 33 преобразователя. Структура электродов 33 оптимизирована для генерации на пьезоподложке 34 ПАВ с высокой амплитудой. Структура электродов 37 оптимизирована для наиболее эффективного преобразования акустического излучения в электрический сигнал. Это может быть сложный шаблон, содержащий одну или несколько пар электродов. Устройство дополнительно содержит блок управления 35 для управления генератором 31 по линии 36 и для приема генерируемых сигналов на одном или нескольких входах 38, а также для обработки сигнала данных, например, методом корреляционного анализа.

Работа датчика на основе ПАВ заключается в том, что генератор 31 генерирует напряжение РЧ, которое пригодно для обеспечения частоты эффективного преобразования на выходе 32, и оно поступает на генерирующие электроды 33 преобразователя, расположенные на пьезоподложке 34 (пунктирная линия). Амплитуда напряжения РЧ растет со временем под управлением контроллера 35, осуществляемого по линии 36 управления. Приемные электроды 37 преобразуют акустическое излучение, исходящее из активной зоны, в электрический сигнал, который поступает на вход(ы) 38 приемника/контроллера 35. Данные, полученные после аналого-цифрового преобразования, подвергают сигнальной обработке, извлекая полезные сигналы. В конце концов, результаты записывают и/или представляют оператору.

Некоторые результаты, полученные в Примерах, показаны на фиг.2-7 и 10. Фиг. 2А, 2В, 3А, 3В, 4А, 4В, 4С, 4D, 6В, 7 и 10 представляют собой графики зависимости шумового сигнала (S; произвольные единицы) от амплитуды (А; вольты). Фиг.5А, 5В, 6А и 6С представляют собой графики зависимости шумового сигнала (S; произвольные единицы) от количества частиц (N).

Используются следующие аббревиатуры:

БСА - бычий сывороточный альбумин

БЛ - бульон луриа

ХДИ - хлорид диметиламиноизопропила

ДМАП - диметиламинопиридин

ЭДК - 1,3-диметиламинопропил-3-этилкарбодиимид

N-ГС - N-гидроксисукцинимид

СБФ - соль, буферизованная фосфатом.

ПРИМЕР 1

Латексные сферы диаметром 5 мкм присоединили к поверхности датчика МКК посредством множественных исследуемых связей. Используемые сферы покрывали 1% площади поверхности МКК. Погрешность диаметра сфер составляла лишь 1%.

Датчик МКК содержал полированные кварцевые пластины, обрезанные по фронту акустической волны под углом 35^o, диаметром 8.25 мм. На пластины были осаждены слои хрома (толщиной 20-30 нм), а затем золота (толщиной 100-120 нм).

Провели экспериментальное исследование в воздушной среде трех разных связей: физической связи (латекс-золото), связи стрептовидин-биотин и ковалентной связи (амидная связь). Для создания физической связи латексные сферы поместили непосредственно на поверхность датчика и высушили азотом. Для создания связи стрептовидин-биотин на поверхность наложили биотинилированный БСА и высушили азотом. Для создания химической связи, сформировали монослой тиола, используя тиол с кислотным концом (12-меркаптододеканойную кислоту), растворенный в этаноле; затем ее активировали с использованием ЭДК-N-ГС и добавили сферы с концевой аминогруппой для формирования амидной связи.

Эксперименты проводили в камере, снабженной двумя оптическими окнами: одно из них обеспечивало освещение образца, а другое позволяло наблюдать рассеянный лазерный свет с помощью оптического микроскопа. МКК находились в камере. Для возбуждения МКК использовали генератор сигнала модели DS345 (Стэнфордские исследовательские системы). Движение и отделение частиц наблюдали с помощью оптического микроскопа Olympus ВН-2, оборудованного видеокамерой на приборах с зарядовой связью Panasonic WL-SL300. В качестве основного измерительного устройства выступал синхронный усилитель SR844 (Стэнфордские исследовательские системы). Опорный сигнал подавали на синхронный усилитель с использованием второго генератора, синхронизированного с первым. Все устройства были присоединены к компьютеру для контроля эксперимента и сбора данных.

На фиг.2А показаны спектры силы отрыва для стрептавидин-биотиновой (1) и химической (2) связи; на фиг.2В показан спектр для физической связи.

Регистрируя спектры силы отрыва, можно экспериментально определить величину силы или напряжения, необходимую для разрушения связей. Полученную информацию можно использовать для разделения смеси. В соответствии с графиком, изображенным фиг. 2А, подавая на МКК, на поверхности которых, обработанной биотином, имеется смесь сфер диаметром 5 мкм, некоторые из которых содержат на своей поверхности стрептавидин, тогда как другие не содержат его на своей поверхности, напряжение свыше 0.1 В, но не более 6 В, скажем, 1 В, можно разделить два множества сфер, оставив на поверхностях только сферы, маркированные стрептавидином. Эти методы можно также использовать для обнаружения сфер, маркированных стрептавидином, поскольку с поверхностью, колеблющейся при напряжении 1 В, будут связаны только эти сферы.

Для обеспечения количественных измерений, на основании экспериментальных данных, вычисляли амплитуду колебаний МКК при разных напряжениях, что позволило оценить силу, приложенную к микросфере. Это оценивание осуществляли путем измерения потребления мощности на МКК и их добротности Q (величина, обратная относительной ширине резонансного пика, Q=f/f_{резонанс}). Амплитуда А задана выражением

A = [QP/2³f³M]^1/2,

где Q - добротность, Р - электрическая мощность, потребляемая МКК, f - резонансная частота кристалла кварца, а М - эффективная масса приведенной в движение кварцевой пластины МКК.

Значение Q при 6 В определили равным с. 15000, что дало возможность оценить амплитуду колебаний МКК, равной 60 нм. Таким образом, сила, приложенная к сфере, составляла 9 мкН. Если сравнить это значение с величиной силы, необходимой для разрыва единичной связи стрептавидин-биотин, которая равна 160 пН², получается, что одновременно происходит разрушение приблизительно 60000 связей. Оценка указывает, что это соответствует 50 или более процентам от первоначального количества стрептавидин-биотиновых связей между сферой и поверхностью. Это значит, что большинство связей, присоединяющих сферы к поверхности, разрываются одновременно. Отсюда - резкие пики, наблюдаемые в спектре силы разрыва, и регистрируемый шум при разрушении связей.

ПРИМЕР 2

Из этого Примера явствует, что способы, отвечающие изобретению, можно также осуществлять в растворе. Загрузка жидкости приводит к снижению Q, а следовательно, к снижению амплитуды колебаний при заданном напряжении по сравнению с теми же величинами в воздухе. Слой воды, окружающий микросферу, обуславливает наличие силы вязкости, действующей на микросферу, и увеличение ее эффективной массы, что приводит к возрастанию силы, действующей на сферу.

На фиг. 3 показаны спектры силы отрыва для латексных сфер диаметром 5 мкм, присоединенных к поверхности посредством стрептавидин-биотиновой (фиг. 3А) и химической (фиг.3В) связи. Разрыв происходит соответственно при 1 и 10 В.

Снижение критического напряжения для связи стрептавидин-биотин с коэффициентом 6, т.е. с 6 до 1 В, при переходе из воздуха в воду, как и разрушение химической связи в воде, свидетельствует о преобладании последнего эффекта. Таким образом, этот Пример отчетливо демонстрирует, что разрушение связей, а следовательно, разделение и работа биодатчиков могут иметь место в водной или иной жидкой среде.

Полагая, что физическая, стрептавидин-биотиновая и химическая связи характеризуются одинаковой плотностью связи, и учитывая, что в этих экспериментах использовали микросферы одинакового размера, можно получить относительную шкалу силы отрыва. Для физической:стрептавидин-биотиновой:химической связи она имеет вид 1:60:600. Такое масштабирование выглядит разумным и демонстрирует динамический диапазон способа. Проводя надлежащие калибровочные эксперименты при известных значениях плотности связи, можно обеспечить количественные измерения.

ПРИМЕР 3

Пример демонстрирует обнаружение вирусов и, в частности, генетически модифицированного бактериофага, отображающего белок, связывающий мальтозу, присоединенный к белку оболочки фага pIII, поскольку и фаг, и взаимодействие, связывающее мальтозу, хорошо изучены и легко доступны. Фаг представляет собой длинный, тонкий, нитевидный вирус, состоящий из гибкого стержня длиной 1 мкм и диаметром 6 нм. Генетически модифицированный фаг дополнительно отображает на одном конце вируса до 5 белков, связывающих мальтозу, присоединенных к белку оболочки фага pIII (см. McCafferty et al., Nature, 1990, 348: 552). Этот фаг можно специфически очистить на амилозной смоле.

Присоединение белка, связывающего мальтозу, к концевой аминогруппе индол-глицерофосфатсинтазы было отображено на поверхности fd-фага как присоединение к концевой аминогруппе белка оболочки, закодированного геном III. С этой целью построили вектор pJB113 fd-фага; в нем закодировано генетическое слияние между MalE (E. coli), trpC (E. coli) и геном III. Этот фаговый вектор нес маркер устойчивости к тетрациклину. В качестве немодифицированного конкурирующего фага выступал фаг-помощник VCS M13 К07 (Стратаген), несущий маркер устойчивости к канамицину.

Инфицировав 3 мл mid log фазы LB культуры Escherichia coli штамма TG1 штаммом фага в объеме 10 мкл, получили концентрации бактериофага 110¹² к.о. е. /мл. После 2 часов взбалтывания (250 об/мин) при 37^oС 1 мл культуры инокулировали в 100 мл LB и взбалтывали с частотой 350 об/мин при 37^oС в течение 1 часа. В культуру pJB113 или VCS, выращенную за ночь при 30^oС и 250 об/мин, добавили, соответственно, тетрациклин (10 мг/мл) или канамицин (50 мг/мл). Бактерии были осаждены (15 мин, 4.1 тыс. об/мин), и фаг был выделен из супернатанта добавлением NaCl и PEG6000 до конечных концентраций 0.5 моль и 4% (об/об), соответственно. После выдерживания в течение 1 часа на льду фаг выделили центрифугированием (30 мин, 4.1 тыс. об/мин), осажденный фаг повторно взвесили в 1 мл H₂O и хранили при 4^oС.

Растворимый крахмал (500 мг, 0.01 ммоль, 1 экв.) растворили в ДМФ (N, N-диметилформамид) (10 мл) и перемешивали в течение 5 мин (частично растворили). К 11-меркаптододеканойной кислоте (11.5 мг, 0.05 ммоль, 5 экв.) в ДМФ (0.5 мл) добавили DIC (7.8 мкл, 6.3 мг, 0.05 ммоль, 5 экв.) и DMAP (кат.), и этот раствор добавили в раствор крахмала. Реакционную смесь оставили перемешиваться при комнатной температуре на ночь. Затем реакционную смесь очистили с использованием ячейки с мешалкой с мембранной отсечкой 10000 MW путем промывки раствора milliQ воды (650 мл) и концентрирования с последующей лиофилизацией в течение ночи.

Поверхность подготовили с использованием модифицированного крахмала, содержащего тиольную группу, благодаря которой его можно было химически присоединить к поверхности. МКК (подготовленные аналогично Примеру 1) поместили в раствор крахмала в метаноле (1 мкг на мл) на 12 часов. Затем образцы промыли и высушили струей азота. Для проведения экспериментов в воздухе вирусы осадили на поверхность из раствора и высушили при комнатной температуре. Разбавляя, получили различные концентрации вируса. Для осуществления экспериментов, в которых мальтоза блокирует белок, связывающий мальтозу, в раствор фага добавили 100 нмоль мальтозы.

Таким образом, поверхность МКК оказалась покрытой слоем растворимого картофельного крахмала (который содержит разветвленные полимеры мальтозы), химически присоединенного к поверхности золота посредством связи сера-золото. Эксперименты проводили в воздухе и в воде.

На фиг.4А показан спектр силы отрыва, полученный в воде для смеси в равных количествах фага, связывающего мальтозу (-) и немодифицированного фага (. . .), сканирование было получено в течение 500 секунд. На поверхности золотого электрода находилось приблизительно 500 миллионов экземпляров фага каждого типа. Для немодифицированного и, следовательно, не специфически связанного фага, был зарегистрирован пик отрыва при 1.2 В. Соответствующие пики отрыва для фага, связывающего мальтозу, имели место при напряжении около 9 В и были более интенсивными, чем у не специфически связанного фага, поскольку при разрыве связи высвобождается большее количество энергии. В воздухе никаких пиков, обусловленных специфически связанным фагом, связывающим мальтозу, не было зарегистрировано вплоть до 10 В; на фиг.4В показаны данные, полученные в воздухе исключительно для не специфически связанного фага. Пик имеет место при 7.5 В, и его высота приблизительно в 6 раз превышает высоту пика, зарегистрированного в воде. Второе сканирование (...) не выявило практически никаких пиков, свидетельствуя о том, что фаг был удален с поверхности. Это подтверждает, что в воде, благодаря наличию дополнительных сил вязкого трения и увеличению эффективной массы частицы, разрушение связей между частицами фага и поверхностью происходит легче, чем в воздухе.

Острота пиков в спектре силы отрыва очевидным образом связана с тем фактом, что разрушение связей происходит при пороговом напряжении; это приводит к возникновению акустического шума в течение короткого промежутка времени и, следовательно, делает способ весьма чувствительным. Кроме того, сигнал, обусловленный специфически связывающим фагом, можно легко отличить от сигнала, обусловленного не специфически связывающим фагом, и возникает при более высокой амплитуде, а это означает, что неспецифическое поглощение не оказывает отрицательного влияния на измерение специфического поглощения. Для преодоления специфического взаимодействия между белками, связывающими мальтозу, отображенными на фаге, и поверхностью, покрытой крахмалом, требуется гораздо большая сила, чем для преодоления неспецифических взаимодействий между немодифицированным фагом и поверхностью.

На фиг. 4С показан результат контрольного эксперимента, проведенного в воздухе с фагом, связывающим мальтозу, когда его сайт связывания блокирован мальтозой, с последующим осаждением фага на МКК в центре (верхний график) или по всей поверхности (нижний график); он ведет себя аналогично немодифицированному фагу, подтверждая, что разница обусловлена этими специфическими взаимодействиями. На фиг.4D показан спектр силы отрыва в воде при наличии на поверхности только 1000 экземпляров фага, откуда следует, что явление отрыва все еще регистрируется. Небольшой сдвиг положения пика обусловлен тем, что в результате изменения загрузки добротность Q КММ изменяется в меньшей степени.

Результаты измерений также говорят о том, что для отделения не специфически связанного фага от фага, связывающего мальтозу, можно подавать на МКК возбуждающее напряжение, которое выше порогового напряжения разрушения связей с не специфически связанным фагом, но ниже порогового напряжения разрушения связей с фагом, связывающим мальтозу. Это обеспечивает альтернативный способ скринирования библиотек фагов для связывания, согласно которому связывающей аффинностью фага, остающегося на поверхности, управляют, регулируя величину приложенного напряжения и время, в течение которого оно подается, при условии, что фаг остается жизнеспособным.

Чтобы определить чувствительность способа, находящийся в водной среде фаг, связывающий мальтозу, подвергли эксперименту по разбавлению. На фиг.5А показано (для наиболее интенсивных шумовых пиков вблизи 9 В), что мощность сигнала линейно зависит от количества экземпляров фага в пределах, по меньшей мере, пяти порядков величины и что наличие на МКК приблизительно 200 экземпляров фага можно обнаружить с вероятностью 99%. На фиг.5В показана аналогичная кривая для неспецифически связывающего фага в воздухе, указывающая чувствительность обнаружения 100 экземпляров фага с вероятностью 99%. Количество экземпляров фага, связывающего мальтозу, на поверхности при низком разбавлении было подтверждено непосредственной визуализацией с помощью МАВ.

Этот Пример показывает, что количество экземпляров фага на поверхности МКК можно обнаружить. Напротив, с помощью PCR обнаруживают количество копий вирусного ДНК в растворе. При условии, что все частицы вируса в образце раствора связаны с поверхностью, которое выполняется либо при наличии сильного взаимодействия вирус-поверхность, либо при возможности испарения раствора, в результате чего вирус остается на поверхности, можно непосредственно сравнивать чувствительность. Чувствительность PCR составляет около 100 копий вирусного ДНК на мл, что сравнимо с чувствительностью обнаружения фага в соответствии с данным Примером (без оптимизации). Электронику можно усовершенствовать, и такое усовершенствование позволяет повысить чувствительность, по меньшей мере, на порядок величины. Например, в этих экспериментах применяли однородное осаждение фага на поверхность МКК. Однако, амплитуда и чувствительность МКК имеет пространственную зависимость, а это значит, что сигнал приходит, в основном, из центра МКК (как показано на фиг.4С). Это означает, что, если осаждать фаг только в центре МКК, то зарегистрированных пиков будет меньше, а значит, их интенсивность будет больше, что обуславливает повышение чувствительности.

Этот способ можно непосредственно распространить на обнаружение человеческих вирусов с применением специфических антител к вирусу, присоединенному к поверхности МКК. Эти антитела вступают в специфические взаимодействия с вирусом, присоединенным к поверхности МКК. Эти антитела обуславливают специфические взаимодействия между вирусом и поверхностью, которые можно преодолеть при определенном ускорении поверхности. Неспецифическая абсорбция аналогичных по размеру или более крупных частиц, присутствующих в образце, обуславливает наличие пиков при низком напряжении, как было показано, но это не может оказывать отрицательного влияния на анализ, хотя абсорбция макромолекул на поверхности может приводить к уменьшению количества антител, способных образовывать связь с вирусом. Эффективная масса наиболее распространенных вирусов больше, чем у фага, используемого в этом Примере, хотя количество и сила специфических взаимодействий с поверхностью будет другой. Это значит, что необходимое напряжение должно быть близко к полученному в данном Примере или меньше него.

Этот Пример показывает, что спектроскопия силы отрыва не требует наличия этапа усиления, дает возможность производить количественные измерения, непосредственные измерения и не требует больших затрат. С ее помощью можно осуществлять быструю диагностику вирусной инфекции во многих случаях, в том числе при обследовании пациентов в клинических условиях или растений и животных в сельском хозяйстве.

ПРИМЕР 4

Этот Пример иллюстрирует пробу, связывающую вирус. Для этой пробы пластинки микровесов на кристалле кварца изготовили из полированных кварцевых пластин, обрезанных по фронту акустической волны под углом 35^o (HyQ, Cambridge, UK), и покрыли в камере парового осаждения Эдвардса адгезионным слоем хрома толщиной 30 нм, затем слоем золота толщиной 200 нм, которая определяется калиброванной электрической проводимостью. Затем эти пластинки погрузили в раствор 1 ммоль меркаптододеканойной кислоты в этаноле спектроскопического класса на 18 ч, тщательно промыли этанолом, а затем водой, после чего высушили струей азота. Затем эти пластинки погрузили на 20 мин в смесь N-ГС (100 ммоль) и ЭДК (400 ммоль). После этого их тщательно промыли водой, а затем погрузили на 1 ч в раствор 50 мкг/мл мышиного моноклонального антитела IgG, продуцированного против гликопротеина D HSV I в 10 ммоль СБФ при рН 7.0. Затем их промыли водой и погрузили на 10 мин в 1 моль раствора этаноламина при рН 8.5. После этого их тщательно промыли водой и сохраняли при 4^oС в 1 мл СБФ.

Количество вирусных частиц/мл в растворе штамма вируса, очищенного фиколом, определяли с использованием электронной микроскопии по внутреннему стандарту латексных сфер. Раствор штамма HSV gD⁺ с концентрацией 510¹⁰ вирусных частиц/мл подвергли последовательным десятикратным разбавлениям в СБФ (10 ммоль Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 2.7 ммоль КСl, 120 ммоль NaCl, pH 7.4), содержащей БСА (0.1 мг/мл) и хранили при 4^oС. Пластинки МКК установили с помощью беспаечных контактов в приборе, и либо 1 мкл, либо 40 мкл каждого из этих разбавленных растворов поместили на поверхность пластинки, покрытую антителом IgG против gD. По прошествии 40 мин поверхность тщательно промыли водой, а затем покрыли 40 мкл СБФ и просканировали МКК от 0 до 10 В.

Результаты представлены на фиг.6. Фиг.6А представляет собой график зависимости сигнала (шумовой пик вблизи 7.5 В) от количества частиц симплексного вируса герпеса gD⁺ для 1 мкл (о) и 40 мкл () образцов; точки данных хорошо ложатся на линии. Фиг.6 представляет собой график зависимости шума от амплитуды для вируса gD⁺ и gD^-. Вирус gD^-, который не имеет специфического взаимодействия с антителом на поверхности, не демонстрирует пиков; напротив, вирус gD⁺ демонстрирует резкий пик вблизи 7.5 В.

ПРИМЕР 5

Для этого анализа бактериального связывания пластинки МКК подготовили, как в Примере 4. Е.coli и S.aureus (лабораторные штаммы) были выращены в бульоне экстракта мозг сердце/0.5% дрожжи и инкубированы на ночь при 37^oС. 1 мл образца каждой культуры довели до концентрации 10¹⁰ к.о.е./мл, которую определяют по оптической плотности, и центрифугировали с ускорением 12000 g в течение 2 мин; осадок повторно взвесили в стерильной СБФ. 10 мкл бактериальной взвеси поместили на пластинку МКК, покрытую антителом IgG против Е. coli подобно тому, как описано в Примере 4 для антитела против HSV. По прошествии 40 мин поверхность тщательно промыли водой, а затем покрыли 40 мкл СБФ и просканировали МКК от 0 до 10 В.

Результаты приведены на фиг.7. График шум/амплитуда демонстрирует резкий пик при напряжении около 6 В для Е. coli и никакого пика для S.aureus.

ПРИМЕР 6

В этом Примере использовали устройство ПАВ, показанное на фиг.9. В данном случае использовали единственный прибор (НР8512а, Hewlett Packard), который объединяет усилитель 1 и блок 5 приемника и управления в едином приборе. Прибор настроили на режим незатухающей гармонической волны и развертки по питанию. Устройство ПАВ представляло собой коммерчески доступный прибор RF1171 от RF Monolitics, Inc. На поверхность ПАВ нанесли около 100000 латексных сфер диаметром 1 мкм. Полученный спектр представлен на фиг.10. Он содержит несколько пиков, отсутствующих на чистой поверхности. Это свидетельствует о том, что устройство ПАВ можно использовать для регистрации явления разрушения. Различные пики, возможно, соответствуют скоплениям сфер на поверхности, имеющим разные размеры, и поэтому пики наблюдаются в разных положениях.