способ индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды

Формула изобретения

Способ индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды, включающий подготовку исследуемого материала и его концентрирование, посев материала в питательную среду, культивирование, кипячение пробы в течение 1 ч, отделение супернатанта и его исследование в полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что концентрирование исследуемого материала осуществляют селективной сорбцией на магноиммуносорбентах путем встряхивания суспензии исследуемого материала и магноиммуносорбентов с концентрацией 5-6 мкл/мл в течение 15-20 мин, отмывкой в магнитном поле стерильным физиологическим раствором, культивирование проводят в селективной среде в течение 1,5-2,0 ч с использованием в качестве ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры смесь полимиксина и триметаприма в равных количествах с концентрацией смеси 23-25 мкг/мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано дня выявления возбудителя сибирской язвы в низкой концентрации в объектах внешней среды (почва, вода, смывы, сточные воды, воздух и др.).

Трудности индикации Bacillus anthracis в объектах внешней среды обусловлены не только низкой концентрацией, но и сходством его с другими видами аэробных спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus.

Традиционные методы индикации возбудителя сибирской язвы включают подготовку суспензии пробы, приготовление мазков, окрашивание их антиспоровой люминисцирующей сывороткой и микроскопию с использованием люминисцентного микроскопа. Чувствительность этого метода не превышает 10⁵ спор/мл пробы и чаще всего недостаточна для обнаружения возбудителя в почве. Кроме того, даже адсорбированные люминисцирующие глобулины не дают 100% специфичности и могут давать ложноположительные результаты со спорами Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis (Буравцева Н.П. с соавт., 1998).

В последнее время интенсивно развиваются способы детекции возбудителей инфекционных заболеваний в биологическом материале и объектах внешней среды с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые позволяют обнаружить микроб с чувствительностью 10-100 м.к./мл в течение 5-6 ч.

В основе ПЦР лежит амплификация участка генома путем многократного копирования специфичной для данного микроорганизма нуклеотидной последовательности (Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Т.2. Саратов, 1998, с.162-169).

Индикация сибиреязвенного микроба в объектах внешней среды, например, почве, стоках и т.д., методом ПЦР затрудняется низкой концентрацией микроорганизмов, присутствием посторонней микрофлоры, наличием споровых форм, которые трудно поддаются лизированию, а следовательно получению ДНК, необходимой для проведения реакции.

Представляет интерес селективное концентрирование микроорганизмов магноиммуносорбентами. Известен набор устройств и приспособлений для различных манипуляций с магноиммуносорбентами (Пат. РФ 2098828, G 01 N 33/553, С 12 М 1/00, 10.12.97. Бюл. 34).

При селективном концентрировании микроорганизмов на магносорбентах с иммобилизированными на их поверхности специфическими антителами значительно повышается надежность и чувствительность индикации микроорганизмов в объектах внешней среды за счет реакции антиген-антитело.

Однако такие методы обнаружения могут использоваться для установления присутствия или отсутствия патогеннных бактерий, а для определения их эпидзначимости требуются дальнейшие исследования.

В клинической практике проведен ряд исследований по объединению иммуномагнитной сорбции и полимеразной цепной реакции с последующей гибридизацией ДНК-зондом для обнаружения бактерий в патологическом материале.

На магнитные носители наносятся специфические иммуноглобулиновые фракции или моноклональные антитела и инкубируются в бактериальных суспензиях.

Носители со связанными антигенами подвергаются кипячению и в супернатанте амплифицируются ДНК-мишени с последующей идентификацией специфических фрагментов (Oral. MicrobioL Immunol. 1997, Oct. 15, р. 311-317; J. Glin. Microbiol. Immunol., 1995, Nov.11, pp.2908-2912; PCR Methods Appl, 1992, Nov. 2, pp. 167-171; J. Clin. Microbiol, 1992, Nov. 306, pp. 2801-2806).

При использовании этого способа на 7 часов, по сравнению с традиионным, сократилось время проведения анализа. Повысилась чувствительность и специфичность индикации. Например, при исследовании испражнений на наличие Bacterioides forsythus иммунофлуоресцентным методом положительная реакция отмечалась в 62% случаев, а при использовании сочетанного применения магноиммуносорбции, ПЦР⁴ и гибридизацией ДНК-зондами в 82%.

Однако использование этого метода при индикации возбудителя сибирской язвы не обеспечивает достаточной надежности и чувствительности при выявлении его в объектах внешней среды, что обусловлено наличием спор и сопутствующих спорообразующих микроорганизмов.

Наиболее близким к заявляемому является способ индикации Bacillus anthraсis с использованием полимеразной цепной реакции (Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Т.1, Саратов, 1998, с.77-79). Согласно этому способу исследуемый материал, сконцентрированный путем фильтрации в объеме 0,1-1,0 мл засевается в 5 мл бульона Хоттингера рН 7,2-7,3 и подращивается при 37^oС в течение 3 ч. Затем в бульон вносится пенициллин до конечной концентрации 1000 ед/мл и инкубируется еще 1 ч. После этого 0,5-1,0 мл содержимого переносится в пробирку типа "Eppendorf" и центрифугируется 20 мин при 6-8 тыс. об/мин. Надосадочная жидкость отбирается для проведения ПЦР.

После амплификации по программе, соответствующей праймерам продукт в объеме 10 мкл, наносится в гнезда 1,5% агарозного геля и подвергается электрофорезу при напряжени 60-100 V в течение 15-45 мин. Параллельно с исследуемыми образцами ставятся контроли: положительный с ДНК Bacillus anthracis и отрицательный со стерильной деионизированной водой. После окрашивания геля бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в течение 30 мин просматривают гель в ультрафиолетовых лучах. Положительным результатом является наличие полос ДНК с такой же электрофоретической подвижностью, как в положительном контроле и отсутствие таковых в отрицательном.

Недостатком способа-прототипа является недостаточная надежность индикации микроорганизмов из объектов внешней среды при их низкой концентрации (до 10 м.к./мл), наличии спор сапрофитов и другой сопутствующей микрофлоры.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение надежности индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды при его низкой концентрации за счет повышения чувствительности способа и его ускорения.

Технический результат достигается тем, что способ включает подготовку исследуемого материала, концентрирование его селективной сорбцией на магноиммуносорбентах путем встряхивания суспензии исследуемого материала и магноиммуносорбентов с концентрацией 5-6 мкл/мл в течение 15-20 мин, культивирование в селективной среде в присутствии ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры, в качестве которых используется смесь полимиксина и триметаприма в равных количествах с концентрацией смеси 23-25 мкг/мл, кипячение пробы в течение 1 ч, отделение супернатанта и последущее исследование в ПЦР.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Сорбция исследуемого материала на магноиммуносорбентах при встряхивании в течение 15-20 мин с концентрацией магноиммуносорбентов 5-6 мкл/мл, что обеспечивает достаточно полный селективный отбор микроорганизмов из исследуемого материала при его низких концентрациях за счет образования комплекса антиген-антитело.

Культивирование пробы в селективной среде в течение 1,5-2,0 ч, содержащей в качесве ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры смесь полимиксина и триметаприма в концентрации 23-25 мкл/мл, позволяет получать культуру Bacillus anthracis в вегетативной форме, которая в отличие от споровой легко лизируется и обеспечивает выход ДНК сибиреязвенного микроба при минимальном присутствии ДНК сопутствующих микроорганизмов, что в конечном счете дополнительно повышает чувствительность и специфичность индикации возбудителя сибирской язвы.

Возможность практического использования заявляемого способа подтверждается примерами его конкретного выполнения.

Пример 1. Исследуемый материал, концентрированный путем фильтрации в объеме 0,1-1,0 мл. Засевали в 5 мл бульона Хотгингера, рН 7,2-7,4, и подращивали в термостате при 37^oС в течение 3 ч. Затем в бульон добавляли пенициллин до конечной концентрации 1000 ед/мл и продолжали инкубировать еще 1 ч, после чего 0,5-1,0 содержимого переносили в пробирки типа "Eppendorf" и центрифугировали 20 мин при 6-8 тыс. об/мин. Для постановки ПЦР использовали надосадочную жидкость.

Возможны следующие варианты постановки ПЦР:

а) для выявления фрагмента 256 п.н. гена cap В с праймерами C1 C2 и фрагмента 407 п.н. гена pag с с праймерами Р1 и Р2.

Реакционная смесь содержала по 12 пМ праймеров, 8 мМ смеси dNTP, 1,5 мМ MgCl₂, 1 ед. Taq-полимеразы и 5-10 мкл исследуемого материала. Программа амплификации: 30 циклов 92^oС - 1 мин, 46^oС - 1 мин, 70^oС - 1 мин (И.И. Тучков, А.Н. Куличенко, И.Г. Дроздов, 1994).

б) для выявления фрагмента хромосомы 152 п.н. с праймерами R1 и R2. Реакционная смесь содержала 0,5 мкМ праймеров, 200 мкМ смеси dNTP, 1,5 мМ MgCl₂, 1 ед. Taq-полимеразы и 5-10 мкл исследуемого мериала. Программа амплификации: предварительная денатурация при 94^oС - 1 мин, затем 40 циклов 94^oС - 1 мин, 60^oС - 1 мин, 72^oС - 1 мин (Patra e.a., 1995). Амплификация проводилась в термоциклере "Amply 250". Параллельно с образцами ставились контроли: положительый с ДНК Bacillus anthracis и отрицательный со стерильной деионизированной водой в количестве 5 мкл.

По завершении амплификации продукты в объеме 10 мкл наносилсь в гнезда 1,5% агарозного геля и подвергались электрофорезу при 60-120 V в течение 15-45 мин. После окрашиваня геля бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в течение 30 мин просматривали гель в УФ лучах.

Чувствительность метода составила 2000 спор в 1 мл суспензии почвы.

Пример 2. Вытяжку из почвы контаминировали спорами Bacillus anthracis с содержанием 10, 50, 100, 250, 500, 1000 и 2000 м.к./мл, добавляли 5 мкл/мл 10% суспензии сибиреязвенных магноиммуносорбентов и выдерживали 20 мин при комнатной температуре при периодическом встряхивании. Затем магноиммуносорбенты отмывали, переносили в пробирку типа "Eppendorf" с 1 мл бульона Хоттингера и инкубировали при 37^oС в течение 2 ч.

Пробы после подращивания лизировали кипячением в течение 1 ч, центрифугировали и исследовали в ПЦР с праймерами R1 и R2 к хромосомальной последовательности Ва 813 и праймерами P1, P2, C1, C2 к последовательностям к плазмидным генам pag и cap. Амплификацию проводили в термоциклере "Perkin Elmer 2400". Параллельно ставили положительный контроль с ДНК Bacillus anthracis и отрицательный со стерильной деионизированной водой.

Для праймеров к плазмидной последовательности (Р1, P2, C1, C2) реакционная смесь содержала: Н₂O до конечного объема 25 мкл, 2,5 мкл x 10 реакционного буфера, 1,5 мМ MgCl₂, 0,4 мкл BSA, 8 мМ смеси dNTP, 1 мкл праймеров, 5 мкл исследуемой ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы. Программа амплификации: 30 циклов, 92^oС - 30 с, 46^oС - 30 с, 72^oС - 30 с.

Для выявления хромосомальной последовательности Ва 813 с праймерами R1 и R2 реакционная смесь содержала: Н₂О до конечного объема 25 мкл, 2,5 мкл. х10 реакционного буфера, 1,5 мкл. MgCl₂, 1 мкл. BSA, 200 мкМ смеси dNTP, по 0,5 мМ праймеров, 5,0 мкл исследуемой ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы. Программа амплификации: предварительная амплификация 94^oС 5 мин, затем 40 циклов; 94^oС - 30 с, 60^oС - 30 с, 72^oС - 30 с.

После проведения амплификации продукты в объеме 10 мкл наносились в гнезда 1,5% агарозного геля и подвергались электрофорезу при напряжении 90-100 V в течение 20-45 мин. Предварительно окрашенный бромистым этидием гель просматривался в ультрафиолетовых лучах.

Чувствительность данного метода составила 500 спор в 1 мл суспензии почвы при одновременном определении детерминант вирулентности.

В работе использовали магноиммуносорбенты, приготовленные на основе аллюмосиликата и адсорбированного на нем сибиреязвенного иммуноглобулина (Пат. РФ. 2138813, G-01, 33/543 от 27.09.99. Бюл. 27).

Пример 3. Проводится аналогично примеру 2, за исключением того, что подращивание исследуемого материала, адсорбированного предварительно на магноиммуносорбенты, проводилось на селективную среду, состоящую из бульона Хоттингера, к которому в качестве ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры была добавлена смесь полимиксина и триметаприма.

При учитывании результатов ПЦР чувствительность метода составила 50 спор в 1 мл суспензии почвы.

Как показали экспериментальные исследования, заявленные режимы концентрирования и инкубирования исследуемой культуры выбраны оптимально. Уменьшение концентрации магноиммуносорбентов менее 5 мкл/мл и времени перемешивания менее 15 мин снижает чувствительность способа, увеличение же этих параметров нецелесообразно. Уменьшение времени культивирования менее 1,5 ч и концентрации смеси ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры ниже 23 мкг/мл приводит к понижению чувствительности ПЦР при низкой концентрации возбудителя сибиреязвенной инфекции в объектах внешней среды. Увеличение указанных параметров нецелесообразно.