пептид, обладающий регулирующей биологической активностью на белковый синтез в гепатоцитах

Формула изобретения

Гептапептид лизил-глутамил-аспартил-аланил-пролил-глицил-пролин общей формулы Lys-Glu-Asp-Ala-Pro-Gly-Pro, обладающий стимулирующим и регулирующим действием на белковый синтез в гепатоцитах.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской биохимии, в частности к новому гептапептиду, обладающему пролонгированным регулирующим и стимулирующим действием на белковый синтез в гепатоцитах крыс и свободному от побочной психотропной активности. Особенно значительное пролонгированное регулирующее и стимулирующее действие обнаружено на гепатоцитах старых крыс, что делает перспективным создание на основе гептапептида препаратов с геронтологической направленностью.

Известно, что возрастные изменения приводят не только к снижению уровня синтеза белков гепатоцитами печени, но и нарушается синхронизация синтеза белка [1].

Известен трипептид формулы Gly-His-Lys, который в регуляторных концентрациях способен увеличивать интенсивность белкового синтеза в гепатоцитах [2] . Однако данные по влиянию трипептида на интенсивность белкового синтеза в монослойных культурах с плотным расположением гепатоцитов были получены на бедных средах. Использование среды, обеспечивающей полноценную жизнедеятельность гепатоцитов, полностью снимает положительное влияние трипептида.

Известен тетрапептид формулы Lys-Glu-Asp-Ala, обладающий способностью стимулировать функциональную активность гепатоцитов (патент Российской Федерации 2166957, А 61 К 38/07, 2001) [3]. Этот тетрапептид действует в регуляторных концентрациях и увеличивает интенсивность белкового синтеза в монослойных культурах с плотным расположением гепатоцитов на средах, обеспечивающих полноценную жизнедеятельность гепатоцитов. Однако, этот тетрапептид не имеет пролонгированной регулирующей биологической активности на белковый синтез в гепатоцитах и обладает побочным психотропным действием.

Задачей изобретения являлось создание биологически активного пептидного препарата, обладающего пролонгированным стимулирующим действием на амплитуду и ритм синтеза белка в гепатоцитах в регуляторных наномольных концентрациях и свободного от побочного психотропного действия.

Поставленная задача решена синтезом нового гептапептида лизил-глутамил-аспартил-аланил-пролил-глицил-пролин общей формулы Lys-Glu-Asp-Ala-Pro-Gly-Pro, построенного только из природных аминокислот. Гептапептид Lys-Glu-Asp-Ala-Pro-Gly-Pro, отвечающий изобретению, проявляет биологическую активность, а именно оказывает пролонгированное стимулирующее действие на амплитуду и ритм синтеза белка в гепатоцитах и свободен от побочной психотропной активности.

Синтез предлагаемого гептапептида проводят на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 431А дициклокарбодиимидным методом в присутствии 1-гидроксибензотриазола с использованием 9-флуоренилметокси-карбонил-(Fmос)-защищенных аминокислот.

В качестве твердой фазы для синтеза гептапептида используют смолу p-Benzyloxybenzyl Alcohol Resin (Novabiochem). Снятие пептида со смолы и гидролиз защитных групп проводят обработкой в течение 2 часов в атмосфере азота смесью, состоящей из трифторуксусной кислоты (90%), воды (5%) и этандитиола (5%). Смесь концентрируют в вакууме, пептид осаждают холодным сухим эфиром. Полученный гептапептид очищали с помощью хроматографии на ВЭЖХ колонке Kromasil С 18 12х250 мм 7 мкм, используют градиентное элюирование водным ацетонитрилом, содержащим 0,1% трифторуксусной кислоты с расходом элюента 3 мл/мин. Элюент А - 0,1% трифторуксусная кислота, элюент Б - 40% ацетонитрил в буфере А. Используют градиент 20-60% Б за 40 мин. Собирают фракцию 28-34 мин. Собранную фракцию упаривают под уменьшенным давлением на роторном испарителе досуха. Получают 11 мг белого препарата, который растворяют в буфере А и вводят в ту же колонку для рехроматографии. Детекцию проводят при длине волны 220 нм. Собирают пик с временем удерживания 32 минуты. Продукт упаривают под уменьшенным давлением, а потом еще дважды с этанолом. Продукт растворяют в воде и подвергают лиофильной сушке. Получают 10 мг белого лиофильно высушенного продукта. Т. пл. 132-136^oС.

Анализ продукта проводят с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем фирмы Silufol. Хроматографическая подвижность (Rf) для гептапептида в системе растворителей хлороформ : метанол : аммиак (6:4:1) составляет 0,42. Проверку гомогенности пептида проводили с помощью аналитической ВЭЖХ на колонке Kromasil С 18 4х150 мм 5 мкм, используют градиентное элюирование водным ацетонитрилом с расходом элюента 1 мл/мин. Элюент А - 0,1% трифторуксусная кислота, элюент Б - 40% ацетонитрил в буфере А. Используют градиент 30-50% Б за 20 мин. Детекцию проводят при длине волны 220 нм. Гептапептид хроматографируется одним пиком. Содержание основного вещества 98,5%.

Аминокислотный анализ: Asp 1,0 (1), Glu 1,2 (1), Ala 1,1 (1), Gly 0,9 (1), Pro 1,8 (2), Lys 1,0(1).

Результаты анализа аминокислотного состава гептапептида свидетельствуют о том, что состав соответствует заданной для синтеза структуре.

Пример 1. Активность заявляемого гептапептида влиять на интенсивность белкового синтеза оценивали по его влиянию на интенсивность белкового синтеза в монослойных культурах гепатоцитов. Сравнивали активность заявляемого гептапептида и известного тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala.

Для изоляции гепатоцитов печень крысы перфузировали бескальциевым раствором Хенкса с 0,5 мМ ЭГТА и затем 0,05% раствором коллагеназы в среде 199. Клеточную суспензию фильтровали и центрифугировали. Взвесь гепатоцитов в концентрации 510⁵ вводили в чашки Петри, на дне которых были стекла, покрытые коллагеном. Использовали среду 199 без бычьей сыворотки с добавлением 0,2 мг/мл альбумина и 5 мкг/мл инсулина. Предварительно было установлено, что в такой среде синтез белка столь же интенсивен, как в среде 199 с бычьей сывороткой, и морфология клеток полноценно сохранена [4]. Чашки со стеклами помещали в термостат при 37^oС, аэрированный воздухом с добавлением СО₂. Через 2 часа стекла с прикрепившимися клетками отмывали и среду заменяли на такую же. Через сутки, отмыв культуры, исследовали синтез белка в культурах. При указанной концентрации клеточной взвеси к 24 часам образуются монослойные культуры с плотным расположением гепатоцитов.

Интенсивность синтеза белка оценивали по включению [³H]лейцина с поправкой на пул свободной аминокислоты в той же культуре. Рассчитывали относительное включение [³H]лейцина (I_coп), корректирующее интенсивность синтеза как от вариабильности пула, так и от различия в числе клеток в разных культурах. При оценке уровня синтеза белка рассчитывали среднее значение для 5-7 культур. Кинетика синтеза определялась при изучении проб из трех культур (каждую культуру измеряли индивидуально), которые брали с интервалами в 10 минут в течение 2 часов. В этом случае средний уровень синтеза считали по 36 культурам. Культуру гепатоцитов инкубировали 10 минут в среде с объемной концентрацией 30 мкКи/мл [³H]лейцина с молярной активностью 150 Ки/мМ. Образцы, содержащие гептапептид и тетрапептид, сравнивали с контролем, который культивировали в тех же условиях, но без добавления пептида.

После инкубации культуры с меченым лейцином отмывали средой и для выделения невключившегося лейцина (пула) обрабатывали холодной (4^oС) хлорной кислотой 90 мин. Ту же культуру споласкивали этиловым спиртом и затем растворяли белки гиамином. Радиоактивность пула свободного внутриклеточного лейцина и в гиаминовой фракции клеточных белков после добавления соответствующих сцинтилляторов измеряли на счетчике SL-30.

Интенсивность синтеза белка рассчитывали по формуле:

I_corr=I_i X P_av/P_i (сpm),

где I_i - измеренная радиоактивность белков определенной культуры i,

P_i - суммарная радиоактивность белков и пула той же культуры,

P_av - средняя радиоактивность белков и пула для культур данного опыта,

I_corr - включение лейцина с поправкой на пул свободного лейцина.

Получены данные о действии гептапептида с концентрацией 0,005 мкг/мл (6 нМоль/л) в течение 2, 4 и 24 часов. После 4-часовой инкубации культур гепатоцитов 4-месячной крысы с гептапептидом с концентрацией 0,005 мкг/мл найдено достоверное повышение интенсивности синтеза белка (I_corr) на 12%. Через 24 часа после введения гептапептида в культуру клеток гепатоцитов величина I_corr достоверно увеличивается на 25%. Тетрапептид также имеет положительное влияние на синтез белка, однако, как следует из результатов, приведенных в таблице 1, его положительное влияние уменьшается при увеличении времени воздействия от 4 до 24 часов. Увеличение I_corr для тетрапептида через 24 часа составляет 9%, что значительно меньше, чем наблюдаемое при 4-часовом его воздействии и составляет 27%. Таким образом, гептапептид обладает пролонгированным положительным влиянием на синтез белка в гепатоцитах, в то время как действие тетрапептида значительно снижается и он не обладает пролонгированным действием.

Гептапептида обладает более значительной активностью на гепатоциты старой крысы, чем для молодой крысы. В контроле для 18-месячной крысы I_corr составляет 180, а под действием гептапептида в течение 4 часов возрастает до 226, то есть наблюдается достоверное увеличение на 26%. При 24-часовом воздействии гептапептида в концентрации 0,005 мкг/мл (6 нМоль) его влияние увеличивается. Наблюдается почти двукратный рост величины I_corr, характеризующей интенсивность синтеза белка. Наряду с ростом синтеза белка происходит значительное увеличение амплитуды ритма синтеза в 1.46 раза (чертеж). Амплитуда ритма синтеза белка в культуре характеризует степень синхронизации метаболизма клеток. В гепатоцитах старых крыс происходит значительное снижение амплитуды ритма синтеза белка, а под 24-часовом воздействии гептапептида наблюдается значительное увеличение синтеза белка и амплитуды его ритма. Таким образом, под действием гептапептида гепатоциты старой крысы функционально начинают напоминать гепатоциты молодой крысы. Благодаря своему уникальному строению заявляемый гептапептид обладает пролонгированной положительной активностью на культуру клеток, в то время как тетрапептид пролонгированной активностью не обладает.

Пример 2. Активность заявляемого гептапептида влиять на поведение беспородных белых крыс-самцов оценивали в тестах "Auto-Track System" (ATS) и "приподнятый крестообразный лабиринт" (ПКЛ). Сравнивали активность заявляемого гептапептида и известного тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala.

Эксперименты выполнены на 46 беспородных белых крысах-самцах массой 20010 г, полученных из питомника "Крюково-Центральное" и содержавшихся в условиях вивария при температуре 20-22^oС, световом режиме 12/12 (свет с 7 до 19 часов), пищевом и питьевом режиме ad libitum. Период акклиматизации, предшествующий началу исследований, составлял не менее двух недель.

По двигательной активности в Auto-Track System (Columbus Instruments, США) - тест длительностью пять минут и весу животные были распределены на гомогенные группы. Уровень тревожности определяли с помощью Elevated Plus-Maze (тест "приподнятый крестообразный лабиринт" - ПКЛ), приподнятого на высоту 50 см и собранного из двух открытых (45х10 см), двух закрытых рукавов (45х10х40 см) с открытой крышей и центрального квадрата (в месте соединения) со стороной 10 см. Животных помещали индивидуально в центр ПКЛ мордой к открытому рукаву и исследовали в течение 5 минут следующие параметры:

а) количество вхождений в открытый/закрытый рукав;

б) время, в течение которого животное находилось в открытом/закрытом рукавах.

Каждое животное использовали только один раз. Использовали внутрибрюшинное введение гептапептида в дозах 20 мкг/кг и 100 мкг/кг в 0,2 мл физиологического раствора. Контрольным крысам эквивалентно вводили физиологический раствор в объеме 0,2 мл. Инъекции проводили за 30 мин до тестирования. Математическую обработку данных проводили, используя Descriptive Statistics, дискриминантный и корреляционный анализы. Данные по влиянию заявленного гептапептида на поведенческую активность приведены в таблице 2. В дозах 20 и 100 мкг/кг заявленный гептапептид достоверно не изменял уровень тревожности животных в системе ПКЛ. В результате трехкратной оценки поведенческого статуса в системе ATS не отмечено достоверных отличий ни в горизонтальной двигательной - пройденное расстояние, ни в вертикальной - количество стоек, активности животных. Заявленный гептапептид в дозах 20 и 100 мкг/кг не влияет на психомоторную активность животных в рассматриваемых тестах.

Сравнительные данные по влиянию известного тетрапептида Lys-Glu-Asp-Ala на поведенческую активность приведены в таблице 3. В результате трехкратной оценки поведенческого статуса в системе ATS продемонстрировано постепенное снижение горизонтальной и вертикальной двигательной активности животных при попадании их в систему. Инъекция тетрапептида снижала эффекты повторного тестирования. Тенденция к сохранению исходной двигательной и исследовательской активности была дозозависимой и наиболее выраженной при использовании дозы препарата 20 мкг/кг. Тетрапептид достоверно снижает ориентировочные реакции животных, вызывая снижение времени нахождения в открытом рукаве ПКЛ почти в 5 раз (р<0,05) и количество выходов в открытый рукав в 3 раза. Таким образом, известный тетрапептид влияет на поведение животных и обладает побочной психомоторной активностью. Заявляемый гексапептид обладает избирательным действием и не влияет на психомоторную активность.

Пример 3. Активность заявляемого гептапептида влиять на эндогенную опиоидную систему оценивали по его ингибиторному действию на энкефалиндеградирующие ферменты плазмы крови. Воздействие на эндогенную опиоидную систему является одним из возможных механизмов действия гептапептида.

Время полужизни регуляторных пептидов в организме, как правило, не превышает нескольких минут. В тканях организма имеется набор энкефалиндеградирующих ферментов, уменьшающих в два раза концентрацию эндогенных пептидов за 1-2 мин. В гидролизе принимают участие аминопептидазы, определяющие около 70% общей энкефалиндеградирующей активности, а также ряд диамино- и дикарбоксипептидаз. Действие пептидных ингибиторов энкефалиндеградирующих ферментов приводит к увеличению времени воздействия эндогенных опиоидных пептидов на ткани организма, что вызывает эффект, сходный с увеличением их концентрации. Энкефалиназную активность в присутствии исследуемых пептидов определяли in vitro по скорости ферментативной деградации [³H]лей-энкефалина (120 Ки/мМ).

Инкубационная смесь (конечный объем 50 мкл) содержала 4 мкКи (660 нМ) [³H]лей-энкефалина, 50 мкМ гептапептида, 25 мМ трис-НСl (рН 7,4) и 0,15М NaCl. Реакцию начинали добавлением в инкубационную смесь 5 мкл сыворотки крови, полученной стандартным методом от здоровых доноров. Инкубацию проводили при температуре 37^oС в течение 30 минут и прерывали добавлением 5 мкл 0,2 М НСl. Продукты гидролиза радиоактивного лей-энкефалина разделяли методом хроматографии на ВЭЖХ колонках. Данные по анализу продуктов ферментативного гидролиза [³H] лей-энкефалина в присутствии 50 мкМ гептапептида и без него приведены в таблице 4.

Показано ингибирующее влияние гептапептида на активность энкефалиндеградирующих ферментов сыворотки крови человека. Степень превращения лей-энкефалина уменьшилась примерно в два раза для инкубационной смеси, содержащей 50 мкМ гептапептида. В присутствии гептапептида содержание минорных продуктов ферментативного гидролиза, связанных с действием диамино- и дикарбоксипептидаз, оказалось менее 1%. Заявленный гептапептид оказался более эффективным ингибитором, чем лейпептин, используемый как неспецифический энкефалиназный ингибитор и действующий на тиоловые пептидазы. Концентрация лейпептина, при которой активность энкефалиназ плазмы крови снижается в два раза (IC₅₀), составляет около 100 мкМ.

Таким образом, на гепатоцитах старой крысы обнаружен высокий геронтологический эффект пептида Гепталив. Интенсивность белкового синтеза в гепатоцитах старых крыс увеличивается почти вдвое при одновременном росте амплитуды ритма синтеза белка в полтора раза через 24 часа после введения в культуральную среду пептида в концентрации 0,005 мкг/мл (6 нМоль).

Полученные данные могут свидетельствовать о том, что в дозах 20 и 100 мкг/кг при внутрибрюшинном введении, гептапептид не влияет на психомоторную активность животных в рассматриваемых поведенческих тестах. Это указывает на избирательное влияние гептапептида и на отсутствие психотропных эффектов в рассматриваемых дозах.

Исследование способности гептапептида влиять на биохимические параметры функционирования эндогенной опиоидной системы показало, что он обладает выраженным ингибирующим действием на сывороточные ферменты деградации энкефалинов. Гептапептид оказался более эффективным, чем такой известный пептидазный ингибитор, как лейпептин.

Источники информации

1. Бродский В.Я., Хавинсон В.Х., Золотарев Ю.А., Нечаева Н.В., Малинин В. В. , Новикова Т.Е., Гвазава И.Г., Фатеева В.И. Влияние пептидов на ритм синтеза белка в культурах гепатоцитов крыс разного возраста. II Известия РАН (Сер. биол). 2001. 5. С. 517-521.

2. Pickart L., Thaler M.M. Tripeptide in human serum which prologs survival of normal liver cells and stimulates growth in neoplastic liver. Nature new biology, 1973, V. 243, С. 85-87.

3. Хавинсон В.Х. Патент Российской Федерации 2166957, А 61 К 38/07, БИ 14, 2001.

4. Бродский В.Я., Нечаева Н.В., Терских В.В. и др. Бессывороточная среда, сохраняющая нормальную морфологию и высокий уровень синтеза белка в гепатоцитах in vitro. Известия РАН (Сер. биол). 1996. 4. 398-401.