штамм бактерий escherichia coli № 27 0138:к 88, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ВГНКИ № 270138: К 88 - МГАВМ и Б-ДЕП, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к получению штаммов для изготовления вакцин для профилактики колибактериоза (эшерихиоза) животных.

Колибактериоз (эшерихиоз) - инфекционная болезнь, вызываемая энтеропатогенными эшерихиями, широко распространен во многих странах мира и наносит значительный экономический ущерб животноводству, складывающийся из высокой смертности молодняка (телят в первые дни жизни, а ягнят в послеотъемный период), снижения привесов, потери продуктивности у переболевших животных, поэтому актуальность борьбы с данным заболеванием - очевидна.

Известны штаммы следующих серологических групп и сероваров для изготовления поливалентной гидроокисьалюминиевой формолвакцины против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят, ягнят:

Вакцина против колибактериоза поросят: 08: К 43, 09: К 30, 078: К 80, 0138: К 81, 0139: К 82, 0141: К 87, К 88, 0147: К 89:К 88, 0149: К 91: К 88 (1 вариант) и

Вакцина против колибактериоза телят и ягнят: 08: К 43, 09:К 30, 015: К 14,30, 020, 026: К 60, 041,055,078: К 80, 086: К 61: Н 32, 0115, 0117: К 62: Н 4, 0101: К 99 (2 вариант) (1).

Известен также штамм Escherichia coli BГHKИ 453-37/17, как продуцент адгезивных антигенов - 0115: К 88.

Антиген К 88 имеет белковую природу и состоит из белковых субъединиц с мол. м. 25000-26200 дальтон, определенной путем электрофореза в SДS - 11% полиакриламидном геле (в качестве стандартов использован бычий альбумин, трипсин и лизоцим с мол. м. соответственно 68000, 35000, 24000 и 14600 дальтон).

Лиофилизированный препарат содержит 95-96% белка, 2-3% липидов и 1-2% углеводов. Антиген К 88 термолабилен и денатурируется при температуре 70^oС в течение 30 мин. Изоэлектрическая точка антигена К 88 при рН 3,5.

Штамм Escherichia coli 453-37/17 (0115: К 88) обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства. Полиморфные палочки размером 0,8-1,52,0-6,0 мм, не образуют спор, перетрихии окрашиваются по Граму отрицательно.

Культуральные свойства. На МПА образуют круглые колонии с ровными краями, слегка выпуклые, серо-белого цвета без пигмента, слизистые, мелкозернистые с диаметром 2-4 мм и более. На среде Эндо колонии малинового цвета с металлическим отливом. Штамм находится в стойкой S-форме и в обычных условиях не диссоциирует. На МПБ видимое помутнение среды наблюдается через 4-5 ч культивирования при температуре 37-38^oС.

Ферментативные свойства. Образует индол, не образует сероводород, дает положительную реакцию с метиленовым красным на среде Кларка, не образует ацетил-метил-карбинол, не растет на среде Симонса, среде с цианистым калием, не разжижает желатину и свернутую кровяную сыворотку, свертывает, но не пептинизирует молоко, восстанавливает нитраты и нитриты, сбраживает с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, маннит, арабинозу, мальтозу, ксилозу, трегалозу, сорбит, рафинозу, не сбраживает дульцит, сахарозу, адонит, инозит, целлобиозу.

Серологические свойства. Подлинность и серологическую активность штамма адгезивного антигена К 88 определяют в РДП с МкАт или моноспецифической анти-К 88 сывороткой (титр 1:64). Титр антигена в этой реакции составляет (1:16)-(1:32).

Антигенная активность. Определяют в опытах на кроликах путем внутрибрюшинного введения антигена с последующим тестированием сыворотки крови кроликов в РА с моноплазмидным штаммом. Титр антител в сыворотке крови должен быть не ниже 1:1600 (2).

В задачу наших исследований входило - получить штамм Escherichia coli с адгезивным антигеном К 88, обладающий высокой антигенной и иммуногенной активностью против колибактериоза (эшерихиоза).

Предложенный производственный штамм бактерий Escherichia coli 27 0138: К 88 - возбудитель колибактериоза отнесен к семейству Enterobacteriaceae, к роду Escherichia coli, выделен НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ из тонкого отдела кишечника теленка, совхоз "Гремячинский", Тульской обл., в 1988 г.

Штамм депонирован 27 апреля 2001 г., регистрационный номер - "штамм Escherichia coli 27 0138: К 88 - МГАВМиБ-ДЕП" во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, Россия, Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, ВГНКИ).

Местом хранения производственного штамма Escherichia coli 27 0138: К 88 - возбудителя колибактериоза определена коллекция НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (109472, Москва, ул. Ак. Скрябина, 23), дублирующее хранение НИИ микробиологии МО РФ (610024, Россия, г. Киров, Октябрьский п-т 121, в/ч 23527).

Предложенный штамм бактерий Escherichia coli 27 0138: К 88 обладает следующими свойствами.

Антиген К: 88 белковой природы.

Нуклеотидный состав ДНК (%ГЦ) - 51,4, содержит плазмиды с MB 60 МДа и 5 МДа.

Морфологические, культуральные и ферментативные свойства. Грамотрицательные, подвижные, полиморфные палочки, образуют полупрозрачные "S"-колонии через 13. . . 24 ч роста на плотной питательной среде при температуре 36... 38^oС.

Для повышения продукции гемолизинов и адгезинов используется среда "Минка".

Ферментативная активность. Ферментирует глюкозу, лактозу, мальтозу, рамнозу, сахарозу, маннит, сорбит, не ферментирует инозит, образует индол, не образует сероводород, уреазу, ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра.

Серологические свойства. Агглютинируется с сыворотками: "0"-коли 0138 и антиадгезивной К 88 в реакции агглютинации на стекле. Токсигенность. Штамм продуцирует термолабильный энтеротоксин.

Антигенная активность. При введении антигена животным вырабатывается антитоксический и гуморальный иммунитет.

Патогенные свойства. Вирулентен для новорожденных телят, при пероральном заражении в дозе 10 млрд. м.т. на 2-3 сутки вызывает проявление клинических признаков и на 5 сутки - гибель животных.

Вирулентность. ЛД₅₀ для белых мышей внутрибрюшинно 4,610⁷ живых микр. клеток.

Применяемый способ поддержания и хранения штамма. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах при температуре (-18). ..(-20)^oС после пассажа через организм белых мышей.

Периодичносто пересева на питательных средах. 15-20 суток.

Условия транспортировки. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах.

Срок хранения. 10 лет.

Пример 1. Штамм бактерий Escherichia coli 27 0138: К 88, выращивают в реакторах при температуре 36...38^oC в казеиновом бульоне, при интенсивном механическом перемешивании и аэрации стерильным воздухом в течение 10-16 час. Концентрация микробных клеток составляет 50-60 млрд. м.к. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. К.А. Тарасевича, что дало возможность применить штамм для изготовления инактивированной вакцины против колибактериоза (эшерихиоза) молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей.

Вакцина, изготовленная с использованием предложенного штамма, обеспечивает защитный эффект от заражения вирулентными эпизоотическими штаммами после подкожной иммунизации через 5-7 суток.

Вакцина, изготовленная со штаммом Escherichia coli 27 0138: К 88, апробирована с положительным результатом с 1995 по 2001 г. на территории России и стран СНГ: Беларусь, Кыргыстан, Узбекистан и др. на: 11550 головах стельных коров, 7290 супоросных свиноматок, 4270 овцематок, 2290 пушных зверей.

Сохранность поголовья составляет 96-99%.

Предложенный гроизводственный штамм может быть использован для производства биопрепаратов (вакцины и диагностикумов), а также для получения гипериммунных лечебных сывороток и глобулинов.

Источники информации

1. Ж. "Ветеринария", 8, 1993, стр. 5-7.

2. Патент РФ 2043771, кл. А 61 К 39/108, 1995.