способ оценки токсичности загрязнителей вод дальневосточных морей

Формула изобретения

Способ оценки токсичности загрязнителей вод дальневосточных морей, включающий выдерживание тест-объекта в тестируемых растворах, регистрацию физиологического ответа и сравнение полученных результатов, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют предличинок длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к рыбной промышленности, конкретно к прикладной экологии и токсикологии, и может быть использовано для оценки токсичности загрязнителей вод дальневосточных морей при проектировании и прогнозировании хозяйственной деятельности человека.

Известен способ количественного определения фосфорорганических пестицидов (А.С. СССР 1111270, МПК 4 А 01 К 61/00, G 01 N 33/18), предусматривающий помещение в раствор с анализируемой пробой в качестве тест-объектов дафний (Daphnia magna), учет продолжительности их выживания при 34-36^oС и последующее определение количества пестицида по калибровочному графику.

Известен способ обнаружения токсичных катионов металлов в воде (А.С. СССР 1168168, МПК 4 А 01 К 61/00, G 01 N 33/18), заключающийся в помещении в анализируемую пробу в качестве тест-объекта (Daphnia magna), и учете продолжения их выживаемости.

Известно устройство для биологической оценки токсичности жидкостей (А.С. СССР 1242082, МПК 4 А 01 К 61/00), включающее камеру, выполненную из прозрачного материала, с размещенными в ней ветвистоусыми ракообразными, систему подведения воды к камере и отведения ее, блок подведения воды, источник света и последовательно фотоприемник, усилитель и формирователь импульсов.

Известно устройство для биологической оценки токсичности воды (А.С. СССР 946027, МПК 4 А 01 К 61/00, G 01 N 33/18), содержащее резервуар для размещения моллюсков, заполняемый исследуемой водой, и прибор, регистрирующий движение створок моллюсков.

Известен способ определения токсичности водных сред (А.С. СССР 1270699, МПК 4 G 01 N 33/18, C 02 F 3/32), включающий исследование адаптации в них гидробионтов - брюхоногих моллюсков (используют или Lymnaea lagotis, или Lymnaea auricularia, или Viviparus viviparus), предварительную калибровку степени чувствительности и устойчивости гидробионтов к эталонному токсиканту, проведение тестовых воздействий на опытные серии гидробионтов определенными концентрациями исследуемых сред, обеспечивая постоянство внешних условий и ступенчатое нарастание концентраций при воздействии на каждую из последующих серий гидробионтов, регистрации поведения гидробионтов, вычисление по ней двигательной активности для каждой концентрации и оценку степени токсичности водных сред.

Известен способ определения токсичности водных сред (А.С. СССР 1112276, МПК 3 G 01 N 33/18, C 02 F 3/32) путем исследования адаптации в них гидробионтов - брюхоногих моллюсков (Lymnaea lagotis и Lymnaea auricularia). Осуществляют предварительную калибровку степени чувствительности и устойчивости гидробионтов к эталонному токсиканту, производят тестовые воздействия на опытные серии гидробионтов определяемыми концентрациями исследуемых сред, обеспечивая постоянство внешних условий и ступенчатое нарастание концентраций при воздействии на каждую из последующих серий гидробионтов, регистрируют реакцию поведения гидробионтов, вычисляют по ней их двигательную активность для каждой концентрации и оценивают степень токсичности водных сред путем сравнивания рассчитанных по двигательной активности уровней выживаемости гидробионтов контрольной и опытной серий.

Известен способ биоиндикации токсичности водной среды (А. С. СССР 1546904, МПК 5 G 01 N 33/18, А 01 К 61/00), предусматривающий помещение моллюсков Lymnaea stagualis в камеры с исследуемой средой и чистой водой - опыт, контроль, их выдерживание, введение радиоактивной метки, извлечение их и сравнивание состояния моллюсков в опыте и контроле и установление наличия загрязнения по отклонению величины истинной радиоактивности моллюсков в опыте по сравнению с контролем.

Известен способ биотестирования токсичности сточных вод (А.С. СССР 1573376, МПК 5 G 01 N 33/18) путем регистрации у рыб электрокардиограммы и изменения RR-интервалов.

Известен способ оценки токсичности сточных вод (А.С. СССР 1097947, МПК 3 G 01 N 33/18, C 12 Q 1/00) с помощью микроорганизмов, где в качестве тест-объекта использован штамм Saccharomyces cerevisial 15В-П4.

Известен способ биологической оценки токсичности воды и устройство для биологической оценки токсичности воды (А. С. СССР 1068083, МПК 3 А 01 К 61/00, G 01 N 33/18), предусматривающий разделение дафний на две группы - основную и контрольную, размещение каждой группы в соответствующей камере, пропуск через камеру с контрольной группой дафний чистой воды и через камеру с опытной группой - исследуемой воды, регистрацию физиологического состояния дафний в группах и сравнение полученных результатов.

Известен способ определения степени токсичности воды (А.С. СССР 1405745, МПК 4 А 01 К 61/00, G 01 N 33/18), содержащий токсические соединения, обладающие мембранолитической активностью, предусматривающий внесение в емкость со средой инкубирования и пигментсодержащим тест-объектом исследуемой пробы воды и установление степени токсичности находящихся в ней соединений путем контроля изменения интенсивности выхода пигментов в среду инкубирования под действием токсических соединений. В качестве среды инкубирования используют морскую воду и в качестве пигментсодержащего тест-объекта используют морские красные водоросли рода Callithamnion.

Известен способ определения токсичности химических веществ (А.С. СССР 1564539, МПК 5 G 01 N 33/18, 33/00), включающий культивирование штамма Saccharomyces cerevisial 15В-П4 на жидкой питательной среде, воздействие на него исследуемого вещества с последующей оценкой полученных результатов.

Известен способ оценки токсичности жидкости (А.С. СССР 1515105, МПК 4 G 01 N 33/18), предусматривающий культивирование фотосинтетического тест-объекта, освещение тест-объекта светом и определение люминесцентных характеристик, по изменению которых судят о токсичности контролируемой жидкости.

Известен способ биоиндикации тяжелых металлов в морской воде (А.С. СССР 1479876, МПК 4 G 01 N 33/18), предусматривающий помещение в камеры с чистой водой и инкубацию тест-объекта - макроводорослей, адаптацию их к фоновому содержанию тяжелых металлов, деление камер на две группы - опытные и контрольные, добавление в опытные камеры с макроводорослями исследуемой воды, измерение физиологической характеристики водорослей, их сравнение и заключение о повышенном содержании тяжелых металлов в исследуемой воде по сравнению с фоном при статистически достоверном отличии значений физиологической характеристики тест-объекта, в опыте по сравнению с контролем.

Известен способ биоиндикации токсичности сточных вод (А.С. СССР 1578650, МПК 5 G 01 N 33/18, А 01 К 61/00), предусматривающий помещение биологического тест-объекта в пробы с чистой (контроль) и исследуемой (опыт) водой, выдерживание в них, регистрацию физиологического показателя тест-объекта и суждение о токсичности исследуемой воды при отличиях физиологического показателя в опыте по сравнению с контролем, где в качестве тест-объекта используют культуру диссоциированных клеток губок.

Известен способ определения цианидов в сточных водах (А.С. СССР 1576860, МПК 5 G 01 N 33/18), включающий отбор пробы воды, инкубирование в ней водных растений с последующим определением активности фермента.

Известен способ определения токсичности водных сред (А.С. СССР 1328756, МПК 4 G 01 N 33/18, C 02 F 3/34), включающий предварительную адаптацию гидробионтов к условиям содержания в чистой водной среде и калибровку степени чувствительности гидробионтов к эталонному токсиканту, где в качестве гидробионтов используют рыб, моллюсков, речных раков, высшие водные растения.

Известен способ определения токсичности жидкостей и устройство для его осуществления (А. С. СССР 1010557, МПК 3 G 01 N 33/18), включающий предварительное культивирование фотосинтезирующего тест-объекта, введение клеток тест-объекта в камеру реакции с контрольной жидкостью для определения физиологического состояния тест-объекта, подачу в камеру контролируемой жидкости, выдерживание тест-объекта и определение его физиологического состояния с последующим сравнением физиологического состояния тест-объекта в контролируемой и контрольной жидкостях.

Известен способ контроля воды на токсичность (А.С. СССР 1440729, МПК 4 А 01 К 61/00, G 01 N 33/18) путем оценки состояния жаберного аппарата карповых рыб.

Известен тест-объект для определения генотоксичности водорастворимых ксенобиотиков (А.С. СССР 1784147, МПК 5 А 01 К 61/00, G 01 N 33/18), где для определения генотоксичности водорастворимых ксенобиотиков в качестве тест-объекта применяются аквариумные рыбы вида Hotobranchius guntheri.

Известен способ оценки токсичности водной среды (А.С. СССР 1784914, МПК 5 G 01 N 33/18), предусматривающий выдерживание биологического тест-объекта в анализируемой среде, регистрацию физиологического параметра тест-объекта и суждение о токсичности анализируемой среды по величине параметра, где в качестве биологического тест-объекта используют отрезок колеоптля растения.

Известен способ оценки токсичности водной среды (А.С. СССР 1784915, МПК 5 G 01 N 33/18, А 01 К 61/00), предусматривающий внесение ракообразных-фильтраторов в опытную и контрольную среду с суспензией микроводорослей, выдерживание их, регистрацию параметра, характеризующего трофическую активность ракообразных-фильтраторов, и отнесение к токсичной исследуемой воды в случае отличия опытных данных от контрольных, где в качестве ракообразных-фильтраторов используют рачка Epishura baicalensis.

Известен способ оценки токсичности водной среды (Патент РФ 2003097, МПК 5 G 01 N 33/18, А 01 К 61/00), предусматривающий помещение в опытную и контрольную среды бентосных губок, выдерживание их регистрацию физиологического параметра губок и суждение о токсичности исследуемой среды по полученным опытным данным в сравнении с контрольными.

Известен способ биологической оценки токсичности водной среды (А.С. СССР 1837225, МПК 5 G 01 N 33/18), включающий воздействие на биологический тест-объект постоянным электрическим током и последующую оценку токсичности, где в качестве тест-объекта используют нервно-мышечный препарат лягушки.

Известен способ определения содержания меди в водной среде (А.С. СССР 1835234, МПК 5 G 01 N 33/18), предусматривающий помещение оплодотворенных яйцеклеток двустворчатых моллюсков в пробы с чистой (контроль) и исследуемой (опыт) водой, инкубацию, получение личинок и суждение о присутствии меди при отличиях физиологического показателя в опыте по сравнению с контролем.

Известен способ контроля токсичности водной среды (Патент РФ 1814510, МПК 5 А 01 К 61/00, G 01 N 33/18), предусматривающий культивирование тест-объектов - организмов зоопланктеров-фильтраторов, помещение их в исследуемую водную среду, подачу в среду пробного корма, представляющего собой суспензию шариков из полимерного материала, измерение параметра, характеризующего фильтрационную активность организмов и коррелирующего с их физиологическим состоянием, и суждение о токсичности среды на основании измерения.

Известен способ определения токсичности природных вод (Патент РФ 2029948, МПК 6 G 01 N 33/18), включающий адаптацию и измерение параметров движения водных животных, где в качестве тест-объекта используют морских ракообразных гаммарусов.

Известен способ определения токсичности воды (А.С. СССР 1762232, МПК 5 G 01 N 33/18), включающий инкубацию пробы с тест-объектом, с последующим определением, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют эритроциты крови.

Известен способ обнаружения токсичности жидкости (А.С. СССР 1702304, МПК 5 G 01 N 33/18), заключающийся во введении в контрольную и исследуемую среды тест-объекта с последующим изменением электрохимического отклика электродов, размещенных соответственно в контрольной и исследуемых средах, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используется водоросль рода Cylorella.

Известен способ определения водной среды (А.С. СССР 1698757, МПК 5 G 01 N 33/18), предусматривающий определения методом темных и светлых склянок количества кислорода, потребленного совместно автотрофными и гетеротрофными организмами в чистой и исследуемой воде и отнесение исследуемой воды к токсичной при отклонении данных, полученных в опыте, от контрольных.

Известен способ определения пестицидной интоксикации рыб (А.С. СССР 1693548, МПК 5 G 01 N 33/18), предусматривающий разделение рыб на опытную и контрольную партии, помещение опытной партии рыб в исследуемую среду, отбор проб крови у рыб обеих партий, отмывку и гемолиз эритроцитов, определение концентрации гемоглобина, обработку нитритом натрия, установление времени полуокисления гемоглобина путем регистрации динамики экстинкции раствора, сравнение опытных и контрольных данных и установление пестицидной интоксикации у рыб опытной партии в случае отклонения опытных данных от контрольных.

Известен способ определения концентрации N-трибутилстаннил-4-хлорфталимида в водной среде (А.С. СССР 1689847, МПК 5 G 01 N 33/18) путем внесения разведении вещества в лунки питательного агара, засеянного тест-культурой, с последующим определением концентрации вещества по величине зон ингибирования роста тест-культуры, отличающийся тем, что с целью повышения точности определения в качестве тест-культуры используют штамм бактерий Bacillus sphaericus 386.

Известен способ определения токсического воздействия химических веществ, содержащихся в водной среде, на культуру планктонных гидробионтов (А.С. СССР 168816147, МПК 5 G 01 N 33/18), предусматривающий культивирование планктонных гидробионтов в опытных и контрольных термостатируемых камерах, введение в опытные камеры исследуемой среды, выдерживание культуры гидробионтов в присутствии исследуемой среды, измерение при выдерживании средней скорости движеия по ансамблю гидробионтов в опыте и контроле методом корреляционно-доплеровской спектроскопии, оценку отношения числа подвижных гидробионтов в культуре к числу неподвижных, соответственно в опыте и контроле, оценку по полученным данным величины энергозатрат гидробионтов на движение и суждение о токсическом воздействии исследуемой среды по величине энергозатрат гидробионтов на движение в опыте.

Известен способ анализа жидкой среды на присутствие мелатонина (А.С. СССР 1645892, МПК 5 G 01 N 33/18), предусматривающий помещение бесхвостных амфибий в качестве тест-объекта в культурную среду, добавление в нее тестируемого образца, выдерживание в ней тест-объекта, регистрацию характера распределения пигмента в пигментных клетках (меланофорах) тест-объекта и определение присутствия мелатонина в тестируемом образце по степени посветления тест-объекта, отличающийся тем, что с целью повышения точности и упрощения анализа, а также расширения функциональных возможностей способа, в качестве тест-объекта используют изолированные участки кожи предварительно адаптированных к темному фону в течение не менее 45 мин личинок бесхвостых амфибий, а выдерживание тест-объекта с тестируемым образцом проводят на свету в течение не менее 30 мин, при этом объем культурной среды составляет от 1 до 2 мл.

Известен способ определения токсичности вод и водных растворов, содержащих биологически активные вещества (А. С. СССР 1751669, МПК 5 G 01 N 33/18), путем воздействия исследуемой пробой на растительные клетки с последующей оценкой, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, воздействие осуществляется путем введения части исследуемой пробы в межлистники листецов ряски.

Известен способ определения токсичности промышленных сточных вод (А.С. СССР 1751670, МПК 5 G 01 N 33/18), предусматривающий отбор проб микроорганизмов активного ила, их инкубацию в средах с компонентами сточных вод и контрольной чистой водой, последующее центрифугирование сред, дезинтеграцию, определение фракций белков электрофорезом в плоских блоках полиакрилполиамидного геля, окрашивание фракций белка с установлением молекулярных форм фермента и их активности в опытных и контрольных средах и отнесение опытной среды к токсичной в случае изменения активности молекулярных форм фермента в опытной среде по сравнению с контролем.

Известен способ определения качества воды в прибрежных рекреационных зонах моря (А. С. СССР 1751671, МПК 5 G 01 N 33/18, А 01 К 61/00), предусматривающий отбор проб воды в исследуемой зоне, оценку в них численности двух групп тест-микроорганизмов и определение качества воды по численности этих тест-микроорганизмов, где в качестве тест-микроорганизмов используют гетеротрофные галотолерантные и сапрофитные микроорганизмы.

Известен способ определения степени закисления водоемов (А.С. СССР 1741068, МПК 5 G 01 N 33/18, А 01 К 61/00), предусматривающий отбор из водоема проб с биологическим тест-объектом, анализ биологической характеристики тест-объекта и суждение о степени закисления водоема по этой характеристике, отличающийся тем, что с целью упрощения способа в качестве тест-объекта используют окуней, а в качестве биологической характеристики - наличие и характер рисунка центра закладки чешуи, взятой в районе спинного плавника.

Известен способ оценки токсичности водных сред (А.С. СССР 1730581, МПК 5 G 01 N 33/18, А 01 К 61/00), предусматривающий помещение биологического тест-объекта в пробы с чистой контрольной и исследуемой - опытной средой, выдерживание в них, последующую регистрацию двигательной активности тест-объекта и отнесение исследуемой среды к токсичной при отсутствии двигательной активности тест-объекта в опыте по сравнению с контролем, отличающийся тем, что с целью повышения точности оценки в качестве тест-объекта используют личинки губки.

Известен способ определения токсичности воды (А.С. СССР 1709212, МПК 5 G 01 N 33/18), включающий инкубирование тест-организма в светопроницаемой ячейке, заполненной исследуемой водой в темноте и на свету с последующим установлением значения фотосинтеза путем измерения с помощью кислородного датчика концентрации кислорода в исследуемой воде в световой фазе, отличающийся тем, что в качестве тест-организма используют высшие водные растения.

Известен метод биотестирования при мониторинге прибрежных зон, где в качестве тест-объекта используются эмбрионы иглокожих и двустворчатых моллюсков (И. В.Ходаков. Метод использования ранних эмбрионов черноморской мидии для биотестирования при мониторинге прибрежных зон северо-западного шельфа // Тезисы всероссийской конференции "Экосистемы морей России в условиях антропогенного пресса (включая промысел)", Астрахань, 20-22 сентября, 1994. Астрахань, 1994. - С. 352-353), предусматривающий культивирование тест-объектов, где началом эксперимента является момент помещения осемененных яйцеклеток в тестируемую среду. Критерием воздействия тестируемой среды на развитие культуры эмбрионов является достоверное отличие между распределениями эмбрионов по стадиям дробления в контроле и тестируемой среде (хи-квадрат), для его расчета подсчитывают примерно по 500 эмбрионов в каждой повторности контроля и тестируемой пробы после фиксации формалином. Сравнение степени токсичности проб производится при помощи показателей синхронности дробления отдельно для групп одно-, двух- и четырехклеточных эмбрионов, взятых в отношении к контролю.

Известен способ суждения о токсичности воды по определению аномалий развития у атлантических рыб при воздействии загрязняющих веществ (Pollution and development abnormalities of Atlantic fishes / Longwell Arlene Crosby, Chang Sukwoo, Habert Andrew, Hughes Jamts В., Perry Pean // Environ. Biol. Fish. 1992. - 35, 1. Р. 1-21). На пелагической икре скумбрии, Scomber scombrus показано, что загрязнение воды вызывает смертность, аномалии в развитии и аномальное деление хромосом у эмбрионов. Взрослые особи этого вида, а также ромба, Scophthalmus acquosus и зимней камбалы, Pseudopleuronectes americanus, из наиболее загрязненных прибрежных районов обладают большой долей митотических аномалий, чем рыбы из менее загрязненных районов средней и северной Атлантики. Развитие генетической и эпигенетической резистентности к влиянию загрязнений может зависеть от флюктуации среды, изменений климата и интенсивности рыболовства.

Известен способ определения токсического влияния сточных вод на эмбрионов и личинок морских рыб (Effects of sewage sludge on marine fish embryos and larvae / Costello Mark J., Gamble John С. // Mar. Environ, res. - 1992, - 33, 1. - Р. 49-74), заключающийся в выявлении достоверного токсического влияния сточных вод на выживаемость эмбрионов сельди (Clupea harengus) и трески (Gadus morhua).

Известна работа по выявлению влияния меди и свинца на эмбрионов и личинок карпа при двух температурах (Effect of copper and lead on common carp embryos and larvae at two temperatures / Lugowska kanarzyna, Jezierska Barbara // Folia Univ. agr. Stetin. Pise. - 2000, 26. - P. 29-38). Исследовано влияния Сu в концентрации 0,2 и 0,25 мг/л и Рb в концентрации 2,0 мг/л при температуре 20 и 26^oС на эмбриональное развитие, а также на качество и дальнейшее развитие личинок карпа.

Известна работа по сравнению ответов предличинок щуки и плотвы на низкий рН и алюминий: приток натрия, развитие и активность (Comparison of the responses of the yolk-sac fry of hike (Esox lucius) and roach (Rutilus rutilus) to low pH and aluminium: Sodium influx, development and activity / Keinanen Marja, Peuranen Seppo, Nikinmaa Mikko, Tigerstedt Christina, Vuorinen Pekka J. // Aquat Toxicol. - 1999. - 47, 3-4. - Р.161-179), в которой рассматривается воздействие кислой воды и А1 на только что вылупившихся личинок кислотно-толерантной щуки и кислотно-чувствительной плотвы во время 1-10 дневного опыта, а также обсуждается влияние снижения уровня метаболизма в содержащей А1 воде предличинок щуки на их выживаемость.

Известна работа по определению биологического последствия совместного воздействия нефтепродуктов и ХОП на эмбриогенез осетровых рыб (Варобьева А. А. Биологические последствия совместного воздействия нефтепродуктов и ХОП на эмбриогенез осетровых рыб // Тез. докл. 1-й науч.-прктич. конф. "Проблемы современного товарного осетроводства", Астрахань, 24-25 марта, 1999. - Астрахань, 1999. - С. 120-121). Работы велись на икре и на выклюнувшихся эмбрионах осетра и севрюги. Экспериментальным путем установлено, что сочетание смеси хлорорганических пестицидов (ХОП, ДДТ) с нефтепродуктами (дизельное топливо L-0,5 ГОСТ305-82) более опасно для развивающейся икры и эмбрионов, чем каждого отдельно взятого ингредиента, поскольку нефтепродукты усиливают растворимость пестицидов в воде. Смесь вызвала их гибель в более короткий срок и при меньших концентрациях (в 1,5-2 раза). Во всех случаях более уязвимы эмбрионы на стадии выклева и ранние личинки в сравнении с икрой.

Известна работа по определению влияний стадий развития и продолжиельности экспозиции на эмбриотоксичность диазинона (The role of development and duration of exposure to the embryotoxicity of diazinon / Hamm J.T., Hinton D. E. // Aquat. Toxicol. - 2000. - 48, 4. - С. 403-418). Изучалось воздействие диазинона в концентрации 1-26 мг/л на развитие медаки. Ежедневное макроскопическое изучение эмбрионов и личинок выявило основные морфологические проявления токсичности - отек желточных вен, перикардиальную водянку, деформацию позвоночника, недостаточное наполнение плавательного пузыря.

Известны некоторые данные по физиолого-биохимическим реакциям радужной форели в период раннего развития на отравление дициклопентадиеном (Курзыкина Л. Г. , Артемьева Н.В., Судакова Н.М. Некоторые данные по физиолого-биохимическим реакциям радужной форели в период раннего развития на отравление дициклопентадиеном // 8-я научная конференция по экологии, физиологии и биохимии рыб, 30 сентября - 3 октября, 1992: Тез. докл. Т. 1 / Кар. науч. центр РАН. Ин-т биол. - Петрозаводск, 1992. - С. 181-182), в которой показано, что дициклопентадиен (ДЦПД) в концентрации 500-1000 мг/л ингибирует образование кровеносной системы у эмбрионов форели, даже при концентрации 5-10 мг/л капилляризация тканей эмбрионов была снижена. После действия ДЦПД в течении 62 суток (концентрация 0,01-5 мг/л) количество холестерина и липидов у личинок форели было снижено на 17-22%, соответственно показано влияние ДЦПД на интенсивность потребления O₂.

Известна работа по определению субхронической токсичности формальдегидовых ванн для икры и молоди рыб в зависимости от жесткости воды (Subchronische Fischtoxizitat von Formaldehydbadern auf Eier und Brut in Abhangigkeit von der Wasserharte / Meinelt Т., Stuber A. // Fisher und Meichwirt. - 1992. - 43, 8. - Р. 294-295. На икре и личинках полосатого данио (Brachydanio rerio) исследовали токсичности длительных формалиновых ванн в зависимости от жесткости воды. Общая жесткость воды в исследованных растворах 37%-ного формалина составляла 308,8 и 62,5 мг СаСO₃/л. Оценку результатов опытов проводили каждые 24 ч при общей их продолжительности 144 ч. Установлено, что и в мягкой и в жесткой воде концентрация формалина 0,264 мкг/л не оказывала влияния на выживание икры и вылупление молоди. Выживание выклюнувшихся личинок в жесткой воде несколько снижено, а в мягкой воде резко снижено уже при концентрации формалина 0,198 мкл/л. В контроле отмечали поражение икры грибами: в группах с жесткой водой грибы развивались на мертвой икре, а в группах с мягкой водой - на мертвой икре и ближайших живых икринках в первые 24 ч. Во всех случаях с формалином грибов на икре не отмечали. Число деформированных личинок в группах с формалином было несколько выше, чем в контроле. Чтобы предотвратить отход молоди, обработку формалином рекомендовано прекращать до начала выклева.

Известна работа по определению ответа циклазной системы икры радужной форели на действие тяжелых металлов (Михкиева B.C., Шишкова Н.А., Заличева И. Н. Ответ циклазной системы икры радужной форели на действие тяжелых металлов // Биологические ресурсы водоемов бассейна Балтийского моря: Тезисы докладов 23 Научной конференции по изучению водоемов Прибалтики / АН СССР, - Петрозаводск, 1991. С. 102.) Изучали активность ферментов, синтезирующих циклические нуклеотиды в икре форели, при действии солей Zn и РЬ. По выживаемости икры сделан вывод о токсичности всех использованных в эксперименте солей. Высказывается предположение, что изменения обмена веществ в развивающейся икре форели при действии солей тяжелых металлов, приводящие к значительной гибели материала, можно связать с флюктуацией активностей компонентов циклазной системы.

Известна методика оценки влияния загрязнителей водной среды на эмбриогенез рыб (Костров Б.П., Дохолян В.К. Методика оценки влияния загрязнителей водной среды на эмбриогенез рыб // Методы ихтиотоксикологических исследований: Тезисы докладов Первого Всесоюзного симпозиума по методам ихтиотоксикологических исследований Ленинград, октябрь 1987, - Л., 1987. - С. 65-67). Определяли влияние токсических веществ на эмбриональное развитие рыб путем выяснения мутагенной способности загрязнителей. Проведенные исследования на икре и личинках кутума, толстолобика, вьюна, осетровых, лососевых при воздействии токсикантов органической и неорганической природы позволили выявить достоверное возрастание уровня аномальных митозов в концентрациях токсикантов, не вызывающих нарушений эмбриогенеза.

Известен способ определения токсического действия различных загрязняющих веществ (растворенные нефтепродукты, полихлорированные бифенилы, свинец, цинк, ртуть, медь) на рыб, находящихся на ранних стадиях онтогененза (Патин С. А. Влияние загрязнения на биологические ресурсы и продуктивность Мирового океана. - М.: "Пищевая промышленность", 1979. - С. 157-160), где в качестве тест-объектов используются икра и личинки Trachurus trachurus, Acipenser gldenstdti, Saimo trutta caspius, Hypophtalmichthys molitrix, Cyprinus carpio, Rutilus frisii kutum. Определены характеристики действия токсикантов LC₅₀ (в мкг/л) на развивающуюся икру и личинки некоторых морских и пресноводных рыб (продолжительность опытов 2-7 суток).

До настоящего времени для оценки токсичности загрязнителей дальневосточных морских вод использовались молодь и взрослые мизиды - (Черкашин С.А. Реакция избегания гидробионтами (молодь рыб и ракообразные) некоторых токсикантов: автореф. дис. канд. биол. наук. - Севастополь, 1986. - 17 с.), веслоногие ракообразные (Черкашин С.А. Использование метода функциональных нагрузок для оценки состояния зоопланктона и качества вод дальневосточных морей //Всероссийская конф. "Экосистемы морей России в условиях антропогенного пресса (включая промысел)": Тез. докл. Калининград. 1994. - С. 541-543), креветки (Блинова Н.К., Черкашин С.А. Влияние фенола на хеморецепцию антеннул травяного чилима //Биологические науки, 1987. 2. - С.44-48, Терновенко В.А. Биотестирование морской среды с помощью поведенческих реакций ракообразных: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Севастополь, 1989. - 24 с. ), иглокожие на различных стадиях эмбрионального развития - (Ващенко М.А. Влияние водорастворимых углеводородов легкого дизельного топлива на развитие половых клеток и качество потомства у морского ежа Strongylocentrotus nudus // Биология моря. 1980, 4. - С. 68-73, Мойсейченко Г.В., Черкашин С.А. Использование гамет, эмбрионов и личинок морского ежа для оценки токсичности буровых растворов и их компонентов // Биология моря, Т. 21, 6, 1995. - С. 419. Мойсейченко Г.В.. Щеглов В.В., Лукьянова О.Н. Биологические эффекты тяжелых металлов, содержащихся в буровых растворах //Вопросы рыболовства. 2000. Т. 1 2-3, ч.2. - С. 59-60), мидии (Карпенко А.А., Тюрин А.Н. Влияние сублетальных воздействий некоторых факторов среды на поведение двустворчатых моллюсков и вопросы биотестирования //Биология шельфовых зон Мирового океана: Тез. докладов Всесоюзной конф. по морской биологии. Владивосток, 1982, ч. 3. - С. 121-123, Христофорова Н.К. Биоиндикация и мониторинг загрязнения морских вод тяжелыми металлами. - Л.: Наука, 1989. - 192 с., Челомин В.П., Бельчева Н.Н. , Захарцев М.В. Биохимические механизмы адаптации мидии Mytilus trossulus к ионам кадмия и меди // Биология моря. - 1998. - Т.24, 5. - С. 319-325.), гребешки - (Карпенко А.А., Тюрин А.Н. Влияние сублетальных воздействий некоторых факторов среды на поведение двустворчатых моллюсков и вопросы биотестирования //Биология шельфовых зон Мирового океана: Тез. докладов Всесоюзной конф. по морской биологии. Владивосток, 1982, ч. 3. - С. 121-123, Холоденко Г. М. , Мойсенченко Г.В. Черкасова И.В. Гистохимия пищеварительной системы сеголеток приморского гребешка при интоксикации цинком // V Всесоюзная конференция по водной токсикологии, Одесса, 18-22 апреля 1988 - Одесса, 1988. - С. 150, Щеглов В.В., Мойсейченко Г.В., Черкашин С.А., Огородникова А.А. Общие закономерности изменения устойчивости разных стадий онтогенеза морских гидробионтов к токсическому действию тяжелых металлов и нефтепродуктов // Y Всесоюзная конференция по водной токсикологии. Тез. докл., Одесса, 18-22 апреля 1988 г., М.: Ротапринт ВНИРО, 1988. - С. 86.), хитоны - (Тюрин А.Н., Христофорова Н.К. Оценка пригодности хитона Lepidozona albrechti для биотестирования загрязнения морской среды тяжелыми металлами и синтетическими детергентами // Биология моря. 1993. 3. - С. 97-105. Тюрин А.Н., Христофорова Н.К. Оценка пригодности хитона Ischnochiton hakodadensis для биотестирования загрязнения морской среды тяжелыми металлами и детергентами // Биология моря. 1993. 5-6. - С. 100-106), молодь рыб - (Черкашин С.А. Реакция избегания гидробионтами (молодь рыб и ракообразные) некоторых токсикантов: автореф. дис. канд. биол. наук. - Севастополь, 1986. - 17 с., Мойсейченко Г.В., Щеглов В. В., Лукьянова О.Н. Биологические эффекты тяжелых металлов, содержащихся в буровых растворах //Вопросы рыболовства. 2000. Т. 1 2-3, ч.2. - С. 59-60).

Установлено, что наиболее уязвимыми к загрязнению и другим изменениям условий окружающей среды являются мелкие гидробионты. К ним также относятся икра и личинки рыб, входящие в состав ихтиопланктона. Большая удельная поверхность, связанная с малыми размерами тела, является одной из определяющих причин их пониженной устойчивости к изменениям окружающей среды. Другой причиной, очевидно, является специфика морфофизиологических процессов протекающих в быстро развивающемся организме и отсутствие при этом развитых систем защиты (Патин С.А. Влияние загрязнения на биологические ресурсы и продуктивность Мирового океана. - М.: Пищевая промышленность, 1979. - С. 111-157), поэтому поиск тест-объектов в Дальневосточных морях был направлен на отыскание предличинок рыб, которые могли бы служить в качестве тест-объекта для определения токсичности загрязнителей морских вод на Дальнем Востоке.

Известна работа по сравнительной острой чувствительности личинок Atherinops affinis и менидии Menidia beryllina к воздействию 11 химических соединений (Comparative acute sensitivity of larval topsmelt, Atherinops affinis, and inland silverside, Menidia beryllina, to 11 chemicals / Hemmer Michael J. , Middaugh Douglas P., Comparetta Valerie // Environ. Toxicol. and Chem. - 1992. - 11, 3. - Р. 401-408). При раздельной инкубации личинок корюшковидной аргентины A. affinis и менидии М. beryllina в течение 96 ч в присутствии 11 химических веществ показатели соотношения высоких и низких значений (LC₅₀) для эндосульфата, метоксихлора, карбофенотиона, хлорпирифоса, тербуфоса, фенвалерата, перметрина, 4-нитрофенола и лаурилсульфата оказались <2. Личинки A. affinis были более чувствительными к азинфосметилу и к 2,4-динитрофенолу, при этом их чувствительность к химическим веществам была сходна с таковой 2 наиболее чувствительных пресноводных видов рыб. Заключено, что A. affinis могут успешно использоваться в токсикологических исследованиях взамен М. berullina.

Наиболее близким техническим решением является способ оценки токсичности загрязнителей водных сред, описанный в А. С. СССР 1234770, МПК 4 G 01 N 33/18, C 02 F 3/34, включающий выдерживание тест-объекта - дафнии - в тестируемом растворе, регистрацию физиологического ответа, в том числе показателя гибели, показателя плодовитости, показателя мутогенности и др. и сравнение полученных результатов.

Задача, решаемая изобретением, - расширение числа тест-объектов для оценки токсичности загрязнителей морских вод дальневосточных морей.

Поставленная задача решается тем, что в качестве тест-объекта для оценки токсичности загрязнителей морских вод дальневосточных морей используются предличинки длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima).

Сущность изобретения заключается в следующем: в качестве тест-объекта используют предличинок длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima), которых получают путем инкубирования икры.

В целях снижения гибели из-за возможного травматизма объекта на различных этапах работы и улучшения воспроизводимости результатов эксперимента используют предличинок в возрасте 14-20 ч.

Предлагаемые предличинки длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima) были исследованы в качестве тест-объекта путем помещения и выдерживание их в морской водной среде в которую вносили в качестве токсиканта соли кадмия (CdSO₄) или цинка (ZnCb) в диапазоне концентраций ионов

Cd⁺ - от 0,001 до 0,1 мг/л,

Zn⁺ - от 0,005 до 0,1 мг/л,

а также ставили контрольную (без внесения токсикантов) и эталонную серии.

Исследуемый диапазон концентраций должен быть подобран так, чтобы наблюдаемый летальный токсический эффект был больше и меньше 50%, для этого перед основным экспериментом проводится предварительный опыт с шагом концентраций в один порядок. Количество концентраций в предварительном эксперименте, как и число самих предварительных экспериментов, варьирует в зависимости от необходимости. На основании предварительных экспериментов устанавливают диапазон пяти исследуемых концентраций для проведения основного эксперимента. Предварительный опыт включает в себя контрольную серию, то есть серию с соблюдением всех условий эксперимента, только без внесения испытуемого токсиканта.

Основной опыт ставится с шагом концентраций испытуемого загрязнителя, подобранном на основании результатов предварительного опыта. Основной опыт включает в себя контрольную серию, то есть серию с соблюдением всех условий эксперимента, только без внесения испытуемого токсиканта.

Параллельно проводимым опытам исследуются две концентрации эталонного токсиканта. И экспериментальная, и контрольная, и эталонная группы ставятся в трехкратной повторности.

За параметр токсичности принимают количество погибших особей, которые после смерти почти сразу приобретают молочно-белую окраску, а в целом о смерти судят по отсутствию реакции организма на контакт со стеклянной палочкой. Показания снимают каждые 12 ч, при этом погибших предличинок немедленно удаляют из стакана. Эксперимент длится в течение 96 ч (за это время желточный мешок у предличинок почти полностью рассасывается), в случае гибели предличинок в контрольной группе больше 50% опыт повторяют.

По окончании эксперимента о степени токсичности загрязнителя судят по токсикометрическим параметрам - ЛК₀, ЛK₁₆, ЛК₅₀, ЛК₈₄ и ЛК₁₀₀.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1.

Предлагаемые предличинки длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima) были исследованы в качестве тест-объекта путем помещения и выдерживание их в морской водной среде, в которую вносили в качестве токсиканта соли кадмия (CdSO₄) в диапазоне концентраций ионов металла - от 0,001 до 0,1 мг/л, а также ставили контрольную (без внесения токсикантов) и эталонную серии.

Предличинок камбалы длиннорылой (Limanda punctatissima) получают следующим образом.

Икру берут в мае-июне из природной среды в районах с экологически благоприятной обстановкой с помощью заякоренной поверхностной планктонной сети типа Джеди. Собранный планктонный материал немедленно доставляют в лабораторию, где в отдельные сосуды объемом 1000 мл, заполненные отстоянной и отфильтрованной морской водой, отсаживают икру длиннорылой камбалы по 50-100 шт. и ждут вылупления, которое наступает примерно через 4-9 ч при температуре 10-16^oС. Через 3-8 ч после завершения массового вылупления предличинок рассаживают по 5 шт. в высокие градуированные стеклянные стаканы (объемом >100 мл) с чистой отстоянной и отфильтрованной морской водой, объемом немногим меньше 100 мл. Отсаженных предличинок выдерживают в течение 11-12 ч, чтобы исключить из эксперимента травмированных при пересадке особей. Таким образом, с момента вылупления предличинок до момента внесения токсиканта проходит 14-20 ч, и из эксперимента исключаются травмированные на разных этапах подготовительных работ предличинки, то есть в эксперимент попадают только заведомо жизнеспособные предличинки в возрасте 14-20 ч.

Растворы токсиканта получают следующим образом.

В бидистиллированной воде растворяют соли кадмия (CdSO₄) или цинка (ZnCl₂) для получения маточных растворов с концентрациями ионов металлов 1 г/л. Для удобства приготовления исследуемых концентраций загрязнителей приготовливают промежуточные растворы путем разведения маточного раствора в 10 - 100 раз чистой отстоянной и отфильтрованной морской водой, с получением растворов с содержанием ионов того или иного металла 10 мг/л и 100 мг/л.

Диапазон исследуемых концентраций токсиканта устанавливается на основании результатов предварительных экспериментов, также при этом необходимо выбирать такие значения концентраций, чтобы они были немногим выше и ниже значений установленных ПДК.

Проведение эксперимента.

Предварительный опыт ставится следующим образом.

Готовят 18 градуированных стеклянных стаканов объемом больше 100 мл с чистой отстоянной и отфильтрованной водой, в каждый из которых помещают по 5 предличинок длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima) в возрасте 3-8 ч и выдерживают в этих стаканах еще 11-12 ч, чтобы исключить из эксперимента возможных травмированных при пересадке предличинок. Таким образом, в эксперимент попадают только жизнеспособные не травмированные особи в возрасте 14-20 ч. Затем добавляют необходимое для получения рассчитанной концентрации загрязнителя количество токсиканта, доводя тем самым количество раствора до необходимого объема в 100 мл.

3*1 ст. под концентрацию Cd⁺ - 0,001 мг/л;

3*1 ст. под концентрацию Cd⁺ - 0,01 мг/л;

3*1 ст. под концентрацию Cd⁺ - 0,1 мг/л;

3*1 ст. под концентрацию Cd⁺ - 1 мг/л;

3*1 ст. под концентрацию Cd⁺ - 10 мг/л;

3*1 ст. - контрольная серия.

Каждая концентрация готовится трижды, количество концентраций равно пяти. Также в трехкратной повторности ставится параллельная серия с контрольной группой, отличающейся от экспериментальной только отсутствием токсиканта.

Показания о количестве погибших предличинок снимают каждые 12 ч, погибших предличинок немедленно удаляют из стаканов. На основании полученных результатов подбирают более узкий и точный диапазон концентраций для проведения основного эксперимента.

Основной опыт ставится следующим образом.

Готовят 18 градуированных стеклянных стаканов объемом больше 100 мл с чистой отстоянной и отфильтрованной водой, в каждый из которых помещают по 5 предличинок длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima) в возрасте 3-8 ч и выдерживают в этих стаканах еще 11-12 ч, чтобы исключить из эксперимента возможных травмированных при пересадке предличинок. Таким образом, в эксперимент попадают особи в возрасте 14-20 ч. Затем добавляют необходимое для получения рассчитанной концентрации загрязнителя количество токсиканта, доводя тем самым количество раствора до необходимого объема в 100 мл. Каждая концентрация готовится трижды, количество концентраций равно пяти.

3*1 ст. под концентрацию Сd⁺ - 0,001 мг/л;

3*1 ст. под концентрацию Сd⁺ - 0,002 мг/л;

3*1 ст. под концентрацию Сd⁺ - 0,02 мг/л;

3*1 ст. под концентрацию Сd⁺ - 0,05 мг/л;

3*1 ст. под концентрацию Cd⁺ - 0,1 мг/л;

3*1 ст. - контрольная серия.

Также в трехкратной повторности ставится параллельная серия с контрольной группой, отличающейся от экспериментальной только отсутствием токсиканта.

Показания о количестве погибших предличинок снимают каждые 12 ч, погибших предличинок немедленно удаляют из стаканов. Полученные результаты анализируют, учитывая поправку Аббота (Методические рекомендации по установлению предельно допустимых концентраций загрязняющих веществ для воды рыбохозяйственных водоемов. - М.: ВНИРО, 1986, 88 с.). Материалы исследования токсичности кадмия и расчеты токсикометрических параметров приведены в таблице 1.

Опыт с эталонным токсикантом (Zn⁺) ставится как в предварительном, так и в основном опытах, с токсикантом, известные концентрации которого вызывают известный выраженный токсический эффект для определения степени пригодности данной выборки тест-объекта в эксперименте.

Опыт проводится следующим образом.

Готовят 9 градуированных стеклянных стаканов объемом больше 100 мл с чистой отстоянной и отфильтрованной водой, в каждый из которых помещают по 5 предличинок длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima) в возрасте 3-8 ч и выдерживают в этих стаканах еще 11-12 ч, чтобы исключить из эксперимента возможных травмированных при пересадке предличинок. Таким образом в эксперимент попадают особи в возрасте 14-20 ч. Затем добавляют необходимое для получения рассчитанной концентрации загрязнителя количество эталонного токсиканта, доводя тем самым количество раствора до необходимого объема в 100 мл. Каждая концентрация дублируется трижды, количество концентраций равно двум. Также в трехкратной повторности ставится параллельная серия с контрольной группой, отличающейся от эталонной только отсутствием эталонного токсиканта

3*1 ст. под концентрацию Zn⁺ - 0,05;

3*1 ст. под концентрацию Zn⁺ - 0,1;

3*1 ст. - контрольная серия.

Пример 2.

Предлагаемые предличинки длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima) были исследованы в качестве тест-объекта путем помещения и выдерживания их в морской воде, в которую вносили в качестве токсиканта соли цинка (ZnCl₂) в диапазоне концентраций ионов металла от 0,005 до 0,1 мг/л, а также ставили контрольную (без внесения токсикантов) и эталонную серии.

Все операции по получению предличинок камбалы длиннорылой (Limanda punctatissima) проводятся так же, как и в примере 1.

Растворы токсиканта получают следующим образом.

В бидистиллированной воде растворяют соли цинка (ZnCl₂) для получения маточных растворов с концентрациями ионов металлов 1 г/л. Для удобства приготовления исследуемых концентраций загрязнителей приготовливают промежуточные растворы путем разведения маточного раствора в 10-100 раз чистой отстоянной и отфильтрованной морской водой, с получением растворов с содержанием ионов того или иного металла 10 мг/л и 100 мг/л.

Диапазон исследуемых концентраций токсиканта устанавливается на основании результатов предварительных экспериментов, также при этом необходимо выбирать такие значения концентраций, чтобы они были немногим выше и ниже значений установленных ПДК.

Проведение эксперимента: все операции в предварительном и в основном опытах проводятся так же, как и в примере 1. Полученные значения токсикометрических параметров цинка сведены в таблице 2.

Таким образом, предложенный тест-объект может быть с успехом использован для оценки степени токсичности загрязнителей морских вод при проектировании и прогнозировании хозяйственной деятельности человека. Предличинки длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima) могут быть в большей степени рекомендованы для проведения токсикологических исследований, нежели другие известные морские тест-объекты на ранних стадиях индивидуального развития. Полученные в результате наших экспериментов значения ЛК₀ и ЛК₅₀ составили для Cd: ЛК₂ - 0,001, ЛК₅₀ - 0,007 мг/л; для Zn: ЛК₀ - 0,008, ЛК₅₀ - 0,029 мг/л, тогда как при изучении влияния Cd на развитие плутеусов морских ежей 96 ч ЛК₅₀ составила 0,139 мг/л (Моисейченко Г.В., Щеглов В.В., Лукьянова О.Н., Биологические эффекты тяжелых металлов, содержащихся в буровых растворах // Вопросы рыболовства. 2000. Т. 1 2-3, ч.2. - С. 59-60). При изучении влияния Cd, Zn и прочих токсикантов на икру и личинок различных видов рыб не Дальневосточного региона значения ЛК₅₀ составили для Zn - от 25 до 80 мкг/л (Патин С. А. Влияние загрязнения на биологические ресурсы и продуктивность Мирового океана. - М.: Пищевая промышленность. - 1979. - 304 с.).

Сравнение результатов наших исследований с утвержденными российскими ПДК Cd и Zn для морских вод показали, что утвержденные значения ПДК для Cd на порядок, а для Zn в шесть раз превышают предлагаемые нами безопасные значения концентраций для этих металлов (Перечень рыбохозяйственных нормативов: предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно безопасных уровней воздействия (ОБУВ) вредных веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение. Сост. Шиленко Н.А., Соколова С.А., Анисова С.Н., Лесников Л.А., Лебедев А.Т., Семенова И.В. - М.: ВНИРО, 1999. - 304 с.).

На основании этого предличинки длиннорылой камбалы (Limanda punctatissima) предложены нами в качестве нового тест-объекта для включения в "Методические рекомендации по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов загрязняющих веществ для морских вод". Кроме того, планируется вынести на НТС Главрыбвода Госкомрыболовства России предложение уточнить ПДК некоторых металлов для вод дальневосточных морей.