способ прогнозирования развития ретинопатии недоношенных

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития ретинопатии недоношенных, включающий иммунологическое исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что определяют наличие антител класса IgG и IgM к S-антигену сетчатки методом иммуноферментного анализа и при показателях относительной плотности > 0,1 каждого из них в сроки 29-40 недель гестации прогнозируют развитие ретинопатии недоношенных.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для прогнозирования риска развития ретинопатии недоношенных. Ретинопатия недоношенных (РН) - тяжелое заболевание недоношенных детей, нередко ведущее к инвалидности по зрению с раннего возраста. Частота РН варьирует в различных странах, достигая 24,7 на 100000 живых рождений. В Москве ежегодно выживает около 5000 недоношенных, а в Российской Федерации - более 100 тысяч. Частота РН среди выживших недоношенных детей составляет 27%, а среди глубоко недоношенных с массой тела при рождении менее 1000 г достигает 84% (Хватова А.В. с соавт. , 2000; Катаргина Л.А., Скрипец П.П., 2000). Причем, данные различных авторов о частоте РН при одной и той же массе тела широко варьируют.

Согласно международной классификации активная РН подразделяется по стадиям процесса, его локализации и протяженности.

1 стадия - появление демаркационной линии на границе сосудистой и бессосудистой сетчатки.

2 стадия - появление вала (или гребня) на месте демаркационной линии.

3 стадия - характеризуется появлением экстраретинальной фиброваскулярной пролиферации в области вала.

4 стадия - частичная отслойка сетчатки - подразделяется на 4а (без вовлечения в процесс макулярной зоны) и 4в (с отслойкой сетчатки в макуле).

5 стадия - полная, или тотальная, отслойка сетчатки.

Несмотря на многолетние клинические и экспериментальные исследования патогенез РН до конца не изучен. Наиболее сложной задачей является прогнозирование развития и характера течения заболевания.

Клинические способы прогнозирования развития РН включают выделение детей группы риска в зависимости от массы тела при рождении, гестационного возраста на момент рождения, длительности кислородотерапии и искусственной вентиляции легких, сопутствующей соматической патологией и т.д. (Хватова А.В. с соав., 1999). Они обладают низкой прогностической ценностью, т.к. очень опосредованно связаны с патогенезом заболевания.

Предлагаемый способ исследования сыворотки крови на содержание в ней антител - IgG и IgM к S-антигену сетчатки, позволяет определять риск развития РН у недоношенных детей.

За ближайший аналог принят способ прогнозирования риска развития РН по наличию периодов значительных колебаний уровней газов (рСО2 от 30 до 100 мм рт.ст. и рО2 от 33 и ниже до 75 мм рт.ст.) в крови в период выхаживания недоношенного ребенка (Коголева Л.В., 2001).

Техническим обоснованием предлагаемого изобретения является более раннее и достоверное прогнозирование риска развития РН у недоношенных детей.

Технический результат достигается за счет выявления повышенных уровней IgG и М к S-антигену сетчатки в сыворотке крови у недоношенных детей в период незавершенности формирования сетчатки (наличие аваскулярных зон без признаков ретинопатии) в возрасте 29-40 недель гестации вследствие активизации или развития органоспецифического иммунитета ребенка к структурам сетчатки (S-антигену).

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь из вены ребенка в количестве 3 мл выдерживают в термостате при 37^oС в течение 30-45 мин, затем охлаждают в холодильнике 15-20 мин до 0^oС и помещают в центрифугу на 15 мин при скорости 1000 оборотов в мину. После этого полученную сыворотку крови без форменных элементов замораживают при -18^oС. Уровень плотности IgG и М к S-антигену сетчатки определяют с использованием иммуноферментного анализа (ИФА), применяя твердофазный метод с использованием пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента.

Исследуемые и контрольные образцы сыворотки вносят в лунку полистиролового планшета для ИФА, на котором предварительно иммобилизируют S-антиген сетчатки, выделенный из бычьих глаз (м.м. 48 кДа), затем в лунки вносят мышиные моноклональные антитела против IgG или IgM человека, конъюгированные с ферментной меткой - пероксидазой хрена (фирма "Sigma"). После добавления фермент-специфичного субстратного раствора (ОФД) и "стоп-реагента" (1N H₂SО₄) реакцию регистрируют на спектрофотометре вертикального сканирования ("Мультискан", Финляндия) при длине волны 492 нм. В качестве референт-сыворотки (положительный контроль) в ИФА используют лиофилизированную сыворотку, представляющую собой смешанный пул сывороток, полученных от пациентов с различными формами заболеваний сетчатки (диабетическая ретинопатия, увеоретиниты, идеопатическая отслойка сетчатки и др.).

В качестве отрицательного контроля используют фосфатно-буферный раствор (ФБР, рН 7,2), содержащий бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мг/мл (по белку). При этом мы считали необходимым и достаточным применять ФБР, который используется для разведения испытуемых проб сывороток с добавлением минимального количества неспецифического белкового препарата, учитывая, что у нормальных новорожденных детей общее содержание иммуноглобулиновых белков является низким.

Следует подчеркнуть существенное отличие "отрицательного контроля", используемого при исследовании детей с РН от отрицательных референт-сывороток, обычно используемых при исследовании в ИФА сывороток крови взрослых пациентов и детей старшего возраста, когда стандартными образцами служат сыворотки, полученные из пула крови от практически здоровых (офтальмологически и соматически) людей разных возрастных групп.

Оценку реакции проводят по разности показателей оптических плотностей (АОП), полученных при спектрофотометрическом измерении испытуемой и стандартной, нормальной тест-сыворотки, полученной из пула сывороток крови здоровых людей. Для этого вычисляли среднее значение ОП для каждой анализируемой и контрольной (стандартной-нормальной) пробы. Затем от среднего значения ОП исследуемой сыворотки вычитали среднее значение ОП нормальной контрольной сыворотки. Если полученная разница (ОП) была больше или равна 0,20, результат исследования считали положительным.

С целью контроля реакции находили разность между средним значением ОП положительной контрольной сыворотки (полученной из пула сывороток крови больных с выраженной патологией сетчатки и с использующейся в качестве референт-сыворотки) и нормальной контрольной сыворотки. Эта разность должна быть не менее 0,20.

Пример 1. У больной Ш., родившейся 14.11.98 г. на сроке 28 недель гестации с массой тела 1250 г в 4 недели жизни (32 недели гестации), при осмотре глазного дна были выявлены аваскулярные зоны сетчатки без признаков активной РН. Для определения риска развития РН у данного ребенка было произведено исследование крови на наличие антител к S-антигену сетчатки описанным выше способом. В результате выявлены высокие относительные плотности IgG (0,57) и IgM (0,32), что свидетельствовало о риске развития РН. В ходе динамического наблюдения у ребенка было выявлено развитие активной РН 1 стадии на 35 неделе гестации (7 неделе жизни). Осмотры проводились 1 раз в неделю. РН 2 стадия была диагносцирована на 36 неделе гестации (8 неделе жизни) и прогрессировала до 3 пороговой стадии (в 38 недель гестации, 10 недель жизни). Ребенку была выполнена профилактическая криокоагуляция аваскулярных зон сетчатки, после которой в течение 2 недель РН перешла в рубцовую стадию.

Пример 2. У больного Б. , родившегося 05.11.98 г. на сроке 28 недель гестации с массой тела 1340 г в 4 недели жизни (32 недели гестации), при осмотре глазного дна были выявлены аваскулярные зоны сетчатки без признаков активной РН. Для определения риска развития РН у данного ребенка было так же произведено исследование крови на наличие антител к S-антигену сетчатки тем же способом. В результате выявлены низкие относительные плотности IgG (0,07) и IgM (0,02), что свидетельствовало об отсутствии риска развития РН. В ходе динамического наблюдения у ребенка действительно не было выявлено признаков РН, а рост сосудов сетчатки закончился формированием нормальной сосудистой сети, что свидетельствует о том, что при низких относительных плотностях IgG и IgM риск развития РН минимален.

Из приведенных примеров видно, что предложенный способ позволяет прогнозировать развитие ретинопатии недоношенных у детей группы риска с точностью, превышающей предшествующие способы прогнозирования данного состояния.