способ получения эмбрионов животных и способ выращивания животного из эмбрионов

Формула изобретения

1. Способ получения эмбрионов животных, включающий следующие этапы: (а) извлечение фетальных фибробластов, (б) объединение ядра фетальных фибробластов с соответствующей клеткой-реципиентом, при этом фетальные фибробласты до объединения не подвергаются внешним манипуляциям для приведения в фазу G0, (в) размножение полученных таким образом клеток в течение периода времени до образования бластоцист и в соответствующем случае (г) пересадка выращенной клеточной массы животным-реципиентам.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соответствующей клеткой-реципиентом является энуклеированная яйцеклетка.

3. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что фетальные фибробласты сливаются с соответствующей клеткой-реципиентом.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что используемые на этапе (а) фетальные фибробласты происходят из полученных на этапе (г) клеток.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что фетальные фибробласты происходят от животных, выбранных из группы, состоящей из копытных, кроликов, грызунов или птиц.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что животные являются копытными.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что животное является крупным рогатым скотом.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, фетальный фибробласт извлекают из трансгенных плодов или животных.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что в генную конструкцию трансгенного плода или животного введен ген, представляющий интерес с точки зрения фармацевтики или физиологии питания.

10. Способ по любому из п. 8 или 9, отличающийся тем, что генный продукт введенного гена синтезируется в молоко.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что введенным геном является химозин или трипсин.

12. Способ по любому из пп. 8-11, отличающийся тем, что введенный ген находится под контролем эндогенного промотора.

13. Способ по любому из пп. 8-11, отличающийся тем, что введенный ген или эндогенный ген находится под контролем экзогенного чужеродного промотора или эндогенного для вида животных промотора.

14. Способ получения животного из искусственного эмбриона, включающий операции получения искусственного эмбриона и выращивания его до заданной степени развития плода, в организме животного-реципиента, отличающийся тем, что искусственный эмбрион получают способом, заявленным в пп. 1-13.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение касается способа разведения животных посредством клонирования, а также животных, полученных разработанным способом. Особенностью разработки является создание способа клонирования животных посредством эффективной пересадки ядер определенных эмбриональных (фетальных) клеток.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Животные, в особенности домашние животные, уже длительное время разводятся человеком с различными целями, что приводит к развитию у них определенных свойств. Так, например, для того, чтобы получить животных с высоким удоем, спаривают коров и быков, имеющих высокие показатели молочной продуктивности.

В последние годы большой научный интерес представляют животные, особенно такие представители копытных как овцы, крупный рогатый скот или коровы, в качестве продукционных станций важных с точки зрения физиологии питания и фармацевтики веществ, так как с развитием генной инженерии стало возможным целенаправленно придавать животным новые свойства, например способность производить определенные лекарственные вещества. Проблема хозяйственного использования таких животных заключается в том, что пересаженная им генная конструкция интегрируется и стабильно передается потомству.

К настоящему времени были сделаны попытки решить проблему переноса генов таким образом, что все манипуляции будут выполняться в клетках, при этом из этих клеток посредством клонирования снова будут получены животные.

В научном мире термин "клонирование" определяют как копирование генетического материала, происходящего от одной единственной клетки, что в переносе на эмбриологию следует понимать как получение эмбрионов или животных с идентичным генотипом. В эмбриологии под эмбрионом понимают зародыш в процессе бластогенеза до начала развития зачатков примитивных органов, в то время как для обозначения последующих стадий развития используют термин плод. Эмбриональная фаза в зависимости от вида животных имеет различную продолжительность. Например, у крупного рогатого скота этот период длится около 4 недель, а у других видов отряда копытных может быть короче или длиннее.

Для клонирования животных, то есть для размножения одного свойственного для определенного животного генотипа в настоящее время описано много способов.

С одной стороны, ранние эмбриональные стадии и последующие стадии развития плода подвергались хирургическому вмешательству и полученные таким образом отдельные части в дальнейшем размножаются in vitro или in vivo.

Затем производились микроманипуляционные комбинирования асинхронных стадий развития, определяемые как "химерные клоны", при этом бластомер(ы) из эмбриона, находящегося на более поздних стадиях развития, объединялись с бластомерами эмбриона более ранних стадий с целью поддержать первые в их способности к дальнейшему развитию и таким образом получить множество идентичных близнецов. Наибольшее число полученных таким образом клонов достигало, однако, не более 5-8.

Следующим разработанным способом являлось партеногенетическое активирование или спаривание гомозиготных родителей для того, чтобы получить клоны с определенными свойствами.

Так как вышеназванные способы по своей эффективности и надежности не являются оптимальными, был разработан еще один способ, который в общем можно определить как пересадка ядер.

При этом ядра клеток, берущие свое происхождение из многоклеточных эмбрионов, переносятся в подготовленные соответствующим образом яйцеклетки, что приводит к получению генетически идентичных эмбрионов.

Для того чтобы успешно осуществлять клонирование посредством пересадки ядер, необходимо, однако, учитывать некоторые обязательные параметры.

Яйцеклетка, которая используется как клетка-реципиент, должна в своем развитии пройти стадию метафазы 2-го деления (метафаза II) и не должна больше содержать своей собственной ДНК, то есть она должна представлять собой так называемую энуклеированную яйцеклетку. При этом цитоплазма яйцеклетки должна подвергаться лишь минимальному воздействию, так как содержащиеся в ней вещества могут иметь большое значение для дальнейшего развития, например для деления клетки.

Затем необходимо перепрограммировать ядерную ДНК пересаживаемого ядра. Так как ядро-донор происходит из многоклеточного эмбриона, каждая донорская клетка уже прошла несколько циклов деления. Это означает, что клетка находится в более поздней стадии развития по отношению к тотипотентной оплодотворенной яйцеклетке, и в ней уже могут быть выключены определенные важные для раннего развития гены.

Исходя из этого, используемая ядерная ДНК должна быть перепрограммирована с тем, чтобы генетическая информация ядерной ДНК могла быть снова полностью использована и схема деления эмбриона вновь началась со стадии зиготы. Чем лучше выполнено такое репрограммирование или активирование, тем выше вероятность выполнения успешного клонирования, то есть получения полностью развитого живого клонированного животного.

Кроме ядерной ДНК большое значение имеет присутствующая в цитоплазме мРНК, так как в момент объединения яйцеклетки и донорской клетки она служит матрицей для образования необходимых для последующих стадий развития и дифференцирования белков, которые могут оказывать влияние на дальнейшее развитие клетки.

Используемые способы пересадки ядер характеризуются различной степенью успеха. Так, Willadsen et al. (Nature 320 (1986), 63-65) сообщили о клонировании ягнят, при этом ядра клеток-доноров происходили из 8-ми клеточных эмбрионов. Robi et al. (J. Anim. Sci. 64 (1987), 642-647) сообщили о первых экспериментах по пересадке ядер крупного рогатого скота, при этом работа велась только с использованием эмбрионов крупного рогатого скота, полученных ex vivo. В обоих попытках было использовано промежуточное культивирование in vivo в яйцеводах овец. В последующие годы было показано, что эмбриональные клоны у крупного рогатого скота могут быть получены и in vitro, как при использовании эмбрионов, так и полученных in vitro яйцеклеток (Sims et al, PNAS USA 91 (1991), 6143-6147).

В WO 97/07668 описан еще один способ возобновления эмбриона животного, при котором ядро с диплоидным набором хромосом переносится в энуклеированную яйцеклетку, находящуюся в стадии метафазы II, при этом яйцеклетка активируется по прошествии определенного периода времени после переноса ядра. Посредством выполняемого после переноса ядерной ДНК активирования яйцеклетки, должно достигаться лучшее репрограммирование перенесенной ядерной ДНК.

WO 97/0669 также касается способа возобновления эмбриона животного, при котором ядро донорской клетки, находящейся в покое, переносится в соответствующую клетку-реципиент. Предполагается, что донорская клетка до объединения с клеткой-реципиентом находится в фазе G0, что достигается посредством "голодания" клеток или контактного ингибирования.

Проблемой для использования данной технологии является наличие подходящих донорских клеток, способных наиболее целенаправленно и обоснованно привести к развитию эмбриона животного. Известно, что репрограммирование ядерной ДНК уже выбранной донорской клетки при клонировании эмбрионов сопряжено с большими трудностями, так как оно играет важную роль не только в дальнейшем раннем созревании эмбриона, но и в более позднем развитии после пересадки в организм матери. Таким образом, несмотря на успехи в этой области, существует проблема эффективного репрограммирования ядерной ДНК донора с целью приведения манипулированных яйцеклеток в состояние естественной зиготы. Кроме низкого выхода эмбриональных бластоцист, это выражается в низкой степени деления.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы исключить недостатки существующей технологии и предоставить соответствующую донорскую клетку для создания улучшенного способа клонирования животных.

Поставленная задача решается посредством создания способа клонирования эмбриона животного, при котором в качестве донорской клетки используются фетальные фибробласты. Ядро такой клетки объединяется с соответствующей клеткой-реципиентом и полученная таким образом клетка выращивается определенный период времени до образования морулы. Полученная морула может быть вновь использована для клонирования и пересадки в организм матери.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения клеткой-реципиентом является энуклеированная яйцеклетка, в которую пересаживается ядро фетального фибробласта или весь фибробласт целиком путем слияния. При этом может быть использован фетальный фибробласт непосредственно из плода или после длительного размножения.

Животными, на которых может быть использован разработанный способ, могут быть, например, копытные, кролики, грызуны или птицы. При этом предпочтительно использование копытных, в особенности свиней, овец, коз, крупного рогатого скота.

В предпочтительном варианте осуществления способа используемые фетальные фибробласты являются трансгенными, то есть они содержат один или несколько генов, которые или получены из экзогенного источника, или представляют собой эндогенный, но другой неприродный локус используемого трансгена в геноме. Эти гены предпочтительно кодируют лекарственные вещества, например антитела или вещества, интересные с точки зрения физиологии питания, например химозин или трипсин, при этом гены могут находиться под контролем как эндогенного, так и экзогенного промоторов.

Для извлечения фетальных фибробластов у беременных животных извлекают плоды и измельчают. Полученные из плода клетки затем селекционируют с целью отбора желательных фетальных фибробластов, например, посредством прикрепления на поверхность культурального флакона и отделения надосадочной жидкости или посредством механического отбора с помощью пипетки. Фетальные фибробласты могут быть легко отличены от остальных клеток по своему фенотипу.

Для последующих шагов извлеченный фетальный фибробласт может быть использован целиком, или у него может быть изолировано ядро с целью дальнейшего использования.

В качестве клеток-реципиентов используются, как правило, энуклеированные яйцеклетки, созревшие in vivo или in vitro. Так, например, могут быть использованы созревшие in vitro неоплодотворенные яйцеклетки, у которых по достижении метафазы II удаляются окружающие их кумулюсные клетки.

Предпочтительно использование клеток-реципиентов, у которых отсутствует собственная ядерная ДНК. В настоящее время существует много способов удаления ДНК яйцеклетки, такие как, например, разделение яйцеклетки на две половины, из которых одна не содержит ядро и может быть использована для дальнейших манипуляций, или облучение ультрафиолетовым светом с целью разрушения собственной клеточной ДНК. Возможно также удаление ядра (пронуклеуса) или метафазной пластинки с помощью микроманипулятора Наилучшим образом зарекомендовала себя обработка яйцеклетки до микроманипуляций цитогалазином В с последующим отсасыванием с помощью пипетки расположенной вблизи полярного тельца цитоплазмы, например, посредством микроманипулятора Leitz (Leica, Bensheim, Германия). Так как ядерная ДНК яйцеклетки в этот момент локализуется вблизи полярного тельца, степень энуклеации, достигаемая данным методом, является очень высокой, при этом происходит отсасывание лишь небольшой части цитоплазмы.

После получения двух составных частей, необходимых для ядерной пересадки, дальше можно выбрать два различных пути. Ядро фетального фибробласта изолируется одним из способов, известных на момент подачи заявки, и переносится в подготовленную клетку-реципиент, например, посредством инъекции. С другой стороны, для слияния с клеткой-реципиентом может быть использован целый фибробласт.

Для слияния фетальный фибробласт с помощью соответствующих инструментов, например пипетки для переноса, переносится под зону пелюцида энуклеированной яйцеклетки. Для объединения клеточного ядра фетального фибробласта с цитоплазмой яйцеклетки выполняют слияние мембраны фибробласта с мембраной яйцеклетки. В настоящее время широко известно несколько способов слияния клеток, например слияние посредством использования вируса Сендаи, обработка полиэтиленгликолем (ПЭГ), лазерное слияние или электрический шок. Последний метод, так называемое электрослияние, представляет собой многократное, например, 2-10 кратное, кратковременное воздействие постоянного импульса от 1 до 10 кВ/см, преимущественно от 1 до 3 кВ/см, с продолжительностью от 2 микросекунд до 1 секунды, в результате чего индуцируются поры, обеспечивающие слияние цитоплазмы. Этот метод является предпочтительным в данной разработке, так как посредством электрического импульса соответствующей силы может одновременно осуществляться активирование слитой яйцеклетки. Активирование может также проводиться в течение нескольких часов (2-5 часов) после слияния, например, посредством инкубации слитой клетки в 7% растворе спирта, предпочтительно в 7% растворе этанола, а так же осуществляться любым другим из имеющихся сегодня в распоряжении способов.

Активирование слитой клетки является важным шагом, так как оно служит предпосылкой для придания продукту слияния делящейся активности. После успешного слияния и активирования производят выращивание комплексов фибробласта и яйцеклетки (эмбрионы, полученные пересадкой ядер) до стадий, на которых они могут быть пересажены реципиентам. При этом в используемые культуральные среды могут быть внесены дополнительные вещества, которые поддерживают или, наоборот, ингибируют агрегацию. Нокадазол и колцемид являются примерами веществ, ингибирующих агрегацию, таксол - стабилизирующих агрегацию. Использование этих веществ предотвращает возможное образование множественных пронуклеусов.

По существующей стандартной технологии образующиеся эмбрионы необходимо осторожно пересадить промежуточному реципиенту. Это достигается чаще всего помещением эмбриона в защитную среду, например агар, и упаковкой в яйцевод временного реципиента. При этом дальнейшее развитие до рождения возможно только в организме настоящего реципиента. Существуют также способы культивирования в системах in vitro без ухудшения выхода эмбрионов. Не склоняясь к какой-либо теории, следует подчеркнуть, что при удачном выборе клетки-донора могут быть получены эмбрионы, которые по своему развитию приближаются к эмбрионам, полученным естественным путем. Клетки содержатся в культуре до тех пор, пока они не образуют бластоцисты. Это происходит в период до 10 дней, преимущественно от 6 до 7 дней.

Как было установлено, вполне возможно выращивать клонированные эмбрионы до плодов, которые затем снова могут быть использованы для пересадки ядер. В рамках так называемого реклонирования число клонированных эмбрионов может быть еще больше увеличено.

Фетальные фибробласты для разработанного способа могут быть получены у большого числа животных: из млекопитающих, например, у копытных, кроликов, грызунов (крыс и мышей), а так же птиц (уток, гусей или кур). При этом, исходя из хозяйственной ценности, предпочтительно использование копытных, например, крупного рогатого скота, овец, коз, буйволов, верблюдов и свиней. Наиболее предпочтительно получение овец и коров.

Для облегчения выделения генного продукта можно направить его получение в собственный продукт животного. У коров и овец это может быть молоко, у птиц - яйца. Специфическая для отдельных органов экспрессия может быть достигнута посредством выбора соответствующих промоторов, которые к моменту создания данной технологии уже известны. Генный продукт может быть также извлечен непосредственно из животного, например, из сыворотки. Кроме того, возможно, что желаемый продукт представлен органами или тканями животного, например, для ксенотрансплантации.

Используемые в разработанном способе фетальные фибробласты, а также плоды или животные, от которых они были получены, могут быть трансгенными, при этом предпочтительным является трансген, кодирующий важный с точки зрения физиологии питания или фармацевтики белок, например антитело. У коров и овец, например, в генную конструкцию могут быть встроены гены химозина или трипсина, позволяющие синтезировать в молоко соответствующие ферменты или их предшественники. Выбранный трансген может находиться под контролем экзогенного, так же трансгенного промотора, или для этой цели может быть использован известный эндогенный лромотор. С помощью разработанного способа возможно улучшение извлечения гомологичных животных белков, изменение животных продуктов, таких как молоко, или извлечение органов животных, например, для медицинского использования.

Целый ряд белков до настоящего времени получают из органов животных посредством их очистки из этих органов и последующего использования в медицине или технике. Проблемой являются относительно низкие количества, в которых они присутствуют в тканях (например, ФСГ (фолликулостимулирующий гормон) в гипофизе), что приводит к высоким производственным затратам, так как для их выделения необходимо наличие большого количества исходного материала, то есть животных, что повышает риск контаминации, например, такими болезнетворными агентами как BSE или Еheс.

Примерами интересных белков из органов животных являются апротинин из легких, химозин из желудка, каталаза из печени, эластаза, панкреатин, инсулин или трипсин из поджелудочной железы, гиалорунидаза из семенников, хондроитин из трахеи, коллаген из кожи, фибронектин или витронектин из плазмы, ростовой фактор эпителиальных клеток или ЛГ (лютеинизирующий гормон) из гипофиза, фактор роста фибробластов или ганглиозид из мозга, а также гемоглобин, тромбин, трансферрин и другие. Это перечисление не следует, однако, рассматривать как какое-либо ограничение.

Для всех этих продуктов может быть достигнута эктопная экспрессия, то есть экспрессия в другой ткани, например в молочной железе, если в клетках, используемых для клонирования, предварительно выполняется дополнительный перенос генов, например, путем инъекции, трансформации, трансфекции или любым другим известным способом, и при этом рекомбинантная in vitro генная конструкция дополнительно интегрируется в геном. Исходя из этого, посредством гомологичной рекомбинации в клетках может быть достигнуто сцепление эндогенного гена с промотором, который обеспечит этому структурному гену другой рисунок экспрессии, например производство химозина посредством секреции в молоко вместо эндогенного синтеза в желудке. Кроме того, имеющийся в распоряжении эндогенный промотор, например промотор казеина или лактоглобулина, может быть сцеплен с новым структурным геном с целью обеспечения оптимальных условий для его экспрессии. В обоих представленных выше случаях промотор и структурный ген, которые гомологично рекомбинируются в геном, предварительно изолируются из генного банка, который получен, например, из фетальных фибробластов. Таким образом, используется не только ДНК собственного вида, но еще и изогенная ДНК.

Таким путем состав продуктов питания, полученных из продуктов животного происхождения, например молока, может быть изменен желательным образом так, что они приобретут положительные диетические и способствующие оздоровлению свойства, пониженный аллергический потенциал, повышенную стабильность при хранении или свойства, облегчающие их переработку. Так, может быть получено молоко с определенными свойствами, например молоко с антителами к Ehec или специальное молоко для больных с неусвояемостью лактозы.

Использование искусственных хромосом млекопитающих (MACs) позволит исключить интеграционные мутации, а также сделает возможным перенос больших фрагментов ДНК. Такие MACs представляют собой дополнительные мини- или микрохромосомы, реплицирующиеся в ядре точно так же, как и эндогенные хромосомы. Посредством использования MACs возможно, например, пересаживать генные кластеры одного вида животных другому, например, полный иммуноглобулиновый кластер человека - домашним животным, при этом домашние животные становятся продуцентами антител человека с целью их извлечения и последующего использования. Посредством переноса определенных MACs собственного вида может быть достигнуто повышение уровня синтеза генного продукта за счет аддитивного действия генов.

Важной является экспрессия гомологичных белков, а также тканей и органов у домашних животных, для белков - в тех же органах, в которых эти белки синтезируются у человека. Полученные таким образом белки могут быть очищены одним из известных к моменту подачи данной заявки способом, а ткани и органы - извлечены из животных непосредственно перед трансплантацией. Преимуществом описанного выше подхода является высокая идентичность синтезируемых белков, так как их процессинг, то есть посттрансляционные модификации протекают в тех же органах, в которых они экспрессируются в природе. Примером может служить синтез эритропоэтина в почках. Это приводит к тому, что извлеченные из различных тканей белки являются гликозилированными таким же образом, как и у человека, при этом по своей активности они близки к природным белкам. Так, могут быть получены трансгенные животные, например свиньи, крупный рогатый скот и другие, которые продуцируют инсулин, эритропоэтин и другие белки человека, которые затем могут быть с успехом использованы в медицине.

С помощью разработанного способа полученное один раз трансгенное животное с предпочтительными свойствами может быть стабильно размножено.

Настоящее изобретение касается также взаимосвязанных с данной разработкой клонированных животных, которые, как отмечалось выше, могут быть трансгенными или нетрансгенными.

Преимуществом созданного изобретения помимо отсутствия необходимости приведения клеток в фазу G0, является одинаковая или даже повышенная эффективность, рассчитанная по конечному выходу при реклонировании.

Так, при использовании разработанного способа были достигнуты результаты, по своей эффективности превышающие результаты, полученные для пунктированных ооцитов с последующим созреванием и оплодотворением, но без клонирования. Выявленная высокая степень развития значительно повышает эффективность программ по клонированию.

Мерой эффективности предлагаемого способа может служить так называемая степень беременности, определяемая как число беременных реципиентов от общего числа синхронизированных реципиентов, которым были пересажены 6-7 дневные культивируемые in vitro эмбрионы. Степень беременности может быть установлена посредством измерения уровня прогестерона, ультразвуковой диагностикой или ректальной пальпацией.

При этом на примере крупного рогатого скота с помощью различных способов были получены следующие результаты:

Степень беременности:

Пункция ооцитов с последующим IVM и IVF - 34%

Клонирование эмбрионов (в среднем) - 25%

Клонирование эмбрионов с помощью фетальных фибробластов - 55%

IVM = созревание in vitro.

IVF = оплодотворение in vitro.

Разработка будет проиллюстрирована примером, который, однако, не должен ограничивать область ее применения.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Выделение фетальных фибробластов из плодов крупного рогатого скота.

Плоды извлекают из матки забитых нетелей или коров и транспортируют в лабораторию на ледяной воде в PBS (фосфатно-солевой раствор, без Са²⁺ и Мg²⁺ с пенициллином и стрептомицином и 10% бычьей фетальной сыворотки (FCS)). Затем плоды промывают несколько раз свежим PBS. После промывки плоды освобождают от головы и внутренних органов, вновь промывают в PBS, затем измельчают в 5 мл PBS и помещают в 50 мл культуральные пробирки. После добавления 10 мл PBS пробирки осторожно центрифугируют при 300 об/мин в течение 5 мин, после чего ресуспендируют осадок в 0,1% растворе трипсина. После 5-ти минутной инкубации при 37^oС выполняют перенос в 50 мл центрифужную пробирку и вновь центрифугируют (300 об/мин, 5 мин). Эти шаги, начиная с обработки трипсином, повторяют дважды. Полученную таким образом клеточную суспензию фильтруют, переносят в 50 мл пробирку, центрифугируют (160 g, 5 мин) и ресуспендируют осадок в 1 мл культуральной среды (DMEM (Gibco) с добавлением 15% FCS, 2 мМ L-глютамина, 10^-7 мМол -меркаптоэтанола и пенициллина со стрептомицином).

После трипсинизации клеточную суспензию помещают в 10 см культуральные чашки и культивируют в культуральной среде (супра) с 10% FCS (Biochrom, Берлин) при 37^oС в 5% СО₂ до достижения субконфлюэнтного монослоя (2-3 дня). Одну часть пассажа "0" замораживают (10% диметилсульфоксид, Sigma) и хранят в жидком азоте.

Для сравнения эффективности способа одна часть фибробластов до пересадки ядер была синхронизирована в презумптивную фазу G0 посредством сильного уменьшения концентрации сыворотки в культуре, как это описано в WO 97/07669 (Campbell et al.). Для этого клетки на следующий день после пассажирования промывали трижды PBS и выращивали в свежей среде с 0,5% FCS в течение 8 дней ("голодные" клетки), после чего их использовали для клонирования. В способе, описанном Campbell, обязательным является приведение фибробластов посредством "голодания" или другими способами в фазу G0.

Фибробласты для описанного здесь способа, которые не подвергались процессу голодания, были непосредственно извлечены из субконфлюэнтной культуры и использованы для клонирования без какой-либо дополнительной обработки.

Затем бластомеры (эмбриональные клетки) из морул (эмбрионы в возрасте около 6 дней с числом клеток от 30 до 70 бластомеров), полученных посредством клонирования с использованием "голодных" и "неголодных" фибробластов, были вновь использованы для клонирования (реклонирование). Результаты представлены в таблице и показывают, что с использованием разработанного способа могут быть получены даже лучшие результаты по сравнению со стандартной технологией.

Кроме того, при оценке степени беременности было установлено, что этот показатель составил около 60%.

Дополнительный перенос генов

Рекомбинированные in vitro генные конструкции, как это описано в DE-OS-4012526, которые были здесь использованы, переносят в ядра изолированных фетальных фибробластов посредством традиционной микроинъекции ДНК (Вгет G. Transgenic Animals, Genetic Engineering of Animals, VCH Weinheim (1993), 83-170) или другими известными способами (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Доказательство интеграции в клетках осуществляют посредством ПЦР или Southern-блотинга (Maniatis, см. выше). Экспрессия в дифференцированных клетках показывает, что перенос генов выполняется успешно.

Клонирование

Через 18-20 часов после начала созревания изолированные из яичников яйцеклетки коров освобождают от кумулюсных клеток и энуклеируют в течение двух часов (Molecular Reproduction and Development 42 (1995), 53-57). Через 20-22 часа после начала созревания извлеченные, как описано выше, фетальные фибробласты были пересажены с помощью пипетки для переноса в перивителиновое пространство энуклеированных ооцитов. Образующиеся при этом комплексы кариопласта и цитопласта (КЦК) подвергались двукратному воздействию по 10 мкс электрического импульса 2,1 кВ/см с целью индукции слияния. КЦК выращивали в инкубаторе в среде Ham"s F-12 (Sigma) с 10% FCS. Слияние контролировали чрез 30-60 минут после воздействия электрическим импульсом посредством наблюдения в микроскоп.

Через 24 часа после начала созревания КЦК активировали посредством 5-ти минутной инкубации в 7% спирте и затем выращивали в течение 5 часов в 10 мкг/мл циклогексимида (Sigma С-7698) и 5 мкг/мл цитогалазина В (Sigma С-6762). Затем КЦК переносили в 100 мкл капли среды CR-1 (Rosenkrans, First, 1991) с 10% эстральной сыворотки коров. Капли покрывали слоем парафинового масла и инкубировали в течение 7-8 дней при 39^oС во влажной атмосфере с 5% СО₂, 5% О₂ и 90% N₂.

Как следует из приведенной таблицы, уже в первом опыте была достигнута степень деления, равная 86%, и выход бластоцист 55%. Таким образом, были получены результаты, по своей эффективности превышающие результаты, полученные стандартным способом с использованием процедуры "голодания" фибробластов.

Пересадка эмбрионов

Выбор реципиентов

В качестве реципиентов использовались телки, отвечающие следующим критериям:

1. Разведение в хозяйствах, свободных от вируса Герпеса, Тип 1;

2. Серологические исследования на антитела BHV-1 (инфекционный ринотрахеит/ инфекционный вульвовагинит) - отрицательные;

3. Серологические исследования на BVD (вирус диареи КРС)/ MD-антиген (мукозная болезнь) - отрицательные;

4. Соответствующее возрасту (13-16 месяцев) развитие тела;

5. Раздельное половое созревание; у животных, которые должны вынашивать потомство, - раздельное созревание;

6. Гинекологические исследования без патологии.

Все реципиенты после помещения в коровники получали минеральные добавки (All Trace, Ranching Consult GmbH) с целью равного обеспечения селеном, медью и кобальтом (Wittkowski et al., Zur Selensupplementierung bei Faersen; Jahrestagung derAET-d. 13.06.-14.06.1996, Маркредвитц).

Отрицательных по вирусу диареи животных иммунизировали против BVD/MD (Rumilis, Intervert) для уменьшения инфекционного риска при пересадке эмбрионов (Moedl et al., Control of bovine viral diarrhea virus in abttoir ovaries for in vitro fertilisation (IVF) of cloning programs; 11e Reunion A.E.Т. Е. -Hannover, 8-9 сентября 1995) или при помещении в коровники с неизвестным статусом по BVD. Кормление осуществляли вволю силажом, сеном и соломой. Весной и осенью проводили противогельминтные обработки (Ivomec, MCD Agvet). Содержание реципиентов было частично беспривязным (открытые коровники, группы по 6 животных), частично - привязным.

Подготовка реципиентов

Пересадку полученных in vitro эмбрионов проводили синхронизированным по половому циклу реципиентам, то есть стадия полового цикла соответствовала возрасту пересаживаемых эмбрионов. При этом день наступления охоты определяли как день 0 цикла. Синхронизацию охоты осуществляли посредством однократного внутримышечного введения аналога простагландина F₂- (2,0 мл Estrumate, Mallinckrodt Veterinary). Телки, у которых посредством ректальной пальпации не диагностировалось желтое тело, не использовались для синхронизации охоты. Охота обычно наступала через 2-3 дня после введения гормона и оценивалась по поведению животных и наличию слизи.

Пересадка эмбрионов

Полученные in vitro эмбрионы после 7-ми дневного культивирования пересаживали соответствующим реципиентам. С этой целью после идентификации эмбрионов, их качественной оценки и контроля целостности зоны эмбрионы переносили в соответствующую среду для пересадки и засасывали в минипайеты. В качестве среды для пересадки использовали PBS +10% FCS (Biochrom), среду для культивирования эмбрионов (ICP, Neuseeland) + 10% FCS или TL-Hepes + 10% FCS.

Закрытые пайеты хранили в миниинкубаторе при 37,8^oС около 90 мин до момента их пересадки.

Соответствие реципиентов оценивали по следующим критериям:

у животных приблизительно за 7 дней до пересадки наступала охота, при этом асинхронность в охоте не должна была превышать 24 часа (Hasler et at., Theriogenology 43 (1995), 141-152). Важное значение придавалось наличию и размеру желтого тела (Assey et al., Theriogenology 39, 1321-1330).

У используемых животных не наблюдалось заболеваний полового тракта.

После отбора животных выполняли эпидуральную анестезию (2,0 мл Udocain, Albrecht) и осторожно очищали наружные половые органы с помощью сухой бумаги. Пайету с эмбрионами помещали в катетер для пересадки (Minitb), подогретый до температуры тела, который закрывали пластиковым колпачком (Sanisheath, (Minitb)). Пересадку проводили бескровным способом под ректальным контролем прохождения катетера через шейку матки и его позиции в кончике рога матки (Reichenbach et al., J. Reprod. Fertil. 95 (1992), 363-370). При этом снятие пластикового колпачка осуществляли перед помещением катетера в матку с тем, чтобы исключить попадание микроорганизмов из влагалища в матку. Если предполагалось пересаживать несколько эмбрионов одному реципиенту, то пересадку проводили билатерально. С этой целью катетер вытягивали назад в матку, удаляли пустую пайету, после чего вставляли новую пайету с эмбрионом (эмбрионами) и продвигали катетер в другой рог матки. Сразу после пересадки эмбрионов осуществляли документацию данных (номер реципиента, происхождение, число и качество эмбрионов и т.п.).

Исследование беременности

Через 21 день после начала охоты, то есть через 14 дней после пересадки эмбрионов, проводили контроль охоты и определяли содержание прогестерона в крови. Если значение концентрации было ниже 0,1 нг/мл, то животное считали не стельным. Если уровень прогестерона был выше 2,0 нг/мл, то животное считали стельным. Первое непосредственное исследование стельности проводили на 35-ый день стельности посредством ультразвука, а на 42-ой день стельности выполняли мануальное исследование.