способ количественного определения биологической активности (токсичности и стимулирующей способности) тестируемых объектов

Формула изобретения

1. Способ определения биологической активности (токсичности и стимулирующей способности) тестируемых объектов, включающий подготовку образцов биосенсоров, исследуемых и контрольных объектов, введение биосенсоров в тестируемые и контрольные объекты с последующей оценкой качества тестируемого объекта, отличающийся тем, что биосенсор выбирают из одной партии, адаптируют к условиям эксперимента и выдерживают одновременно при тождественных условиях в исследуемом и контрольном тестируемых объектах в течение заданного времени, измеряют наиболее чувствительный параметр (отклик) к воздействию на биосенсор компонентов в тестируемом объекте, по результатам измерения параметров биосенсора строят графическую зависимость относительного отклика биосенсора от концентрации компонентов в тестируемом объекте, определяют количественно коэффициент биологической активности, а затем биологическую активность определяют на основе коэффициента токсичности или коэффициента стимуляции компонентов тестируемого объекта.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологическую активность компонентов, содержащихся в тестируемых объектах стандартизируют по величине предэкспоненциального множителя, чувствительности биосенсора, временному и температурному факторам.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к экологии, токсикологии, санитарии, гигиене, охране окружающей среды и может быть использовано в фармакологии и медицине для определения различных факторов воздействия на живые организмы отдельных компонентов и их смесей.

Известен способ определения "токсичности" отдельных веществ и сточных вод [Тест токсичности на Chlamydomonas //Унифицированные методы исследования качества воды. М. : СЭВ, 1983, с. 201-208] . В качестве тест-организма (биосенсора) используется чистая культура Chlamydomonas gelatinosa. Способ основан на изучении влияния токсических веществ на размножение Chlamydomonas gelatinosa. Для этого готовят образцы растворов различной концентрации исследуемых токсических веществ в стандартной питательной среде и две контрольные колбы со стандартным питательным раствором без добавления токсического вещества. Затем в подготовленные исследуемые и контрольные образцы вносят одинаковые объемы исходной суспензии культуры Chlamydomonas gelatinosa. Сосуды с исследуемыми и контрольными образцами помещают в шкаф с люминесцентным освещением, выдерживают в течение 21 суток, просматривая колбы и подсчитывая организмы в счетной камере каждые вторые сутки. Результаты подсчетов сравнивают с ранее созданными табличными данными. Для наглядности отображения цифровых данных строят различные графики. В расчет принимаются только неповрежденные организмы.

Основной недостаток способа оценки результатов токсикологических исследований заключается в том, что каждый организм реагирует индивидуально на присутствие токсического вещества. Следовательно, результат экспериментов часто зависит не только от концентрации токсического вещества и условий опыта, но и от присутствия в испытуемой группе индивидуумов с различной чувствительностью.

Известен способ оценки токсичности на основе статистической обработки результатов индикации [Пробитный анализ оценки токсичности //Унифицированные методы исследования качества воды. М.: СЭВ, 1983, с. 232-245]. При этом в качестве критерия токсического действия испытуемого вещества различной концентрации определяют летальность подопытного организма в системе координат "концентрация вещества - процент смертности". Такой подход позволяет установить значение концентрации токсического вещества, при которой погибает 50% испытываемых организмов (LС₅₀). Способ включен в Американские и международные стандартные методы определения токсичности.

Существенным недостатком способа является ограниченность статистической достоверности результата для получения плавных кривых, что приводит к необходимости применения вычислительных методов, которые, по мнению авторов, позволяют получить объективные данные. Однако главный недостаток способа состоит в том, что он позволяет определят только величину концентрации токсического вещества, при которой погибает 50% испытываемых организмов (LC₅₀), но не токсичность среды и на конечный результат влияют многочисленные факторы, которые трудно учесть в эксперименте (негомогенность биологического материала, колебание температуры среды, возраст особей, значение рН и прочие параметры).

Известен способ определения острой летальной токсичности веществ, растворенных в воде [Международный стандарт. ИСО 7346/2-84]. При этом в качестве теста используют летальный исход для 50% различных видов рыб, обитающих в пресной, солоноватой и морской воде. Определение концентрации вещества, при которой наблюдалась 50% гибель тестовой популяции рыб, проводят после их нахождения в воде в течение 24, 48, 72 и 96 ч. Тест проводят в два этапа: 1) предварительный тест, который дает приблизительную острую, среднюю летальную концентрацию и служит основанием для установления диапазона концентраций при окончательном тестировании; 2) окончательный тест, результаты которого регистрируют. При этом рассматриваются различные критерии и требования к исходной концентрации вещества, оборудованию, тестовым организмам, технологии разбавления воды и т.п.

Основной недостаток способа состоит в том, что он ограничивает возможность оценки только летальной концентрации токсического вещества на уровне гибели 50% особей (биосенсора), но не токсичность тестируемой среды, и конечный результат зависит от многочисленных факторов (негомогенность биологического материала, колебание температуры среды, возраст особей, значение рН и прочие параметры).

Известен способ определения предельно допустимой (безвредной) концентрации (ПДК) химических веществ в продуктах питания и в окружающей среде для живых организмов. основанный на принципе порога действия вне зависимости от характера действия (общетоксического, раздражающего, канцерогенного, мутагенного, аллергического и т.п.) [Беспамятнов Г.П., Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. Л., Химия, 1985, 528 с.]. Основная последовательность действий заключается в размещении подопытных животных в затравочных камерах, обеспечивающих достаточную подвижность животных, оптимальный воздухообмен, очищенный от примесей, температуру 20-25^oС, влажность 70-75%. Необходимую концентрацию химических веществ создают с помощью специальных дозаторов, тип и конструкция которых зависит от агрегатного состояния вещества и особенностей их физических и химических свойств. Действие вещества изучается в 4-месячном эксперименте.

Недостатки способа заключаются в трудности эмпирического подбора диапазона исследуемых концентраций химического вещества, объективности оценок специфичности воздействия только этого вещества на испытуемый объект, большой длительности испытаний (до 3-х лет) и высокой стоимости всего цикла получения и обобщения полученных результатов.

Известен способ определения токсичности водной среды по авторскому свидетельству 1822976, основанный на использовании в качестве биосенсора личинок остромордой лягушки с ампутированной половиной хвоста. Личинки выдерживают в течение 3-х суток в исследуемом водном растворе и последующей регистрацией длины регенерата хвоста. Величина прироста регенерата хвоста зависит от концентрации загрязняющего компонента (например, ионов меди) в растворе. По наличию достоверных отличий между длинами регенератов хвоста в загрязненном и контрольном водных растворах оценивают токсичность исследуемой водной среды.

Недостатками способа являются большая длительность эксперимента (до 3-х суток) и определение только порогового уровня токсичности водной среды, зависящей от концентрации загрязняющих веществ, температуры испытания, рН и других параметров).

Известен способ определения токсичности водной среды [патент РФ 2003096] , основанный на нахождении сидячих беспозвоночных организмов типа губок в течение 3-х часов в тестируемой среде при добавлении в нее флюоресцирующего раствора. При этом у контрольных губок наблюдают отталкивание красителя водой, выбрасываемой из оскулюмов. У губок, находящихся в растворах с загрязнителями, отсутствует реакция отталкивания на краситель, и краситель оседает на губке.

Недостатком способа является определение только порогового уровня токсичности, но не токсичности тестируемого раствора, зависящего от концентрации загрязняющих веществ. Известен способ биологического мониторинга экологических систем и объектов [заявка на изобретение Российской Федерации 97108740 от 27.03.99 г.] с использованием свободно живущих тест-организмов (инфузорий парамециум квудатум). Тестирование проводят последовательно в три этапа: 1) вносят вещество проверяемого объекта в стандартную среду с тест-организмами и через 0,5-24 ч оценивают наличие или отсутствие активности вещества по сравнению с поведением тест-организмов в контрольной среде; 2) инкубированные в течение 24 ч смесь раствора тест-организмов с веществом проверяемого объекта и контрольный раствор тест-организмов в стандартной среде подвергают функциональным нагрузкам до полной гибели тест-организмов. При этом регистрируют продолжительность их жизни с момента начала функциональных нагрузок. По полученным данным оценивают стимулирующее или токсическое действие вещества; 3) в случае обнаружения стимулирующего действия вещества смесь инкубируют в течение 3-4 суток, затем подсчитывают количество тест-организмов в фиксированном объеме смеси и по полученному результату оценивают скорость размножения тест-организмов.

Недостатки способа заключаются в получении только качественной оценки токсического действия вещества, которую трудно интерпретировать с количественных критериев.

Прототипом предлагаемого изобретения является способ определения степени загрязнения почв тяжелыми металлами [авт. св. РФ 1455300]. Сущность способа заключается в отборе пробы почвы в обследуемом районе, построении градуировочного графика зависимости относительного прироста отрезков колеоптилей от концентрации специально внесенных в фоновую почву из того же района индивидуальных (приоритетных для исследуемого предприятия-загрязнителя) токсикантов, тщательного перемешивания каждого образца почвы, увлажнения до пастообразного состояния и помещения на подготовленные образцы почв отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы. Контролем служит почва из фонового района. Через 10-24 ч измеряют прирост отрезков колеоптилей на всех образцах почвы. Определяют относительный прирост отрезков на исследуемых, приготовленных для построения градуировочного графика и контрольных образцах и по их отношению к контролю строят калибровочный график зависимости отношения от концентрации металла в почве. Концентрацию тяжелых металлов в исследуемом образце почвы находят по величине относительного прироста отрезков колеоптилей на исследуемой почве и построенному калибровочному графику.

Недостатки прототипа заключаются в условности оценки степени реального загрязнения почвы в техногенном районе на основании отклика биосенсора на загрязнение почвы только приоритетным загрязняющим веществом для данного техногенного района, а также трудности сравнения степени загрязнения почвы из районов с разными приоритетными загрязняющими веществами.

Целью предлагаемого изобретения является возможность создания способа количественного экологического нормирования качества (степени загрязнения) объектов окружающей среды, лекарственных препаратов и продуктов питания, установления вклада в суммарную токсичность среды смесей компонентов, отдельных групп или индивидуальных компонентов, включая такие составляющие как отдельные катионы или анионы в солях), величины эффектов синергизма и антагонизма и другие), нормирования отклика применяемого биосенсора и установленной с помощью биосенсора токсичности компонентов в тестируемом объекте к стандартизованным условиям.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе по прототипу биосенсор выбирают из одной партии, адаптируют к условиям эксперимента и выдерживают одновременно при тождественных условиях в исследуемом и контролируемом тестируемых объектах в течение заданного времени, измеряют наиболее чувствительный параметр (отклик) к воздействию компонентов в тестируемом объекте на биосенсор, по результатам измерения параметров биосенсора строят графическую зависимость относительного отклика биосенсора от концентрации компонентов в тестируемом объекте, определяют количественно биологическую активность компонентов в каждой пробе тестируемого объекта и коэффициент биологической активности (коэффициент токсичности или стимуляции), а затем нормируют биологическую активность, и/или коэффициент биологической активности, и/или отклик биосенсора.

1. Способ определения биологической активности (токсичности и стимулирующей способности) тестируемых объектов, включающий подготовку образцов биосенсоров, исследуемых и контрольных объектов, введение биосенсоров в тестируемые и контрольные объекты с последующей оценкой качества тестируемого объекта, отличающийся тем, что биосенсор выбирают из одной партии, адаптируют к условиям эксперимента и выдерживают одновременно при тождественных условиях в исследуемом и контролируемом тестируемых объектах в течение заданного времени, измеряют наиболее чувствительный параметр (отклик) к воздействию на биосенсор компонентов в тестируемом объекте, по результатам измерения параметров биосенсора строят графическую зависимость относительного отклика биосенсора от концентрации компонентов в тестируемом объекте, определяют количественно коэффициент биологической активности (коэффициент токсичности или коэффициент стимуляции) и биологическую активность (токсичность или способность к стимуляции) компонентов в каждой пробе тестируемого объекта, а затем нормируют биологическую активность, и/или коэффициент биологической активности, и/или отклик биосенсора;

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологическую активность компонентов, содержащихся в тестируемых объектах, нормируют по величине предэкспоненциального множителя, чувствительности биосенора, временному и температурному факторам.

1. Способ определения коэффициента биологической активности (коэффициентов токсичности "k" и коэффициентов стимуляции "k_st") компонентов, находящихся в тестируемом объекте (например, в объекте окружающей среды, продукте питания и лекарственном препарате), включающий нормирование выбранного типа, сорта и индивидуальных особенностей биосенсора и компенсации влияния колебаний условий во время эксперимента за счет использования в каждой серии опытов одинакового количества биосенора одной партии в тестируемом объекте (неизвестного состава или с известными концентрациями исследуемых компонентов) и в контрольном (незагрязненном) объекте, а затем использования для каждого тестируемого объекта отношения среднего значения отклика выживших или погибших особей биосенсора "R(bt)( в каждой тестируемой пробе к отклику биосенсора в контрольной пробе. Затем строят графическую зависимость R(bt) от концентрации компонента(ов) "С" и обработкой экспериментальных данных известным интегральным методом находят величину коэффициента токсичности (стимуляции) исследуемого компонента(ов) к примененному биосенсору. Под откликом биосенсора принимают наиболее чувствительное и фиксируемое свойство выживших особей (изменение массы, длины, числа, интенсивности свечения и т.д.).

Пример 1.1

Определение коэффициентов токсичности соединений тяжелых металлов в почве с использованием в качестве биосенсора ростовых свойств (прироста) отрезков колеоптилей трехсуточных проростков зерен пшеницы сорта "Заря", в качестве тестируемой среды - увлажненной стандартной почвы, например СДПС-1 с различными концентрациями (С) добавленных растворов Рb(NО₃)₂, CdS0₄ и Zn(NО₃)₂, а в качестве контрольной среды увлажненную стандартную фоновую почву СДПС-1. Сущность эксперимента состоит в следующем: 25-30 проростков зерен пшеницы, полученных в отсутствие освещения, отделяют от корней и зерновок, отбирают образцы проростков одинаковой длины и специальным ножом вырезают участки длиной 4 мм, расположенные на 5 мм ниже верхушек. Отрезки колеоптилей помещают на увлажненную почву в закрытую ячейку и выдерживают без доступа света в сушильном шкафу при 25 С в течение 24 ч. За это время полностью завершается прирост отрезков колеоптилей. Затем измеряют длину каждого отрезка колеоптиля с помощью спектральной лупы или другого измерительного инструмента, рассчитывают среднюю величину прироста длины отрезков колеоптилей для каждой пробы тестируемого объекта и берут отношение средних величин прироста отрезков колеоптилей в тестируемой и контрольной пробах. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей (R(bt)) от концентрации нитратов свинца, цинка и сульфата кадмия в почве (ммоль/кг почвы) приведена на фиг.1 и 2.

Обработка экспериментальных данных интегральным методом (линейная зависимость в координатах ln R(bt)=fC) с тангенсом угла наклона прямой к оси "С", равной "k", показала, что коэффициент токсичности "k" для почвы СДПС-1, загрязненной соединениями Zn(NО₃)₂, Рb(NО₃)₂ и CdS0₄, составляют 0,137; 0,241 и 3,066 кг почвы/ммоль, а зависимость относительного отклика биосенсора от концентрации токсиканта описывается в общем виде уравнением

R(bt)=100e^-kC, /1/

и в частных случаях уравнением

R(bt)=Ae^-kC, /1.1/

где А100 - параметр, характеризующий область соблюдения зависимости /1/; k - коэффициент токсичности компонента (смеси компонентов) в тестируемом объекте, [л/ммоль; л/мг; кг/ммоль; кг/мг]; С - концентрация компонента (смеси компонентов) в тестируемом объекте. Кривые на фиг.1 и 2, рассчитанные по уравнениям /2-4/, удовлетворительно согласуются с экспериментом:

R(bt)=92e(-0,241C) - для Рb(NO₃)₂; /2/

R(bt)=89е(-0,137С) - для Zn(NО₃)₂; /3/

R(bt)=95е(-3,066С) - для CdSО₄. /4/

Фиг. 1. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы "Заря" от концентрации Рb(NО₃)₂ и Zn(NО₃)₂ в почве

Точки - эксперимент. Кривые рассчитаны по уравнениям

R(bt)=92е(-0,241С) для Рb(NО₃)₂ /2/ и

R(bt)=89e(-0,137C) для Zn(NО₃)₂ /3/

Фиг. 2. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы "Заря" от концентрации CdSО₄ в почве

Точки - эксперимент. Кривая рассчитана по уравнению

R(bt)=95е(-3,066С). /4/

Параметр "А10О" в уравнениях /2-4/ характеризует диапазон соблюдения экспоненциальной зависимости.

Поскольку коэффициент биологической активности имеет самостоятельное значения для сравнения токсичности различных компонентов, то их целесообразно выражать в размерности л/ммоль или кг/ммоль.

Вместо ростовых свойств отрезков колеоптилей в этом эксперименте может использоваться любой другой биосенсор, который дает количественный и измеряемый отклик наиболее чувствительного свойства организма на содержание компонентов в тестируемом объекта.

Пример 1.2.

Определение коэффициентов токсичности различных солей в водных растворах с использованием в качестве биосенсора ростовых свойств отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы сорта "Заря", в качестве тестируемого объекта водных растворов с различными концентрациями индивидуальных солей КСl, КNО₃, NaCl, NaNО₃; K₂SО₄, Na₂SО₄ и CH₃COONa, с которыми в течение суток контактируют отрезки колеоптилей трехсуточных проростков зерен пшеницы сорта "Заря". Контрольным объектом используют дистиллированную воду. Методика подготовки биосенсора (отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы), проведения эксперимента и нахождения параметров "А" и "k" не отличались от описанных в примере 1.1. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы от концентрации водных растворов КСl, КNО₃, NaCl, NaNО₃ (ммоль/л) приведена на фиг.3, а от концентрации растворов К₂SО₄, Na₂SО₄ и CH₃COONa (ммоль/л) на фиг.4, где кривые рассчитаны соответственно по уравнениям

R(bt)=100е^-0,0063C (для растворов КСl, KNО₃, NaCl, NaNO₃). /5/

Из данных, приведенных на фиг.3 и 4, следует, что коэффициенты токсичности для каждой группы водных растворов (КСl; KNО₃; NaCl; NaNO₃) и (K₂SO₄; Na₂SO₄) практически одинаковые и равны соответственно 0,0063; 0,0060; 0,0063; 0,0066 л/ммоль и 0,0333; 0,0337 л/ммоль. Средние величины k=0,0063 (для КСl; КNО₃; NaCl; NaNO₃) и k=0,0335 (для К₂SО₄; Na₂SО₄) л/ммоль были использованы для расчета кривых, приведенных на фиг.3 и 4.

Фиг. 3. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы от концентрации водных растворов солей

Кривая рассчитана по уравнению R(bt)=100е^-0,0063C . /5/

Экспериментальные данные описываются уравнениями

R(bt)=100е^-0,0060C - для КНО₃; /5.1/

R(bt)=100е^-0,0063C - для КСl; /5.2/

R(bt)=100e^-0,0063C - для NaCl; /5.3/

R(bt)=100е^-0,0066C - для NaNО₃. /5.4/

Фиг. 4. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы от концентрации водных растворов солей

K₂SО₄, Na₂SО₄ и CH₃COONa

Кривые рассчитаны по уравнению R(bt)=100е^-0,0335C для K₂SO₄, Na₂SO₄ /6/

и R(bt)=100е^-0,059C для CH₃COONa. /7/

Пример 1.3.

Определение коэффициентов токсичности продуктов питания и примесей в них соединений тяжелых металлов с использованием в качестве биосенсора ростовых свойств отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы сорта "Заря", тестируемой среды продуктов питания водного экстракта чая сорта "Золотая чаша" и водного экстракта чая, содержащего различные концентрации добавленного раствора сульфата меди, а контрольной пробы - дистиллированной воды. Методика подготовки биосенсора (отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы), проведения эксперимента и нахождения параметров "А" и "k" не отличались от описанных в примере 1.1.

Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы от содержания экстракта чая (кг чая/л), приведена на фиг.5.

Фиг. 5. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей от концентрации экстракта чая в воде

Точки - эксперимент, кривая рассчитана по уравнению

R(bt)=100e(-0,252C). /8/

Для оценки влияния концентрации сульфата меди на токсичность экстракта чая берут экстракт чая, содержащий 0,054 кг сухого вещества на литр воды и добавляют в каждую пробу возрастающие (от нуля в контрольном опыте) концентрации раствора CuSО₄. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей в экстракте чая (0,054 кг/л) от концентрации сульфата меди в экстракте чая (С, ммоль/л) приведена на фиг.6.

Пример 1.4.

Определение коэффициента токсичности лекарственного препарата водного раствора стрептомицина с использованием в качестве биосенсора генно-инженерных бактерий Эколюм-5, а в качестве контрольного объекта дистиллированную воду. Сущность эксперимента заключалась в следующем: в кювету вместимостью 1,0 мл помещают 0,1 мл биосенсора в буферном растворе 5 mM HEPES-Na с рН 7,3 и 0,9 мл тестируемой пробы. Концентрация клеток биосенсора была 210⁷ в 1 мл. Температура эксперимента 23^oС. Измерение интенсивности свечения бактерий проводили с использованием прибора Биотокс-10. Методика обработки экспериментальных результатов и нахождения параметров "А" и "k" не отличалась от описанной в примере 1.1. Зависимость относительного изменения интенсивности свечения бактерий (среднее из 6 повторностей) от концентрации стрептомицина (ммоль/л) при инкубации 180 мин приведена на фиг.6.

Фиг. 6. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы от концентрации CuSО₄ в экстракта чая

Точки - эксперимент, кривая рассчитана по уравнению

R(bt)=100е(-2,19С).

Пример 1.5.

Определения коэффициента стимуляции "k_st" ауксина или трихлорфеноксиацетата аммония (препарат 2-4 Д) в стандартной почве СДПС-1 с использованием в качестве биосенсора ростовых свойств отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы, а в качестве контрольного объекта незагрязненной стандартной почвы СДПС-1. Методика выбора, подготовки к эксперименту, проведения эксперимента и обработки экспериментальных результатов не отличалась от описанной в примере 1.1. Экспериментальные данные зависимости относительного отклика биосенсора от концентрации ауксина в водном растворе приведены на фиг.7.

Фиг. 7. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей (R(bt)) от концентрации ауксина в почве СДПС-1.

Точки - эксперимент, кривая - расчет.

2. Способ количественного определения токсичности "Т" или способности к стимуляции "St" компонентов в тестируемых объектах с использованием биосенсоров, отличающийся тем, что величины биологической активности объекта ("Т" или "St") находят по произведению коэффициента токсичности "k" или коэффициентов стимуляции "k_st" (найденных по способу 1) на концентрацию исследуемого соединения (смеси соединений) в тестируемом объекте:

T=kC; /12/

St=k_stC /13/

и на основании рассчитанных значений биологической активности тестируемых объектов строят зависимость относительного отклика биосенсора от токсичности или от способности к стимуляции тестируемого объекта.

Пример 2.1.

Результаты расчета токсичности тестируемого объекта по уравнению /12/ и нахождение зависимости относительного отклика различных типов биосенсоров от токсичности различных тестируемых объектов с разными токсикантами приведены на фиг.8.

Фиг.8. Зависимость относительного отклика биосенсера (отрезки колеоптилей проростков зерен пшеницы) от токсичности водных растворов

NaCl(2), KCl(3), NaNО₃(4), KNО₃. (5)

Кривая (1) - расчет по формуле R(bt)=100e(-T).

Пример 2.2.

Результаты расчета биологической активности примесей в тестируемом объекте по уравнению /13/ при использовании в качестве биосенсора ростовых свойств (прироста) отрезков колеоптилей трехсуточных проростков зерен пшеницы сорта "Заря", в качестве тестируемой среды увлажненной стандартной почвы, например СДПС-1, содержащей различные количества ауксина (стимулятора), а в качестве контрольного объекта - увлажненной стандартной почвы СДПС-1 - приведены на фиг.9.

Фиг. 9. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы от стимулирующей способности (St) ауксина

Точки - эксперимент, кривая - расчет.

3. Способ нормирования биологической активности компонентов в тестируемом объекте по величие предэкспоненциального множителя, длительности контакта биосенсора с компонентами тестируемого объекта и по температуре с целью получения стандартизованных значений биологической активности одного и того же тестируемого объекта с использованием различных биосенсоров. Существо проблемы и способы ее разрешения приведены в нижеследующих примерах.

Пример 3.1.

Способ нормирования биологической активности компонентов в тестируемом объекте позволяет учесть отклонение величины предэкспоненциального множителя в уравнении /6/ от 100. Для любого биосенсора одному и тому же относительному отклику биосенсора должна соответствовать одинаковая биологическая активность компонентов в тестируемом объекте, по предэкспоненциальному множителю необходимо приравнять правые части уравнений /6/ и /7/ при нормировании R(bt) и логарифмы уравнений /6/ и /7/ при нормировании биологической активности компонентов тестируемого объекта (Т)

Ae^-Tl=100е^-T. /14/

Решение уравнения /17/ позволяет нормировать T₁ относительно Т с помощью соотношения

Т=ln(100/A)T₁. /15/

Решение уравнений /14/ и /15/ при Т=T₁ дает выражение

ln[R(bt)₁/A]=ln[R(bt)/100] /16/ или

R(bt)=100R(bt)₁/A. /17/

Пример 3.2.

Необходимость и способ нормирования биологической активности компонентов в тестируемом объекте продемонстрируем на примере биосенсора - ростовых свойств отрезков колеоптилей. Хорошо известно, что степень поражения живых организмов (биосенсоров) обычно возрастает с увеличением длительности нахождения биосенсора в контакте с тестируемым объектом. Однако до сих пор не удавалось установить строгих закономерностей, которые позволяли бы выбирать обоснованную длительность проведения эксперимента при оценке биологической активности компонентов тестируемого объекта или оценивать и учитывать после эксперимента фактор влияния длительности контакта биосенсора с компонентами тестируемого объекта. Исследование кинетики процессов нарастания негативных последствий для биосенсора от длительности контакта с токсичной средой описывается дифференциальным уравнением:

d[R(bt)/d=k_v[R(bt)-R(bt)_пр], /18/

где R(bt) - текущее относительное изменение биосенсора, %;

- длительность контакта биосенсора с тестируемой средой, ч или мин;

k - константа скорости относительного изменения в биосенсоре, 1/с или 1/мин;

R(bt)_пр - предельная величина изменений в биосенсоре при контакте с одним и тем же тестируемым объектом, %.

При граничных условиях =0, R(bt)=100% и = , R(bt)=R(bt)_пр уравнение /18/ имеет решение

R(bt) = R(bt)_прe^(-k), (19)

которое подтверждается (см. фиг.10 удовлетворительным совпадением экспериментальных результатов с рассчитанными по уравнению /19/ кривыми (см. табл. 1).

Фиг. 10. Зависимость относительного прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы от длительности опыта в водных растворах с различной токсичностью

Кривые рассчитаны по уравнению R(bt) = R(bt)_прe^(-k).

Пример 3.3.

Температура оказывает существенное влияние на скорость протекания всех биологических процессов в живых организмах, находящихся в естественных условиях объектов окружающей среды и при определении биологической активности компонентов тестируемой среды. Основной принцип нормирования биологической активности компонентов в тестируемом объекте по температуре и приведения ее к стандартизованной температуре (например, 3^oС) основан на изучении кинетики воздействия компонентов на биосенсор и последующего учета полученных закономерностей с помощью математических уравнений и продемонстрирован на примере оценок влияния концентрации и типа токсиканта на прирост отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы.

Принцип учета температурной зависимости отклика биосенсора от токсичности тестируемого объекта основан на изучении кинетики фиксируемых изменений в биосенсоре для разных сред и температур. Экспериментальное исследование было проведено при трех температурах (30, 50 и 70^oС), а затем по способу, описанному в Примере 9.2, для каждой температуры определяют константу скорости прироста отрезков колеоптилей до достижения предельной величины и по уравнению Аррениуса находят кинетические параметры: (энергию активации и предэкспоненциальный множитель), позволяющие рассчитывать константу скорости негативного влияния токсиканта на биосенсор при любых температурах.

Соблюдение линейной зависимости логарифма константы скорости реакции от обратной величины температуры, приведенные на фиг.11, не оставляет сомнений в подчинении процесса прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы уравнению Аррениуса. Из данных, приведенных в табл. 2 и на фиг.11, следует, что энергия активации процесса прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы равна

U=(lnk(c))/(1/Т)=0,774:0,00017=4553 кал/моль, /20/

а предэкспонента "k₀" в уравнении Аррениуса:

k(c) = k_oe^(-U/RT), (21)

где - символ, означающий разницу величин параметра;

U - энергия активации процесса, кал/моль;

ln - натуральный логарифм;

k(c) - константа скорости прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы;

Т=(273+t) - температура в градусах Кельвина:

t - температура в градусах Цельсия;

R - универсальная газовая постоянная, равная 1,98 моль/(калорийградус);

ln k₀=ln k(c)+U/R(T-T₀)=-2,04+4553/1,98303=5,549, /22/

k₀=257, l/ч.

Таким образом, подстановкой значения k₀=257 и температуры Т в уравнение /21/ можно рассчитывать значение константы скорости реакции для любой температуры.

Константу скорости процессов изменения отклика биосенсора от времени контакта с тестируемой средой, найденную при температуре t, пересчитывают для температуры 23^oС с использованием очевидных соотношений

k_v,t = k_oe^{[-U/R(273+t)]}; (23)

k_v,23 = k_oe^{[-U/R(273+23)]}. (24)

Делением /24 на /23/ получим





С учетом изложенного уравнения /19/ и /20/, приведенные к стандартизованной температуре 23^oС, примут вид соответственно

R"(bt)=R(bt)_пре^-Gtkv,t, /26/

k"_v,23=0,126 GT_CT, /27/

где

G = e^{[-(U/R){(1/296)-(1/(273+t))}]}.

Пример 3.4.

Исследование кинетики прироста отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы в водном растворе КСl с концентрацией 50 ммоль/л при 15^oС показало, что процесс характеризуется величиной k_v= 0,052 1/ч, величина R(bt)=74%. Расчет по формуле /25/ позволяет получить значение стандартизованной константы скорости при 23^oС, равной

k"_v,23=0,068, параметра А=1,307,

а стандартизованные значения R"(bt) и k"_v,23 записать в виде уравнений

R"(bt)=R(bt)пре^{-1,307 tkv,t}; /28/

k"_v,23=0,165 GT_CT. /29/

4. Способ 4 определения с использованием относительного отклика биосенсора количественных характеристик биологической активности тестируемого объекта (токсичности и способности к стимулированию биологических процессов). Для этого заранее строят графики зависимости относительного отклика биосенсора от токсичности и токсичности-стимуляции компонентов в любом тестируемом объекте (типа фиг.8, 9). Затем по относительному отклику биосенсора и градуировочному графику или с применением уравнения, адекватного градуировочному графику, находят токсичность компонентов в контролируемом объекте.

Пример 4.1.

Для серии образцов почвы найдены величины относительного отклика отрезков колеоптилей, равные 80, 60, 40 и 26%. По графику (типа фиг.9) находят, что этим значениям R(bt) соответствует токсичность компонентов в почве 0,11; 0,38; 0,78 и 1,23. В эксперименте указанным пробам соответствовала токсичность 0,08-0,13; 0,36; 0,78 и 1,23.

Пример 4.2.

Для серии образцов водных растворов относительный отклик биосенсора - водорослей Ankistrodesmus falkatus - составил 70, 40 и 19%. По графику (типа фиг. 10) находят, что этим значениям R(bt) соответствует токсичность водных растворов 0,32; 0,88 и 1,62. В эксперименте указанным пробам соответствовала токсичность 0,48; 0,85; и 1,45.

Пример 4.3.

Для серии образцов почвы относительный отклик биосенсора - ростовых свойств отрезков колеоптилей - составил 140, 160 и 170%. По графику (типа фиг. 10) находят, что этим значениям R(bt) соответствует стимулирующая способность компонентов в почве 85; 140 и 180. В эксперименте указанным пробам соответствовала стимулирующая способность ауксина 101; 140 и 210.

5. Способ определения рядов относительной токсичности отдельных соединений и отдельных элементов соединений, например катионов и анионов в солях, по величинам коэффициентов биологической активности тестируемого объекта применительно к используемому биосенсору. Существо способа можно продемонстрировать на следующих примерах.

Пример 5.1

Определение вклада в коэффициент биологической активности водных растворов солей отдельных анионов и катионов. Способ демонстрируется на сопоставлении коэффициентов токсичности водных растворов солей, найденных по способу 1 и сопоставленных в табл. 3 Из сопоставления коэффициентов токсичности водных растворов солей КСl, KNO₃, NaCl и NaNО₃ (k_сред=0,0063 л/ммоль) следует, что сравнительная токсичность ионов Na, К, Сl и NО₃ по отношению к ростовым свойствам отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы тождественна. Замена аниона Сl или NО₃ на SO₄ в солях К и Na сопровождается повышением коэффициента токсичности в 2,64 раза: k(SO₄)/2k(Cl, NО₃)=0,0333:20,0063= 2,64.

Замена анионов в солях NaCl или NaNО₃ на CH₃COONa сопровождается повышением коэффициента токсичности водного раствора в 9,13 раза:

k(CH₃COO):k(Cl, NО₃)=0,0589:0,00645=9,13.

Замена анионов в солях CH₃COONa на Na₂SО₄ сопровождается повышением коэффициента токсичности водного раствора в 3,54 раза:

2k(CH₃СОО):k(SО₄)=0,1178:0,0333=3,54.

Замена анионов в солях Zn(NО₃)₂ на ZnSО₄ сопровождается повышением коэффициента токсичности водного раствора в 2,03 раза:

k(SО₄)/2k(NО₃)=0,340:0,167=2,03.

С учетом количества солей, участвовавших в эксперименте, можно рассчитать, что токсичность анионов SО₄ выше, чем у Сl и NО₃, в 2,52 раза

(42,64+2,03):5=2,52.

Таким образом, можно утверждать, что сульфат- и ацетат-анионы в 2,7 и в 9,5 раза токсичнее нитрат- и хлорид-анионов.

Для оценки сравнительной токсичности катионов в водных растворов солей необходимо использовать отношение коэффициентов токсичности из табл. 5.1 для солей с тождественным анионом. Если за основу взять соль К₂SО₄, то токсичность ZnSО₄, CoSО₄, CuS0₄, NiSO₄, CdSO₄ за счет вклада катиона окажется выше в 10, 28, 70, 94, 1363 раза.

Пример 5.2.

При определении токсичности водных растворов, содержащих примеси технического гиприна (белкового препарата, полученного микробиологическим гидролизом древесины), было установлено, что помимо основного компонента препарат содержит смесь неорганических соединений, включающих (мг/г): К - 73,8, Fe - 15,2, Zn - 13,6, Сu - 3,2, Mn - 34,8. Для выявления роли смеси неорганических компонентов в создании токсичности водного раствора технического гиприна сначала проводят последовательное разбавление навески дистиллированной водой и по относительному отклику биосенсора ростовых свойств отрезков колеоптилей устанавливают коэффициент токсичности смеси. Обработка результатов эксперимента, приведенных на фиг.12, показывает, что коэффициент токсичности раствора гиприна равна k₁=0,0697 л/г. После отделения неорганической составляющей (НК) гиприна и получения зависимости R(bt) от концентрации НК (см. фиг.13) установлено, что коэффициент токсичности НК ₂=0,021 л/г. Из соотношения n=100(0,021:0,0697)=30%

находят, что при условии аддитивного воздействия всех компонентов на биосенсер вклад неорганических компонентов в токсичность технического гиприна составляет 70%.

6. Способ определения по величинам токсичности проб вклада отдельных соединений или групп соединений в общую токсичность среды. Сущность способа заключается в том, что с использованием относительного отклика биосенсора в пробе тестируемого объекта и градуировочного графика (типа фиг.8) определяют токсичность (Т) пробы, содержащей смесь загрязняющих веществ. Затем из тестируемой пробы удаляют одно или несколько загрязняющих веществ и вновь определяют с помощью биосенсора и гардуировочного графика (типа фиг.8) токсичность (T₁) пробы. Разница T-T₁=Т₂ характеризует токсичность отделенной части компонентов из тестируемой пробы.

Пример 6.1.

В образцы тестируемой дерново-подзолистой почвы вводили различные количества нефти и сульфата натрия (см. табл. 6.1). Затем каждый образец почвы делили на две части и из одной части отмывали дистиллированной водой растворимые соли. После этого каждый образец почвы и биосенсор (отрезки колеоптилей проростков зерен пшеницы) готовили к эксперименту и проводили эксперимент. Для каждого образца почвы определяли величину относительного отклика биосенсора и по графику (фиг.9) находили токсичность пробы (Т - загрязненной нефтью и сульфатом натрия и Т₁ - загрязненной только нефтью). Разница Т-T₁= Т₂ (при условии аддитивности воздействия обоих компонентов на биосенсор) характеризует вклад сульфата натрия в общую токсичность почвы (см. табл. 4).

7. Способ определения величины эффектов синергизма или антагонизма при воздействии на живые организмы (биосенсоры) одновременно присутствующих в тестируемых объектах двух и более загрязняющих веществ. Сущность способа заключается в следующем: для серии заранее выбранных водных растворов или образцов почвы с известной концентрацией индивидуальных соединений определяют относительный отклик биосенсора (например, на основе ростовых свойств отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы). С помощью градуировочного графика (типа фиг.8) определяют токсичность (Т_i) каждого раствора. Одновременно готовят смеси индивидуальных соединений с теми же концентрациями, и для каждой смеси определяют относительный прирост отрезков колеоптилей, и с помощью градуировочного графика (типа фиг.8) находят токсичность каждой смеси - T() смеси). Независимо рассчитывают сумму токсичности для каждой смеси соединений сложением токсичности индивидуальных соединений - (Ti). Для оценки эффекта совместного воздействия двух и более компонентов на биосенсор рассчитывают отношение T()/(T_i). В зависимости от величины соотношения (больше 1, меньше 1, равно 1) фиксируют проявление эффектов синергизма, антагонизма или аддитивного действия на выбранный биосенсер одновременно присутствующих соединений.

Пример 7.1.

Для оценки совместного воздействия на прирост отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы использовали растворы различной концентрации CoSO₄ и NiSO₄ и смеси обоих компонентов с аналогичными концентрациями. Результаты исследования, приведенные в табл. 5, не оставляют сомнений, что в водных растворах сульфаты кобальта и никеля оказывают антагонистическое воздействие на ростовые свойства отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы, составляющее 0,650,10 от аддитивной величины.

Пример 7.2.

Для оценки совместного воздействия на ростовые свойства отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы использовали растворы различной концентрации CuSO₄ и CoSО₄ и аналогичные их концентрации в смесях. Результаты исследования, приведенные в табл. 6, свидетельствуют, что в водных растворах сульфаты меди и кобальта оказывают антагонистическое воздействие на ростовые свойства отрезков колеоптилей, составляющее 0,490,07 от аддитивной величины.

Пример 7.3.

Для оценки совместного воздействия на ростовые свойства отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы используют растворы различной концентрации CuSО₄ и NiSО₄ и аналогичные их концентрации в смесях. Результаты исследования, приведенные в табл. 7, свидетельствуют, что в водных растворах сульфаты меди и никеля оказывают антагонистическое воздействие на ростовые свойства отрезков колеоптилей, составляющее 0,580,12 от аддитивной величины.

Пример 7.4.

Для оценки совместного воздействия на ростовые свойства отрезков колеоптилей проростков зерен пшеницы использовали почву СДПС-1 с добавлением растворов различной концентрации индивидуальных компонентов Рb(NО₃)₂, CdSО₄, ZnSO₄ и их смесей.

Результаты исследования, приведенные в табл. 8, свидетельствуют о том, что во всех случаях наблюдается эффект синергизма, но его величина зависит от типа и соотношения составляющих компонентов. При добавлении к почве смеси солей Рb(NО₃)₂ и CdSО₄ среднее значение эффекта синергизма составляет величину 1,590,23. Для смесей солей Pb(NО₃)₂ и ZnSO₄ усредненное значение эффекта синергизма составляет величину 1,220,11. Для смеси солей CdSО₄ и ZnSО₄ усредненное значение эффекта синергизма составляет величину 1,470,18.

Положительный эффект предлагаемого изобретения заключается в получении возможности количественной оценки токсичности и коэффициентов биологической активности любого вещества в тестируемых средах, возможности разработки экологических критериев качества окружающей среды для растительных и животных организмов, создания новых и дешевых методов контроля состояния экологической безопасности населения и мониторинга качества окружающей среды, а также расчета экономического ущерба, нанесенного окружающей среде при осуществлении природопользования или экологических правонарушениях.