способ оценки метаболизма коллагена

Формула изобретения

Способ оценки метаболизма коллагена, включающий забор биологической жидкости, выделение из нее свободного и белково-связанного оксипролина экстракцией этиловым спиртом и центрифугированием, где свободный оксипролин выделяют из надосадочной жидкости, для выделения белково-связанного оксипролина используют гидролизат гидроксидом бария с последующей ионообменной хроматографией, концентрацию оксипролина определяют путем добавления реактива Эрлиха и колориметрирования, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости используют слюну обследуемого человека в количестве 4 мл, добавляют к ней 16 мл этилового спирта, перемешивают, а центрифугирование проводят в течение 15 мин при скорости 3000 об/мин, выделение белково-связанного оксипролина осуществляют на хроматографической колонке диаметром 3 мм, высотой заполнения ионообменной смолой КРС-8п 6 мм, со скоростью движения нейтрализата, равной 0,2 мм в минуту, оксипролин элюируют 1 мл 1н. раствора соляной кислоты, после чего солянокислый элюат нейтрализауют 5н. раствором гидрооксида натрия, при этом оценку распада коллагена и процесса его биосинтеза проводят по возрастанию концентрации свободного или белково-связанного оксипролина соответственно.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинико-диагностическим исследованиям метаболизма коллагена.

Известно, что контроль за репаративными процессами гастродуоденальных язв по рентгенологическим и эндоскопическим исследованиям затруднен.

Заживление гастродуоденальных язв осуществляется благодаря росту и созреванию соединительной ткани, формированию рубца, прочность которого обеспечивается зрелыми коллагеновыми волокнами.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому техническому результату является метод определения метаболитов коллагена в крови, основанный на определении в сыворотке крови свободного и белково-связанного оксипролина. (Методическое письмо для терапевтов и гастроэнтерологов. Метаболиты коллагена - показатели репаративных процессов в области гастродуоденальных язв. Под ред. В.Н. Фетисова, Куйбышев, 1985, с. 4-6).

В известном способе определения метаболитов коллагена при выделении из сыворотки крови свободного и белково-связанного оксипролина и проведении хроматографического анализа для заполнения хроматографической колонки требуется большое количество дорогостоящей смолы. Выпаривание элюата, содержащего большое количество соляной кислоты, требует мощной вентиляционной системы и создает вредные условия труда в лаборатории.

Кроме того, недостатком известного способа является то, что в качестве биологического материала, который берется у обследуемого человека, используется кровь. Как известно, для забора крови необходим стерильный процедурный кабинет, опытный медперсонал, одноразовые шприцы. Это вызывает необходимость в соответствующих материальных расходах (зарплата медсестры и другого персонала для поддержания стерильности в процедурном кабинете, приобретение расходуемых материалов). При взятии крови из вены в медицинской практике в ряде случаев имеет место повреждение кровеносного сосуда, иногда с последующими нарушениями кровообращения. Встречается занос инфекций в кровь, известны случаи заражения гепатитом и ВИЧ. Подобные явления происходят не часто и как правило из-за недостаточной квалификации медперсонала. Эти обстоятельства, а также болевые и другие неприятные ощущения и эмоции часто служат причиной отказа части больных от обследования. Тем более нежелательно взятие крови из вены в тех случаях, когда необходимо проведение серии анализов с небольшими промежутками времени. Соотношение же свободного и пептидсвязанного оксипролина в моче существенно отличается от имеющегося в крови.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение эффективности способа путем снижения травматичности при заборе биологического материала для исследования, а также упрощение и удешевление способа за счет использования в качестве биологического материала слюны.

Для забора слюны, в отличие от забора крови у пациента из вены, не требуется специально подготовленное стерильное помещение, квалифицированный медицинский персонал, одноразовые шприцы.

Поставленный технический результат достигается тем, что в способе оценки метаболизма коллагена, включающем забор биологической жидкости для выделения из нее оксипролина, определение концентрации свободного и белково-связанного оксипролина, оценку распада коллагена и процесса его биосинтеза по соответственно возрастанию концентрации свободного или белково-связанного оксипролина - в качестве биологической жидкости при определении свободного и белково-связанного оксипролина используют слюну обследуемого человека в количестве 4 мл, добавляют в нее 16 мл этилового спирта, после перемешивания центрифугируют в течение 15 минут при скорости 3000 об/мин, а выделение белково-связанного оксипролина производят на хроматографической колонке с диаметром 3 мм, высотой колонки 6 мм с ионообменной смолой и скоростью движения нейтрализата, равной 0,2 мл в минуту, оксипролин элюируют 1 мл 1н. соляной кислоты, после чего солянокислый элюат нейтрализуют 5н. гидроксидом натрия.

Из данных литературы известно о том, что в слюне содержится оксипролин, но при этом отсутствуют данные о взаимосвязи между концентрацией свободного и белково-связанного оксипролина в крови и слюне. Заявителями экспериментально выявлена положительная корреляционная связь между концентрацией свободного и белково-связанного оксипролина в сыворотке крови и слюне. Коэффициент корреляции у практически здоровых людей для свободного оксипролина r= 0,61, для белково-связанного r=0,62. У обследованных 22 больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки коэффициент корреляции между содержанием свободного оксипролина в слюне и сыворотке крови составил 0,75, а белково-связанного 0,77. Этими данными обосновывается возможность и целесообразность использования слюны для оценки метаболизма коллагена в организме по определению концентрации оксипролина в слюне.

Способ оценки метаболизма коллагена осуществляется следующим образом.

При определении свободного оксипролина к 4 мл слюны обследуемого человека прибавляют 16 мл этилового спирта, перемешивают, центрифугируют в течение 15 минут при скорости 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость выпаривают на водяной бане. К сухому остатку приливают 0,3 мл воды и перемешивают. К 0,25 мл пробы прибавляют 0,25 мл изопропилового спирта, перемешивают, прибавляют 0,25 мл окислителя, состав и способ приготовления которого описаны в прототипе, и тщательно перемешивают. Через 4 минуты прибавляют 1,5 мл реактива Эрлиха и перемешивают.

Далее помещают пробу в водяную баню при 60^oС на 30 минут. После инкубации пробу охлаждают до комнатной температуры. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против контроля на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм в кювете 0,5 см.

При определении белково-связанного оксипролина к 4 мл слюны прибавляют 16 мл этилового спирта, перемешивают и центрифугируют в течение 15 минут со скоростью 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, прибавляют 1,5 мл насыщенного раствора гидроксида бария, перемешивают и переносят в ампулу для гидролиза, который проводят в течение 20 часов при температуре 124^oС.

Далее гидролизат нейтрализуют 1-2 каплями 6н. раствора серной кислоты до рН 5,5-5,6 и измеряют объем жидкости.

Нейтрализат пропускают через хроматографическую колонку с ионообменной смолой КРС-8п в Н-форме с диаметром гранул 0,1-0,25 мм, диаметр колонки 3 мм, заполненной ионообменной смолой до высоты 6 мм и скоростью движения нейтрализата равной 0,2 мл в минуту.

Затем оксипролин элюируют 1 мл 1н. соляной кислоты, после чего солянокислый элюат нейтрализуют 5н. гидроксидом натрия до рН 6,8-7.

К 0,25 мл полученного раствора прибавляют 0,25 мл изопропилового спирта, добавляют 0,25 мл окислителя и тщательно перемешивают. Через 4 минуты прибавляют 1,5 мл реактива Эрлиха и перемешивают.

Далее помещают пробы в водяную баню (60^oС) на 30 минут. После инкубации охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм.

При диагностике и оценке метаболизма коллагена по повышенной концентрации свободного оксипролина в слюне судят об усилении распада коллагена в организме человека. А по повышенной концентрации белково-связанного оксипролина в слюне судят об усилении процессов биосинтеза коллагена.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил аналог, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявляемого способа оценки метаболизма коллагена.

Определение из перечня аналогов наиболее близкого технического решения (прототипа) позволило выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому техническому результату отличительных признаков в заявляемом способе оценки метаболизма коллагена, изложенных в формуле изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "новизна".

Для проверки соответствия заявляемого изобретения критерию "изобретательский уровень" заявителем проведен дополнительный поиск известных решений, чтобы выявить признаки, совпадающие с отличительными от прототипа признаками заявляемого способа.

Результаты поиска показали, что заявляемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, определенного заявителем.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "изобретательский уровень".

Критерий изобретения "промышленная применимость" подтверждается тем, что предлагаемый способ оценки метаболизма коллагена может быть успешно, с большой эффективностью без дополнительных материальных затрат использован в медицинских учреждениях России и СНГ.