способ выявления in vitro эффекта аллергизации на введение каптоприла

Формула изобретения

Способ выявления in vitro эффекта аллергизации на введение каптоприла, основанный на определении показателя повреждения нейтрофилов при инкубации крови сенсибилизированного организма с каптоприлом, при этом в опытную пробирку вносят 0,1 мл каптоприла в предварительно выбранной аллергизирующей дозе, в контрольную - 0,1 мл 5% цитрата натрия, затем в обе пробирки вносят по 0,4 мл исследуемой крови, инкубируют 2 ч при 37^oС и мазки окрашивают последовательно реактивом Шифа и гематоксилином Эрлиха, а показатель повреждения нейтрофилов определяют по формуле (Н₁-Н₂): 100, где Н₁ - количество поврежденных нейтрофилов в опыте на 100 просмотренных в мазке, Н₂ - то же в контроле, и при значении 0,1 и выше определяют эффект аллергизации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, касается использования диагностического метода in vitro для выявления аллергизации при введении каптоприла, который может быть использован в качестве лабораторного теста для своевременной оценки сенсибилизации организма и развития аллергических осложнений при лечении данным препаратом.

Известно, что методы in vitro разрабатывались для оценки статуса гиперчувствительности замедленного типа у больных, которым не рекомендуется ставить прямые кожные реакции. Кроме того, установлено, что имеется прямая корреляция между кожными пробами и подобными тестами как при хронических инфекциях, так и при возникновении аллергических реакций на медикаментозные препараты (Фрадкин В.А. Аллергодиагностика in vitro - M. - 1975. - 143с.).

Доказано, что каптоприл, содержащий свободную сульфогидрильную группу, способен легко образовывать ковалентные дисульфидные связи с альбуминами сыворотки крови. На образовавшийся конъюгат в организме синтезируются специфические к лекарственному препарату антитела (Coleman J.W., Jeung J.HK., Tingli H.D., Park B.K. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to protein-reactive drugs and metabolites: criteria for indentification of antibody activity // J. Imrnunol. Methods. - 1986. - V.88. - N. 1. - P.37-44.).

Известно, что терапия каптоприлом может вызывать определенные изменения в картине крови в виде нейтропении, лейкопении, агранулоцитоза. Кроме того, известен целый ряд побочных реакций иммунологической природы при лечении больных данным препаратом (Вильчинская М.Ю., Насонов Е.Л., Жарова Е.А. Иммунологический эффект каптоприла и рамиприла у больных гипертонической болезнью // Клин. мед. - 1990. - .8. - С. 56-57.).

В изученной литературе нам не встретились данные о разработанных тестах для выявления аллергизации организма при лечении больных каптоприлом. Данный вопрос становится актуальным прежде всего потому, что гипотензивная терапия каптоприлом проводится длительно, а нередко и пожизненно.

Целью настоящего изобретения является разработка способа выявления in vitro эффекта аллергизации на введение каптоприла.

Для достижения поставленной цели применялся показатель повреждения нейтрофилов (Тест ППН). Принцип метода основан на усилении амебоидной активности нейтрофилов при инкубации крови сенсибилизированного организма, проявляющейся в виде появления у лейкоцита нескольких выпячиваний - псевдоподий или лобоподий (фиг. 1). Аллергизирующая доза подбиралась в предварительных опытах с кровью интактных животных. Оптимальной принята максимальная концентрация препарата, которая обеспечивала отсутствие выраженной амебоидной реакции со стороны нейтрофилов или внутриклеточных дегенеративных изменений. Для контроля использовали также интактных животных. Специфичность реакции определяли на морских свинках, иммунизированных другими препаратами - динацил, пенициллин, бычий сывороточный альбумин (БСА).

Постановку реакции осуществляли по известной методике: в опытную пробирку вносили 0,1 мл аллергена в необходимой концентраций, в контрольную - 0,1 мл 5% цитрата натрия. Затем в обе пробирки добавляли 0,4 мл исследуемой крови. Опытную и контрольную пробирки инкубировали 2 часа при 37^oС. Мазки крови окрашивали последовательно реактивом Шифа и гематоксилином Эрлиха (Фрадкин В.А. Аллергодиагностика in vitro - М. - 1975. - 143 с.). Показатель повреждения нейтрофилов определяли по формуле - (H₁-Н₂): 100, где H₁ - количество поврежденных нейтрофилов в опыте, Н₂ - в контроле, 100 - просмотренных в мазке. За диагностическое значение принимались показатели от 0,1 и выше.

В эксперименте использовали морских свинок, оптимальной аллергизирующей дозой для проведения теста ППН была выбрана концентрация каптоприла 250 мкг/мл исследуемой крови. Увеличение количества препарата оказывало токсическое действие, так как ППН в крови контрольных животных превышал 0,1 (табл. 1). При подборе аллергизирующей дозы у людей она оказалась еще меньше - 125 мкг/мл.

В результате исследования выявлено, что значения теста ППН с нейтрофилами крови сенсибилизированного организма существенно превышали таковые в контрольных пробах, и данный метод может применяться как лабораторный тест in vitro для оценки аллергизации организма при введении каптоприла.

Примеры конкретного применения.

Пример 1. Изучение эффекта аллергизации у морских свинок после парентерального введения каптоприла.

В эксперименте использовали морских свинок (n= 25), которым вводили подкожно каптоприл в дозе 5 мг/кг веса на адьюванте Фрейнда, две инъекции с интервалом в 6 суток, забор крови осуществляли последовательно на 2, 7, 14, 21 и 45 сутки от повторной иммунизации.

Показатель повреждения нейтрофилов был положительным на 2-е сутки после повторной иммунизации, то есть на 9-е после первого введения препарата. Максимального значения тест ППН (>0,3) достигал на 7-14-й день (фиг. 2 и табл. 2), в последующем плавно снижался, но аллергизация, достаточно умеренная, продолжала сохраняться до 45 суток (максимальный срок наблюдения). Контрольным группам животных гетерологичные препараты (бензилпенициллин, динацил и БСА) вводили по той же схеме и в таких же дозах, что и каптоприл. Забор крови и постановку теста ППН проводили на 2-е и 7-е сутки (табл. 3). Результаты во всех трех группах животных с каптоприлом были отрицательные, то есть значения теста не превышали 0,08, что указывает на достаточно высокую специфичность выбранного метода.

Для характеристики вариационного ряда показателей в табл. 2 и 3 использовали не среднюю арифметическую, а медиану (Me), варианту, меньше которой имеет размеры половина частот. Основным преимуществом Me по сравнению со средней арифметической является то, что при малой выборке на ее размеры не оказывает влияние величина крайних значений вариант в вариационном ряду.

Из приведенных таблиц видно, что каптоприл способен вызывать сенсибилизацию организма, а ее уровень с достаточной долей объетивности можно оценить предложенным тестом ППН.

Пример 2. Выявление аллергизирующего эффекта у больных с артериальной гипертонией, принимавших каптоприл.

У больных, принимавших каптоприл (16 пациентов с АГ), значения теста ППН составляли 0,14-0,32, в то же время в крови практически здоровых людей, никогда не принимавших ингибиторов АПФ (10 человек), они не превышали 0,08 (достоверность различия показателей в указанных группах >95%). Попытка установить роль длительности лечения препаратом на уровень аллергизации (табл. 4) не выявила статистически достоверных различий между показателями в группах (р>0,05). Хотя отмечена тенденция к повышению индекса в случае более длительного приема каптоприла.

Таким образом, можно говорить, что каптоприл обладает аллергизирующей способностью у больных, которым проводится терапия каптоприлом, легко выявляемая аллергодиагностическим тестом in vitro.