способ получения резус-пептидов анти-d, специфически выявляющих антиген rhd в следах крови и выделений

Формула изобретения

Способ получения резус-пептидов анти-D, специфически выявляющих резус-антиген RhD в следах крови и выделений, отличающийся тем, что осуществляют обработку поликлональных аллоиммунных сывороток анти-D протеазой-С с последующей ингибицией фермента путем термической обработки полученных пептидов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, именно к судебно-медицинской иммунологии, и предназначается для получения специфически реагирующих в реакции абсорбции-элюции (РАЭ) резус-пептидов, необходимых для выявления антигена RhD системы Rh (Резус) в следах крови и выделений человека.

В судебно-медицинской практике выявление антигенов системы Rh, в частности антигена RhD, в следах крови и выделений может быть проведено в процессе выполнения судебно-медицинских экспертиз вещественных доказательств по уголовным делам, связанным с преступлениями, направленными против личности человека.

При этом в отечественной экспертизе для исследования следов крови на наличие антигена RhD используется такой чувствительный и простой в выполнении метод, как реакция абсорбции-элюции (РАЭ), принцип и техника выполнения которой подробно описаны в диссертации Гальцевой Е.Е. [1].

Для исследования элюатов, полученных в результате этой реакции, автор использует эритроциты, обработанные протеолитическим ферментом трипсином и взвешенные в растворе альбумина. В данной работе также отмечено, что не все сыворотки пригодны для специфичного выявления антигена RhD в пятнах крови, некоторые из них могут давать ярко выраженную неспецифическую реакцию с пятном крови, не содержащим резус-антиген RhD. Для того чтобы выявление указанного антигена стало специфично, автор предлагает проводить тщательный подбор сывороток анти-D, а также путем разведения доводить их титр до оптимальных значений - 1:32-1:64, при которых, как утверждает автор, сыворотки не реагируют с резус-отрицательными пятнами крови.

В зарубежной практике вместо трипсина применяют другие протеолитические ферменты, в основном растительного происхождения, которые обладают гораздо более высокой серологической активностью, чем трипсин. Так, Gaensslen et al. [6] описывают применение папаина для обработки стандартных эритроцитов с использованием низко-ионной среды (LISS) вместо физиологического раствора хлорида натрия. Для выявления антигена RhD в пятнах крови эти авторы также используют специально подобранные сыворотки анти-D, специфично реагирующие в РАЭ.

Недавно нами при изучении системы АВО была разработана модифицированная РАЭ, предназначенная для выявления антигенов АВО в следах крови и выделений, заключающаяся в применении серологически активных протеаз, в частности микробной протеазы-С (продуцент - Acremonium chrysogenum) для обработки не только стандартных эритроцитов, но и исследуемых пятен крови или выделений [5]. Эта методика существенно повышает чувствительность РАЭ, что значительно расширяет экспертные возможности.

Вследствие этого нами была предпринята попытка применить данную методику к системе Rh, причем с помощью нее выявлять антиген RhD не только в пятнах крови, но и в следах выделений. Этот метод оказался наиболее перспективным в отношении исследования очень старых пятен крови и выделений, но существенным недостатком было то, что почти все сыворотки анти-D давали выраженную неспецифическую реакцию с резус-отрицательными пятнами.

В связи с этим возникла необходимость все имеющиеся у нас сыворотки анти-D протестировать в РАЭ по упомянутым выше методикам Гальцевой Е.Е. [1] и Gaensslen et al. [6]. При проведении РАЭ по методу Gaensslen et al. со всеми сыворотками наблюдалась выраженная неспецифическая реакция с резус-отрицательными пятнами крови, что однозначно указывало на то, что метод Gaensslen et al. для отечественных сывороток анти-D абсолютно не пригоден.

Неспецифическая реакция наблюдалась со всеми сыворотками также при проведении РАЭ по методу Гальцевой Е.Е. Ни к чему не привело и разведение сывороток до титра 1:32 и ниже, а также использование имеющихся у нас готовых сывороток с таким титром. Этот результат полностью опровергает утверждение Гальцевой Е.Е. о пригодности таких сывороток в РАЭ для выявления антигена RhD системы Rh в пятнах крови.

Тем не менее, работы Гальцевой Е.Е. [1] и Gaensslen et al. [6] могут служить аналогами предлагаемому изобретению.

В уже упомянутой работе по системе АВО [5] перед нами также стояла задача по устранению перекрестной реакции сывороток анти-А (), анти-В () с пятнами выделений, содержащими антиген противоположной групповой специфичности. Эта проблема была решена путем абсорбции сывороток анти-А () и анти-В () пятнами слюны, содержащими противоположный антиген, предварительно обработанными лидазой и протеазой-С при определенных условиях. На данное изобретение был получен патент 2138812 "Способ получения специфически реагирующих в реакции абсорбции-элюции сывороток анти-А (), анти-В () при выявлении антигенов А, В в следах выделений человека" [4].

При обработке сывороток анти-D по данной методике было выяснено, что в этом случае метод не подходит из-за того, что при постановке РАЭ с такими сыворотками антиген RhD в пятнах крови и выделений, его содержащих, практически не выявлялся при наличии остаточной неспецифической реакции с резус-отрицательными пятнами.

Однако данная методика [4] является наиболее близко совпадающей с заявляемым изобретением, поэтому она может служить его прототипом.

Наличие неспецифической реакции является самой большой и до сих пор практически не решенной проблемой применения РАЭ для выявления антигена RhD системы Rh в пятнах крови и выделений из-за крайнего дефицита специфичных сывороток анти-D, так как отечественные сыворотки для этой цели практически не пригодны. Таким образом, перед нами встала задача найти оптимальный способ обработки сывороток анти-D для устранения их неспецифичности.

Сравнивая системы АВО и Rh, мы пришли к выводу, что неспецифическая реакция, наблюдающаяся в системе Rh, имеет совсем другое происхождение, чем та же реакция в системе АВО [4].

Выполненные нами исследования свидетельствуют о том, что структура, присутствующая в резус-отрицательных пятнах крови, за счет которой происходит неспецифическое реагирование, серологически идентифицируется как антиген RhD, то есть является D-подобной. Мы считаем, что эта D-подобная структура находится на внутренней стороне мембраны эритроцита и становится доступной для антител при полном разрушении эритроцитов во время образования пятен крови и особенно при их ферментативной обработке. Существованием этой структуры можно объяснить почти полное поглощение антител сыворотки анти-D в течение ее абсорбции энзимированным резус-отрицательным пятном крови.

Анализируя эти предположения, мы пришли к выводу, что для устранения неспецифического реагирования сывороток анти-D нужно воздействовать непосредственно на их молекулярное строение так, чтобы они не могли связываться с D-подобной структурой резус-отрицательных пятен.

Ранее было исследовано и описано, что воздействие ферментов на антитела приводит к постепенному расщеплению их молекул на более короткие пептиды. Причем с уменьшением длины молекул этих пептидов уменьшается и их способность к связыванию с соответствующими им антигенами, что наиболее характерно для действия протеаз микробного происхождения [2].

Таким образом, возникла мысль о том, что возможно ферментативно укоротить антитела сыворотки анти-D до оптимального размера так, что полученные короткие пептиды не смогут добраться до низколежащей D-подобной структуры, в то же время легко связываясь с более доступным антигеном D, находящимся выше на мембране.

Для этой цели было решено непосредственно в сыворотку анти-D добавлять микробную протеазу - протеазу-С. Ее количество, а также продолжительность ферментативной реакции были разработаны экспериментальным путем.

Кроме того, для остановки дальнейшего действия фермента, чтобы он не разрушал уже образовавшиеся пептиды оптимального размера, было необходимо подобрать условия ингибиции протеазы-С.

Таким образом, для разработки и дальнейшего подтверждения достоверности предлагаемого способа получения резус-пептидов, выявляющих антиген RhD в пятнах крови и выделений, в качестве исследуемого материала были апробированы 10 серий стандартных аллоиммунных сывороток анти-D производства Дзержинской СПК с титром антител 1:1024-1:4096. Данными сыворотками типировали пятна крови и выделений, содержащие антиген RhD и не содержащие его (50 пятен). Активность элюатов сывороток, полученных в ходе выполнения РАЭ, исследовали с помощью соответствующих стандартных Rh(+) и rh(-) эритроцитов, обработанных протеазой-С, т. е. ферментом, в наибольшей степени провоцирующим появление неспецифической реакции.

При постановке РАЭ со всеми исходными сыворотками анти-D наблюдалась выраженная неспецифическая реакция с резус-отрицательными пятнами крови и выделений, (типичный результат показан в таблице 1).

В то же время после обработки сывороток анти-D определенным количеством протеазы-С полученные пептиды реагировали в РАЭ совершенно специфично, то есть неспецифическая реакция с резус-отрицательными пятнами полностью устранялась, а антиген RhD в содержащих его пятнах выявлялся по-прежнему четко. При этом неспецифическая реакция с предметом-носителем (различные ткани) также полностью устранялась.

Для прекращения ферментативной активности протеазы-С экспериментальным путем был найден оптимальный способ ее ингибиции, заключающийся в термической обработке полученных пептидов при 70^oС в течение 10 минут. В результате этого резус-пептиды сохраняли свои свойства в течение не менее недели и при применении пептидов после такого срока хранения специфический результат РАЭ оставался таким же четким, как и при применении свежеприготовленных резус-пептидов. В то же время возможность использования приготовленных резус-пептидов в течение всей рабочей недели делает разработанную методику удобной для практического применения.

Типичные результаты РАЭ с использованием резус-пептидов, приготовленных разработанным способом, представлены в таблице 2.

Таким образом, проблема неспецифического реагирования сывороток анти-D в реакции абсорбции-элюции при выявлении антигена RhD в пятнах крови и выделений является решенной.

Предлагаемый способ получения резус-пептидов, специфически выявляющих резус-антиген RhD в следах крови и выделений, обладает следующими преимуществами:

1) предлагаемый способ позволяет полностью устранить неспецифическое реагирование сывороток анти-D в РАЭ с резус-отрицательными пятнами крови и выделений, а также с предметами-носителями пятен крови;

2) делает ненужным этап предварительного подбора сывороток, пригодных для использования в РАЭ при выявлении антигена RhD в пятнах крови и выделений, являющийся трудоемким из-за того, что количество таких сывороток крайне ограничено, особенно в отечественной практике;

3) позволяет использовать более чувствительную технику РАЭ с применением высокоактивных протеаз, что существенно расширяет экспертные возможности выявления антигенов системы Rh, в частности антигена RhD.

Следует отметить, что добавление протеазы-С непосредственно в сыворотку анти-D для получения резус-пептидов, специфически выявляющих антиген RhD, ранее известно не было, найденное нами техническое решение в литературе не описано и отработано в результате проведения большой серии экспериментов, то есть предлагаемое изобретение соответствует критериям оригинальности, новизны и изобретательского уровня.

Пример практического применения способа.

Для приготовления резус-пептидов анти-D в качестве исходного материала берут любые поликлональные сыворотки анти-D, имеющие титр антител в протеазном методе не ниже, чем 1:128.

Способ приготовления пептидов состоит из подготовки сывороток, обработки сывороток анти-D протеазой-С, последующей термической обработки полученных пептидов.

Исходные сыворотки анти-D с высоким титром антител разводят в необходимое количество раз физиологическим раствором хлорида натрия так, чтобы их титр не превышал 1:256-1:512. Исходные сыворотки с титром 1:128-1:256 разводят только в 2 раза.

Далее в сыворотки добавляют протеазу-С в сухом виде из расчета 1 мг фермента на 1 мл сыворотки и инкубируют в холодильнике при температуре 4-6^oС в течение 18-20 часов, в результате чего образуются резус-пептиды [3].

После этого для устранения дальнейшей протеазной ферментативной активности и сохранения полученных пептидов их прогревают в водяной бане в течение 10 минут при температуре 70^oС. Полученные пептиды проверяют на активность и специфичность в реакции абсорбции-элюции с применением протеаз. После этого резус-пептиды готовы к употреблению. Срок хранения при 4^oС готовых резус-пептидов 1 неделя (7 дней).

Источники информации

1. Гальцева Е.Е. Выявление антигена D системы резус в пятнах крови реакцией абсорбции-элюции в судебно-медицинских целях. // Дис... канд. мед. наук, М., 1973.

2. Сахаров Р.С. Применение протеолитических ферментов в изоиммунологии и судебной медицине. // Автореф. дис... доктора мед. наук, М., 1988.

3. Сахаров Р. С., Каверзнева Е.Д. Условия сохранения видовой специфичности крови в пятнах при ферментативном гидролизе. // Суд.-мед. экспертиза, 1988, 1, с. 25-27.

4. Сахаров Р.С., Федулова М.В. Способ получения специфически реагирующих в реакции абсорбции-элюции сывороток анти-А (), анти-В () при выявлении антигенов А, В в следах выделений человека. // Патент 2138812, зарег. 27.09.99.

5. Федулова М.В. Применение протеаз в реакции абсорбции-элюции при судебно-медицинском исследовании следов крови и выделений человека. //Автореф. дис... канд. мед. наук, М., 2000.

6. Gaensslen R.E., Lee H.C., Pagliaro E.M. and Bremser J.K. Evaluation of antisera for bloodstain grouping. I. ABH, MN and Rh. // J. of Forensic Sci., JFSCA, Vol. 30, N 3, 1985, pp. 632-654.