опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов

Формула изобретения

1. Способ доставки генов, включающий введение пациенту нитевидных фаговых частиц, представляющих на своей поверхности лиганд, где вектор внутри фага кодирует генный продукт под контролем промотора.

2. Способ лечения опухолей, включающий способ доставки генов за счет введения пациенту фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемый буфер и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своей поверхности, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.

3. Способ лечения заболеваний клеток гладкой мускулатуры, включающий способ доставки генов за счет введения пациенту фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемый буфер и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своей поверхности, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.

4. Способ лечения ангиогенных заболеваний, включающий способ доставки генов за счет введения пациенту фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемый буфер и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своей поверхности, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лигандом является полипептид, реагирующий с FGF рецептором.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что лигандом является FGF-2.

7. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лигандом является антитело.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что лигандом является одноцепочечное антитело.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело реагирует с HER2/neu.

10. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лиганд генетически слит с фаговым капсидным протеином.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что фаговым капсидным протеином является ген III.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что фаговым капсидным протеином является ген VIII.

13. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лиганд химически конъюгирован с фаговым капсидным протеином.

14. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лиганд дополнительно включает эндосомальный фрагмент ускользания.

15. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что фаговые частицы представляют фрагмент эндосомального пептида ускользания на поверхности фагов.

16. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что фаговый геном является фагемидом.

17. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лиганд дополнительно содержит последовательность ядерной локализации.

18. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что фаговые частицы представляют на поверхности фагов последовательность ядерной локализации.

19. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что терапевтический генный продукт выбирают из группы, состоящей из протеина, рибозима и антисмыслового олигонуклеотида.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что протеин заменяет дефектный ген или частично снимает дефицит генного продукта.

21. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что терапевтическим генным продуктом является цитотоксический агент.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что цитотоксическим агентом является инактивирующий рибосому протеин.

23. Способ по п.21, отличающийся тем, что инактивирующий рибосому протеин является сапорином.

24. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что терапевтическим генным продуктом является антитело, которое связывается с HER2/neu.

25. Фармацевтическая композиция, включающая физиологически приемлемый буфер и частицы нитевидного фага, имеющие лиганд на своих поверхностях, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.

26. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что лигандом является полипептид, реакционноспособный с FGF рецептором.

27. Композиция по п. 26, отличающаяся тем, что полипептидом является FGF-2.

28. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что лигандом является антитело.

29. Композиция по п.28, отличающаяся тем, что антителом является одноцепочечное антитело.

30. Композиция по п. 28, отличающаяся тем, что антитело реагирует с HER2/neu.

31. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что лиганд генетически слит с фаговым капсидным протеином.

32. Композиция по п.31, отличающаяся тем, что фаговым капсидным протеином является ген III.

33. Композиция по п.31, отличающаяся тем, что фаговым капсидным протеином является ген VIII.

34. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что лиганд химически конъюгирован с фаговым капсидным протеином.

35. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что лиганд дополнительно содержит эндосомальный фрагмент ускользания.

36. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что фаговые частицы представляют фрагмент эндосомального пептида ускользания на поверхности фагов.

37. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что фаговый геном является фагемидой.

38. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что лиганд дополнительно включает последовательность ядерной локализации.

39. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что фаговые частицы представляют последовательность ядерной локализации на поверхности фагов.

40. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что терапевтический генный продукт выбирают из группы, состоящей из протеина, рибозима и антисмыслового олигонуклеотида.

41. Способ по п.25, отличающийся тем, что протеин заменяет дефектный ген или частично снимает дефицит генного продукта.

42. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что терапевтическим генным продуктом является цитотоксический агент.

43. Композиция по п.42, отличающаяся тем, что цитотоксическим агентом является инактивирующий рибосому протеин.

44. Композиция по п.42, отличающаяся тем, что инактивирующим рибосому протеином является сапорин.

45. Нитевидные фаговые частицы, имеющие лиганд на своих поверхностях, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится в общих чертах к доставке генов и более конкретно к получению и использованию модифицированных лигандами бактериофагов для доставки генов, которые изменяют фенотип, функции, генную экспрессию, или жизнеспособность клеток с терапевтическими целями.

Предпосылки изобретения

В одном из подходов генная терапия предпринимает попытки делать клетки мишенью специфическим образом. Так терапевтический ген связывают каким-либо образом с направляющей молекулой для того, чтобы доставить ген в намеченную клетку или ткань. Современные методы обычно включают связывание направляющей молекулы, такой как лиганд или антитело, которое распознает интернализующий рецептор, либо с "голой" ДНК, либо с клеточным вирусом млекопитающего (например, аденовирусом), содержащим целевой ген. Если используют голую ДНК, ее следует конденсировать in vitro в компактную геометрическую форму для проникновения в клетку. Для нейтрализации заряда на ДНК и конденсации ее в тороидную структуру обычно используют поликатион, такой как полилизин. Однако такой процесс конденсации не совсем понятен, и его трудно контролировать, что делает приготовление гомогенных генных терапевтических лекарств крайне проблематичным.

Напротив, вирусы млекопитающих могут упаковывать ДНК в однородные частицы, но из-за их сложности они представляют сложности с точки зрения генетической манипуляции и получение вирусных частиц для доставки генов является дорогостоящей и длительной процедурой. Бактериофаги предлагают привлекательную альтернативу в качестве природного способа конденсации и упаковки терапевтических ДНК и благодаря их простоте они достаточно легко подвергаются генетическим манипуляциям (при сохранении функций). Более того, так как бактериофаг представляет чрезвычайно простой объект, крупномасштабное получение векторов на основе фагов для доставки генов окажется гораздо проще и дешевле, нежели получение, например, вирусных векторов млекопитающих.

Бактериофаг, такой как лямбда и нитевидный фаг, иногда использовали при попытках перенести ДНК в клетки млекопитающих. Вообще было обнаружено, что трансдукция лямбда является относительно редким актом и экспрессия репортерного гена слаба. В попытке повысить эффективность трансдукции были использованы способы, использующие фосфат кальция или липосомы (которые специфически не направлены на рецептор клеточной поверхности) используют в связи с лямбда. Перенос гена наблюдали за счет лямбда фага, используя соосаждение с фосфатом кальция (Ishiura, M. et al., Mol. Cell. Biol., 2:607-616, 1982), или за счет нитевидного фага, используя DEAE-декстран или липополиамин (Yokoyama-Kobayashi и Kato, Biochem. Biophys. Res. Comm. 192:935-939, 1993; Yokoyama-Kobayashi и Kato, Anal. Biochem. 223:130-134, 1994). Однако эти способы введения ДНК в клетки млекопитающих не практичны для применения в генной терапии, так как эффективность трансфекции имеет тенденцию быть слабой, неспецифичной, и такая трансфекция не только сложна, но и непредсказуема в отношении типа клеток. Необходимы более надежные средства для нацеливания векторов на специфические клетки (или рецепторы) и обеспечение гарантий степени терапевтической полезности доставки генов и их экспрессии, если бактериофаги необходимо оформить в векторы, пригодные для терапевтических применений.

Попытки направить нитевидный фаг к клеткам, используя слияние циклического RGD пептида и протеина оболочки фага или слияния пептид-оболочковый протеин имели ограниченный успех. Хотя фаги были нацелены и интернализованы, экспрессия гена фага не ожидалась и не была отмечена (Hart et al., J. Biol. Chem. 269:12468-12474, 1994; Barry et al., Nature Med. 2:299-305, 1996). Хотя обычно понятно, что RGD пептидная последовательность, используемая Hart с сотр. связывается с интегринами, Hart описывает осуществляемый за счет RGD захват фага как процесс, аналогичный захвату фагоцитом бактерии за счет протеина инвазина (RGD протеина); аденовирусы используют связывание RGD-инвазин в связи со связыванием лиганд-рецептор для интернализации. Поэтому неясно, что связывание RGD-интегрин облегчает проникновение пептида или слияние протеина за счет рецепторов опосредствованного эндосомального механизма, который, как было показано, обеспечивает превосходные результаты.

Так, для случаев применения доставки генов были бы весьма выгодны способы и терапевтические агенты, которые просты для получения и осуществления цели, эффективны и направляются к специфическим клеткам. Аналогично были бы необходимы векторы, которые доставляют терапевтически полезные количества представляющих интерес генов при различных способах введения, включая пероральные способы. Удовлетворяя эти давние нужды, в настоящем изобретении предложены композиции и способы доставки генов с использованием бактериофага, который экспрессирует лиганд и несет представляющий интерес ген, а также обеспечивает другие связанные с этим преимущества.

Краткое содержание изобретения

В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ доставки генов, включающий введение пациенту нитевидных фаговых частиц, представляющих лиганд на своей поверхности, где вектор внутри фага кодирует генный продукт под контролем промотора.

В родственных аспектах в изобретении предложены способы лечения опухолей, заболеваний клеток гладкой мускулатуры или ангиогенных заболеваний, включающие введение пациенту фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемый буфер и частицы нитевидного фага, представляющие лиганды на своих поверхностях, где геном фага кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.

В предпочтительном варианте лигандом является полипептид, реакционноспособный с FGF рецептором и в наиболее предпочтительном варианте лигандом служит FGF-2. В других вариантах лигандом является антитело и предпочтительно одноцепочечное антитело.

Лиганд может быть генетически слит с протеином фагового капсида или химически конъюгирован для образования ковалентного присоединения или присоединения методом "сэндвича". Обычно капсидным протеином для генного слияния является ген III или ген VIII.

В предпочтительном варианте эндосомальный фрагмент ускользания включен в лиганд или другим способом представлен на поверхности фагов. Этот лиганд или фаг могут также включать далее последовательность ядерной локализации.

В другом предпочтительном варианте фаговым геномом является фагемид.

В предпочтительных вариантах терапевтический генный продукт выбирают из группы, состоящей из протеина, рибозима и антисмыслового олигонуклеотида, а в других вариантах терапевтический генный продукт является цитотоксическим агентом (например протеином, инактивирующим рибосому, таким как сапорин), или является антителом, которое связывается с HER2/neu.

В других аспектах в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, включающая физиологически приемлемый буфер и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своих поверхностях, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора, и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своей поверхности, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидны со ссылкой на следующее подробное описание и прилагаемые чертежи. Кроме того, представленные далее различные ссылки, в которых более подробно описаны некоторые процедуры и композиции (например, плазмиды и т.д.), включены сюда полностью для ссылки.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1А и 1В схематически представляют фаговые векторы для трансдукции клеток млекопитающих. На фиг.1А представлен родительский фаговый вектор с дикого типа pIII оболочковым протеином. Основным вектором является М13 геном с геном устойчивости к ампициллину (Amp^R) и GFP экспрессионной кассетой, встроенной в интергенный участок между pIV и рII (MEGFP3). Вектор MEGFP3 содержит следующие элементы: ori-CMV, SV40 начало репликации и CMV промотор; EGFP, усиленный ген флуоресцирующего зеленым протеина; BGH, и последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста. Фиг.1В представляет FGF-pIII слияние, представляющее фаг (MF2/1G3).

Фиг.2 представляет график, демонстрирующий количество клеток, экспрессирующих флуоресцирующий зеленым протеин, когда FGF-фаг инкубирует с клетками в присутствии повышенного количества свободных FGF.

Фиг.3А и 3В представляют графики, демонстрирующие экспрессию репортерных генов GFP (3А) и Gal (3B) в целевых клетках как функцию титра фага.

Фиг. 4А-4D являются графическим представлением, демонстрирующим специфичность нацеливания FGF2.

Фиг. 5 представляет график, демонстрирующий количество FGF позитивных клеток, образующихся после инкубирования структур полилизин+фаг или FGF-полилизин+фаг.

Фиг. 6 представляет сканированное изображение результатов Вестернблоттинга, представляющего определение протеина слияния FGF2-pIII в протеиновых экстрактах из очищенного FGF2-фага (FGF2-MEGFP).

Фиг.7А и 7В представляют графики в виде прямоугольников определения FGF2 на FGF2-фаге методом ELISA. Фиг.7А представляет количество фагового протеина, определенное с использованием как пустого вектора MEGFP3, так и конструкции слияния FGF2 (FGF2-MEGFP). Фиг.7В представляет количество FGF2, определенное на фаге, содержащем конструкцию слияния.

Фиг. 8А и 8В представляют графики в виде прямоугольников, представляющие трансдукцию COS клеток FGF2-фагом.

Фиг. 9А и 9В представляют изображение, полученное с помощью флуоресцентной микроскопии, стабильных трансфектантов, экспрессирующих репортерный ген GFP.

Подробное описание изобретения

Как было указано ранее, настоящее изобретение в основном относится к способам доставки терапевтических агентов к целевым клеткам и тканям сайт-специфическим образом и к конструкциям, пригодным для таких применений. Одним из применений раскрытого изобретения является терапия с использованием замещения или усиления гена. Проще говоря, описанные здесь векторы и способы можно использовать для лечения индивидуумов, ткани которых лишены способности продуцировать достаточные количества некоторых важных молекул и соединений, например необходимых ферментов. Другим применением настоящего изобретения является использование способности описанных здесь векторов нацеливать клетки с повышенной специфичностью, что делает такие векторы идеальными для лечения различных опухолей и других злокачественных образований.

Как здесь подробно описано, предпочтительные векторы для использования для целевой доставки терапевтических агентов включают нитевидные фаговые частицы, экспрессирующие один или более из предварительно отобранных лигандов на поверхности вирусных частиц независимо от способа каким прикреплены лиганды. Поэтому независимо от того, прикреплены ли лиганды за счет ковалентной связи, или за счет протеина слияния, целевые фаговые векторы настоящего изобретения способны доставить терапевтические нуклеотидные последовательности к целевым клеткам.

Нитевидные фаговые частицы являются особенно полезными векторами, как здесь раскрыто, частично из-за того, что они не имеют нативного тропизма у млекопитающих. Поэтому существует необходимость снятия нативного тропизма у фагового вектора для того, чтобы сделать его полезным для терапевтических применений, что необходимо для чаще используемых ретровирусных векторов. Векторы на основе фагов настоящего изобретения также обладают целым рядом преимуществ, включая, например, способность принимать крупные объекты; способность точно достигать специфические клеточные рецепторы, не повреждая здоровые клетки; и способность доставлять терапевтические нуклеотидные последовательности к ядрам целевых клеток, усиливая тем самым экспрессию терапевтических последовательностей в целевых клетках.

Вышеуказанные характеристики и другие, которые будут раскрыты более подробно далее, делают описываемые здесь векторы особенно привлекательными для применений в генной терапии, так как их легко можно сконструировать для упаковки, транспорта и доставки выбранных экспрессируемых генов в клетки, ткани или органы пациента, нуждающегося в лечении. Как было указано ранее, раскрытые здесь векторы и способы особенно подходят для лечения болезненных состояний, которые не поддаются более "обычному" терапевтическому лечению.

I. БАКТЕРИОФАГ

А. Нитевидные бактериофаги

Нитевидные фаги охватывают группу бактериофагов, которые способны инфицировать различные грам-отрицательные бактерии за счет взаимодействия с концом F пилуса. Хорошо известные нитевидные фаги включают М13, f1 и fd.

Геномы этих фагов представляют одноцепочечные ДНК, но реплицируются через двухцепочечную форму. Фаговые частицы собраны в бактериях и выделяются в среду. Так как бактерии продолжают расти и делиться, хотя и с меньшей скоростью, чем неинфицированные клетки, титры фагов достигают относительно высоких значений. Более того, на репликацию и сборку, по-видимому, не влияет размер генома. Благодаря своему строению и жизненному циклу нитевидные фаги стали ценным дополнением к арсеналу инструментов молекулярной биологии.

Дальнейшее развитие нитевидных фаговых систем привело к разработке клонирующих векторов, называемых фагемидами, которые объединяют отличительные особенности плазмид и фагов. Фагемиды содержат начало репликации и сигнал упаковки нитевидного фага так, же, как начало репликации плазмид. Обычно присутствуют также и другие элементы, применяемые для клонирования и/или экспрессии молекул чужеродной нуклеиновой кислоты. Такие элементы включают, без ограничения, селектируемые гены, сайт множественного клонирования, праймерные последовательности. Фагемиды могут быть реплицированы как и для других плазмид, и могут быть упакованы в фаговые частицы после освобождения хелперным нитевидным фагом. В том смысле, как здесь использован, термин "нитевидные фаговые частицы" относится к частицам, содержащим либо фаговый геном, либо фагемидный геном. Эти частицы могут содержать другие молекулы в добавление к нитевидным капсидным протеинам.

Нитевидные фаги были разработаны как системы для представления протеинов и пептидов на поверхности фаговых частиц. Путем встраивания молекул нуклеиновой кислоты в гены для фаговых капсидных протеинов получают протеины слияния, которые собраны в капсид (Smith, Science 228:1315, 1985; патент США 5223409). В результате чужеродный протеин или пептид оказывается на поверхности фаговой частицы. Способы и методики для представления фага хорошо известны специалистам (см. также Кау et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, 1996).

В. Векторы

Нитевидные фаговые векторы обычно подразделяют на две категории: фаговый геном и фагемиды. Каждый тип вектора можно использовать в контексте настоящего изобретения, предпочтительно использовать фаговые геномные векторы. Доступны многие такие коммерческие векторы. Например, можно использовать серии pEGFP векторов (Clontech; Palo Alto, СА), Ml3mp векторы (Pharmacia Biotech, Sweden), pCANTAB 5E (Pharmacia Biotech), pBluescript серии (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) и многие другие. Одним из наиболее подходящих коммерческих векторов является pEGFP-N1, который содержит флуоресцирующий зеленым протеин (GFP) под контролем CMV предраннего промотора. Эта плазмида включает также SV40 начало репликации для усиления генной экспрессии за счет обеспечения репликации плазмиды с большим числом копий в клетках, которые вырабатывают SV40 Т антиген.

Другие векторы разработаны учеными (см. например. Smith, в Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors и their Uses, Rodriquez и Denhardt, eds. , Butterworth, Boston, с. 61-84, 1988), или могут быть сконструированы с использованием стандартных способов (Sarabrook et al., Molecular Biology: A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing, NY, 1995) в соответствии с обсуждаемыми далее принципами.

Для использования в настоящем изобретении вектор, как минимум, должен принять кассету, содержащую промотор и терапевтический ген (трансген) в функциональной связи. Можно использовать любой промотор, который активен в клетках, которые необходимо трансфектировать. Этот вектор должен также содержать начало репликации фага и сигнал упаковки для сборки векторной ДНК с капсидными протеинами.

В конструкцию могут быть также включены другие элементы. В предпочтительных вариантах конструкция включает последовательность терминации транскрипции, включая последовательность полиаденилирования, сайты сплайсинга донора и акцептора и энхансер. Могут быть также использованы другие элементы, применимые для экспрессии и сохранения конструкции в клетках млекопитающих или в других эукариотных клетках (например, начало репликации). Так как эти конструкции удобно получать в бактериальных клетках, в них включают элементы, которые необходимы или усиливают размножение в бактериях. Такие элементы включают начало репликации, селектируемый маркер и т.п. (см. обсуждение далее).

Промотор, который контролирует экспрессию трансгена, должен быть активным или активируемым в целевой клетке. В рамках настоящего изобретения целевой клеткой может быть клетка млекопитающего, птицы, растения и т.п. Большая часть применений настоящего изобретения включает трансфекцию клеток млекопитающих, включая человека, собак, кошек, лошадей и т.п. Выбор промотора будет зависеть частично от типа целевой клетки и степени или типа необходимого контроля. Промоторы, которые являются подходящими в контексте настоящего изобретения, включают, но ими не ограничиваются, конститутивные, индуцируемые, ткане-специфические, специфические в отношении типа клеток, временно-специфические или событийно-специфические.

Примеры конститутивных или неспецифических промоторов включают SV40 ранний промотор (патент США 5118627), SV40 поздний промотор (патент США 5118627), CMV ранний генный промотор (патент США 5168062), промотор вируса бычьей папилломы, и промотор аденовируса. В добавлении к вирусным промоторам в контексте настоящего изобретения применимы также клеточные промоторы. В частности полезны клеточные промоторы для так называемых генов "домашнего хозяйства" (например, -актин). Вирусные промоторы обычно являются более сильными промоторами, нежели клеточные промоторы.

Ткане-специфические промоторы особенно подходят для экспрессии в эндотелиальных клетках. Используя один из этого класса промоторов, можно достичь дополнительной степени специфичности. Например, эндотелиально-специфические промоторы особенно полезны в отношении пролиферативных заболеваний, включающих эндотелиальные клетки. Примеры ткане-специфических или клетко-специфических промоторов включают промоторы, специфические в отношении лимфоидных и фибробластных клеток, специфические в отношении печени, почек, гепатоцит-специфические и т.п.

Можно также использовать индуцируемые промоторы. Эти промоторы включают MMTV LTR (РСТ WO 91/13160), индуцируемый дексаметазоном, металлотионеин, индуцируемый тяжелыми металлами, и промоторы с элементами, реагирующими на сАМР, промоторы, индуцируемые сАМР термошоком. Используя индуцируемые промоторы, в клетку можно доставить нуклеиновую кислоту, и она будет оставаться неактивной до добавления индуктора. Это позволяет осуществлять дальнейший контроль за временем продуцирования генного продукта.

Событийного типа специфические промоторы являются активными или усиливающими регуляцию только после этого события, такие как опухолегеничность, или инфицирование вирусом. HIV LTR является хорошо известным событийно-специфическим промотором. Этот промотор является неактивным, если только не присутствует tat генный продукт, что происходит после инфицирования вирусом. Некоторые событийного типа промоторы являются также ткане-специфическими.

Кроме того, можно использовать промоторы, которые согласованно регулируются с конкретным клеточным геном. Например, можно использовать промоторы генов, которые согласованно экспрессируются, когда экспрессируется конкретный FGF рецепторный ген. Затем нуклеиновая кислота будет транскрибирована, когда экспрессируется FGF рецептор, такой как FGFR1, а не тогда, когда экспрессируется FGFR2. Такой тип промотора особенно полезен, если известна схема FGF рецепторной экспрессии в конкретной ткани, так что специфические клетки в этой ткани могут быть убиты после транскрипции гена цитотоксического агента, причем не будут затронуты окружающие ткани.

Примеры промоторов, здесь обсуждающихся, включают промоторы для альфафетопротеина, альфа-актин, мио D, карциноэмбрионный антиген VEGF-рецептор (GenBank регистрационный Х89776); FGF рецептор; ТЕК или tie 2 (GenBank регистрационный L06139); tie (GenBank регистрационные Х60954; S89716); рецептор урокиназы (GenBank регистрационный S78532); Е- и Р-селектины (GenBank регистрационные М64485; L01874); VCAM-1 (GenBank регистрационный M92431): эндоглин (GenBank регистрационный HSENDOG): эндосиалин (Rettig et al., PNAS 89: 10832, 1992); альфа V-бета3 интегрин (Villa-Garcia et al., Blood 3:668, 1994; Donahue et al., BBA 1219:228, 1994); эндотелин-1 (GenBank регистрационные M25377; J04819; J05489); ICAM-3 (GenBank регистрационный S50015); E9 антиген (Wang et al., Int. J. Cancer 54:363, 1993); фактор von Willebrand (GenBank регистрационный HUMVWEI; HUMVWFA); CD44 (GenBank регистрационный HUMCD44B); CD40 (GenBank регистрационный HACD40L; HSCD405FR); сосудисто-эндотелиальный кадхерин (Martin-Padura et al., J.Pathol. 175:51, 1995); notch 4 (Uyttendaele et al., Development 122:2251, 1996), связанный с меланомой высокомолекулярный антиген; специфический антиген-1 простаты, пробазин, FGF рецептор, VEGF рецептор, erb B2; erb B3; erb B4; MUC-1; HSP-27; int-1; int-2, CEA, HBEGF рецептор; EGF рецептор; тирозиназа, MAGE, IL-2, IL-2 рецептор; фосфатаза простатовой кислоты, пробастин, специфический мембранный антиген простаты, альфа-кристаллин, EGFR, PDGF рецептор, рецептор интегрина, -актин, SM1 и SM2 тяжелые цепи миозина, калпонин-h1, SM22 альфа рецептор ангиотензина, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, тяжелая цепь иммуноглобулина, легкая цепь иммуноглобулина, CD4, и т.п. применимы в контексте настоящего изобретения.

В дополнении к промотору можно встроить репрессорные последовательности, негативные регуляторы или ткане-специфические сайленсеры для уменьшения неспецифической экспрессии цитоцидов или пролекарств. Множественные репрессорные элементы можно встроить в промоторный участок. Репрессия транскрипции не зависит от ориентации репрессорных элементов или расстояния от промотора. Одним из типов репрессорных последовательностей является изоляторная последовательность. Такие последовательности ингибируют транскрипцию (Dunaway et al. , Mol. Cell. Biol 17: 182-9, 1997; Gdula et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA PJ:9378-83, 1996, Chan et al., J. Virol 70:5312-28, 1996; Scott и Geyer. EMBOJ 14:6258-67, 1995; Kalos и Fournier, Mol. Cell. Biol 15:198-207, 1995; Chung et al., Cell 74:505-14, 1993) и будут подавлять фоновую транскрипцию.

Негативные регуляторные элементы были охарактеризованы в промоторных участках ряда различных генов. Функции репрессорных элементов как репрессоров транскрипции в отсутствии факторов, таких как стероиды, подобны NSE в промоторном участке гена овальбумина (Haecker et al., Mol. Endocrinology 9: 1113-1126, 1995). Эти негативные регуляторные элементы связывают специфические протеиновые комплексы из фаллопиевых труб, ни один из которых не чувствителен к стероидам. Три различные элемента расположены в промоторе гена овальбумина. Олигонуклеотиды, соответствующие участку этих элементов, подавляют вирусную транскрипцию ТК репортера. Один из сайленсерных элементов разделяет идентичность последовательности с сайленсерами в других генах (TCTCTCCNA).

Репрессорные элементы были также идентифицированы в промоторном участке гена коллагена II. Исследования задержки в геле показали, что ядерные факторы из HeLa клеток связываются специфически с ДНК фрагментами, содержащими сайленсерный участок, тогда как экстракты ядер хондроцитов не демонстрируют какой-либо связывающей активности (Savanger et al., J.Biol. Chem. 265 (12): 6669-6674, 1990). Было также показано, что репрессорные элементы регулируют транскрипцию в гене карбамоил-фосфат синтетазы (Goping et al., Nucleic Acid Research 23(10): 1717-1721, 1995). Этот ген экспрессируется только в двух различных типах клеток, гепатоцитах и эпителиальных клетках слизистой оболочки кишечника. Негативные регуляторные участки были также идентифицированы в промоторном участке гена холинацетил-трансферазы, промоторе альбумина (Нu et al. , J.Cell Growth Differ. 3(9):577-588, 1992), промоторе гена фосфоглицерат-киназы (PGK-2) (Misuno et al., Gene 119(2):293-297, 1992), и в гене 6-фосфофрукто-2-киназа/фруктозо-2,6-бисфосфатазы, где негативный регуляторный элемент ингибирует транскрипцию в непеченочных клеточных линиях (Lemaigre et al., Mol. Cell Biol. 11(2):1099-1106). Кроме того, был идентифицирован негативный регуляторный элемент Тsе-1 в ряде печень-специфических генов, включая тирозинамино-трансферазу (ТАТ). Экспрессия ТАТ гена специфична и индуцируется как глюкокортикоидными, так и сАМР сигнальными путями. Было показано, что сАМР реагирующий элемент (CRE) является мишенью для репрессии за счет Тsе-1 гепатоцит-специфических элементов (Boshart et al., Cell 61(5):905-916, 1990).

В предпочтительных вариантах элементы, которые усиливают экспрессию целевого продукта, включены в конструкцию. Такие элементы включают внутренние рибосомные связывающие сайты (IRES; Wang и Siddiqui, Curr. Top. Microbiol. Iminunol 203: 99, 1995; Ehrenfeid и Semler, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203:65, 1995; Rees et al., Biotechniques 20:102, 1996, Sugimoto et al., Biotechnology 12: 694, 1994). IRES повышает эффективность трансляции. Другие последовательности также могут усилить экспрессию. Для некоторых генов, последовательности, особенно с 5" конца, ингибируют транскрипцию и/или трансляцию. Эти последовательности обычно являются палиндромами, которые могут образовывать структуры в виде шпилек. Любые такие последовательности в нуклеиновой кислоте, которую необходимо доставить, обычно исключают. Уровни экспрессии продуктов транскрипции или трансляции анализируют для подтверждения или определения того, какие последовательности влияют на экспрессию. Уровни транскрипции можно определить любым известным способом, включая Нозернблоттинг гибридизацию, защиту РНКазы с помощью зонда и т.п. Уровни протеинов можно определить любым известным способом, включая ELISA.

В предпочтительных вариантах фаг имеет начало репликации, подходящий для трансфектированных клеток. Можно использовать системы репликации вирусов, такие как EBV ori и ENBA ген, SV40 ori и Т антиген, или BPV ori. Другие системы репликации млекопитающих могут быть взаимозаменяемы. А также гены репликации могут привести к большому числу копий. Экспрессия терапевтических генов из фагового генома может быть усилена за счет увеличения числа копий генома фага. В одном из способов используют SV40 начало репликации в присутствии SV40 Т антигена, для того чтобы вызвать получение нескольких сотен тысяч копий. Ген Т антигена может уже присутствовать в клетках, интродуцированный отдельно или индуцированный в геноме фага под транскрипционным контролем подходящего клеточного промотора. Можно также использовать другие системы репликации вирусов для увеличения числа копий, такие как начало EBV и EBNA.

В других предпочтительных вариантах пептиды или другие фрагменты, которые позволяют или стимулируют "ускользание" векторов (и любой молекулы, к ним присоединенной или в них заключенной) из эндосомы, включены и экспрессированы на поверхности бактериофага. Такие "другие фрагменты" включают молекулы, которые сами не являются пептидами, но которые обладают способностью разрушать эндосомальные мембраны, тем самым облегчая "ускользание" вектора и молекул, которые в противном случае имитируют эндосомальные свойства "ускользания" описанных здесь пептидных последовательностей (см. например, опубликованную РСТ публикацию WO 96/10038 и Wagner et al., PNAS 89:7934-7938, 1992, раскрытие которых включено сюда в качестве ссылки).

Пептидные последовательности, которые придают способность "ускользания" из эндосомы, наиболее предпочтительны. Такие последовательности хорошо известны и могут быть легко слиты ковалентно или генетически с оболочковым протеином, таким как ген III или ген VIII нитевидного фага. Хотя слияние одной или более из пептидных последовательностей с оболочковым протеином описывается здесь как предпочтительный вариант, следует понимать, что другие способы присоединения (и другие фрагменты кроме пептидов) могут быть использованы, как здесь раскрыто.

Так, пример двоякого представления нитевидного фага представляет лиганд (например, FGF) как слияние с геном III и эндосомальный пептид ускользания, слитый с геном VIII. Локализации лиганды и последовательностей ускользания являются взаимозаменяемыми и более того, могут находиться в одном и том же слитом протеине. Последовательности ускользания, которые пригодны, включают, без ограничений, следующие примеры последовательностей: пептид экзотоксина Pseudomonas (Donnelley, J. J., et al., PNAS. 90, 3530-3534, 1993); пептиды гриппа, такие как НА пептид и пептиды, из него полученные, такие как пептид FP13; слитогенный пептид Sendal Virus; слитогенная последовательность из HIV gр1 протеина; Paradaxin слитогенный пептид; и Melittin слитогенный пептид (см. опубликованную РСТ публикацию WO 96/41606, раскрытие которой включено сюда в качестве ссылки). Примерами двух других эндосоморазрушающих пептидов, иногда называемых слитогенными пептидами, являются:

GLFEAIEGFIENGWEGMIDGGGC (SEQ. ID 1) и

GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC (SEQ. ID 2).

Другие пептиды, пригодные для разрушения эндосом, можно определить с помощью различных общих характеристик. Например, эндосоморазрушающие пептиды обычно имеют длину в 25-30 остатков, содержат чередующиеся гидрофобные домены и кислотные домены, и при низких значениях рН (например, рН 5) образуют амфифатические -спирали. Эндосоморазрушающий пептид может присутствовать в виде единичной копии или в виде множества копий как с N-, так и с С-конца лиганда.

Пептиды ускользания можно также отобрать, используя стратегию молекулярной эволюции. Короче, в одном из подходов конструируют библиотеку случайных пептидов в протеине гена VIII фагового вектора, у которого имеется лиганд, который слит с геном III и который несет детектируемый (например, GFP) или селектируемый маркер (например, устойчивости к лекарству). Клетки млекопитающих инфицируют этой библиотекой и клетки отбирают по выявляемому маркеру. Клетки, которые имеют наиболее эффективную эндосомальную последовательность ускользания, должны отличаться наивысшей экспрессией или наибольшей устойчивостью. Множество циклов селекции можно осуществить для уменьшения сложности генов, кодирующих выделенные пептиды. Гены пептидов выделяют, конструируют в фаговые векторы.

Кроме того, или в качестве альтернативы, мембраноразрушающие пептиды можно включить в комплексы. Так например, как известно, аденовирусы усиливают разрушение эндосом. Не содержащие вирусов протеины, такие как гемагглютинин НА-2 вируса гриппа, также разрушают эндосомы и могут быть использованы в настоящем изобретении. Другие протеины можно протестировать в анализах, раскрытых здесь, с целью обнаружения специфических эндосоморазрушающих агентов, которые увеличивают доставку генов. Обычно эти протеины и пептиды являются амфифатичными (см. Wagner et al., Adv. Drug Del. Rev. 14:113-135, 1994).

Другой последовательностью, которую можно включить в вектор, является последовательность, которая облегчает доставку протеинов в ядро. Для усиления экспрессии предпочтительно, чтобы терапевтическая нуклеотидная последовательность была направлена в ядро. Эти так называемая ядерная транслокация или ядерные локализующие последовательности (NLS) обычно содержат много положительно заряженных аминокислот. Так как карбоксильные концы протеина гена VIII нитевидных фагов уже несут на себе положительный заряд, увеличение заряда и вероятность ядерного переноса можно увеличить путем слияния известных NLS последовательностей клеток млекопитающих с протеином гена VIII. NLS слияние с оболочковыми протеинами нитевидных фагов могут быть замещены. NLS можно слить с капсидным протеином, отлично от слияния лиганд/капсид.

Примеры NLS последовательностей включают те, которые напоминают короткие основные NLS SV40 Т антигена, состоящие из двух частей NLS нуклеоплазмина; рибонуклеопротеиновую последовательность A1; маленькую ядерную рибонуклеопротеиновую последовательность UA1 и протеин вируса-1 Tax Т-лимфоцита человека. Другие полезные NLS последовательности включают NLS HIV матричного протеина и компоненты ядерной транслокации importain/hSRPI и Ran/TC4; консенсусную последовательность КХХ (K/R), фланкированную Pro или А1а; последовательность ядерной транслокации нуклеоплазмина; или NLS из antennapedia (см. WO 96/41606).

В некоторых случаях пептиды, конденсирующие нуклеиновую кислоту, связаны с неосновными последовательностями ядерной локализации, функция которых состоит в транспорте нуклеопротеина. Примеры таких последовательностей включают нуклеопротеин гриппа и протеин HIV MA. Другие полезные NLS включают hnRNP A1 протеин, протеин, который транспортирует комплексы рибонуклеопротеинов. Другой полезный NLS включен в пептиды, такие как NBC1 и NBC2, функция которых состоит в конденсации нуклеиновой кислоты (см. WO 96/41606). Таким образом, в настоящем изобретении предложено использование указанных выше последовательностей, а также и других, раскрытых здесь.

Библиотеку последовательностей случайных пептидов можно скринировать в поисках новых последовательностей, которые стимулируют ядерную транслокацию. Короче, в одном из таких способов библиотеку случайных пептидных генов гибридизуют с генами нитевидных фагов VIII, VII и IX и скринируют в поисках эффективной ядерной транслокации, анализируя инфицированные клетки в отношении экспрессии репортерного гена или осуществляя селекцию с помощью лекарств.

Могут быть включены дополнительные факторы, которые усиливают экспрессию трансгена. Такие факторы можно идентифицировать способом, в котором последовательности сливают с протеинами оболочки фага и осуществляют селекцию фага на основании эффективной экспрессии репортерного гена. Известные ДНК репарационные ферменты или полимеразы из клеток млекопитающих, или одноцепочечные ДНК вирусы представляют собой возможные последовательности.

Конструируют фаг, который представляет лиганд как результат слияния с фаговым оболочковым протеином, таким образом, чтобы они содержали соответствующие кодирующие участки. Обычно для нитевидных фагов используют гены III и VIII. Другие капсидные протеины могут служить заменой. Методики для встраивания кодирующей лиганд последовательности в ген фага хорошо известны (см. например, Sambrook et al., выше; Ausubel et al., выше).

В некоторых вариантах размножение или стабильное сохранение такой конструкции может оказаться желательным, или может быть необходимым для достижения достаточного количества или достаточной концентрации генного продукта для эффективной генной терапии. Примеры реплицирующих и стабильных источников репликации эукариотного происхождения известны.

II. ЛИГАНДЫ

В том смысле, как здесь использован, термин "лиганд" относится к любому пептиду, полипептиду, протеину или не протеину, такому, как пептидомиметин, который способен связываться с молекулой на поверхности клетки и интернализоваться. Интернализация по эндосомальному пути является предпочтительным способом проникновения. В том смысле, как здесь использован, термин "связываться с рецептором" относится к способности лиганда специфически распознавать и детектируемо связываться с рецептором, о чем свидетельствуют стандартные in vitro анализы.

В контексте настоящего изобретения лиганд конъюгирован с протеином бактериофага либо как протеин слияния, либо за счет химической конъюгации, и используется для доставки объекта с нуклеиновой кислотой (т.е. терапевтического гена) в клетку. Известно множество молекул, которые связываются со специфическим рецептором и интернализуются обычно за счет эндосом. Другими молекулам могут служить антитела и производные антител. Кроме того, предложены способы селекции других лигандов, которые удовлетворяют изложенным свыше критериям.

В рамках настоящего изобретения можно использовать фрагменты этих лигандов, если только такие фрагменты сохраняют способность связываться с соответствующей молекулой клеточной поверхности. Аналогично, можно использовать лиганды с замещениями или другими изменениями, при которых сохраняется связывающая способность. Также термин лиганд относится к полипептиду (полипептидам) с аминокислотной последовательностью нативного лиганда так же, как и к модифицированным последовательностям (например, содержащим аминокислотные замещения, делеции, вставки или дополнения по сравнению с нативным протеином), до тех пор, пока такой лиганд сохраняет способность связываться с его рецептором на эндотелиальной клетке и может быть интернализован.

Лиганды также охватывают мутеины, которые обладают способностью связываться с клетками, экспрессирующими их рецептор, и могут быть интернализованы. Такие мутеины включают (но ими не ограничиваются) те, которые получены в результате замены одного или более цистеино серином, как здесь раскрыто. Обычно такие мутеины содержат замены консервативных аминокислот. ДНК, кодирующая такие мутеины, будет, если только не модифицирована заменой дегенеративных кодонов, гибридизоваться, по крайней мере в мягких условиях, с нативной ДНК последовательностью, кодирующей лиганд дикого типа.

ДНК, кодирующую лиганд, можно получить синтетически на основании известной аминокислотной или ДНК последовательности, выделить, используя известные специалистам способы (например, ПЦР амплификацией), или получить из коммерческих или других источников. ДНК, кодирующая лиганд, может отличаться от указанных выше последовательностей замещением дегенеративных кодонов или тем, что кодирует отличающиеся аминокислоты. Различия в аминокислотных последовательностях, такие как наблюдающиеся среди гомологичных лигандов различных видов, а также среди отдельных организмов или видов, допустимы в тех случаях, если этот лиганд связывается со своим рецептором. Лиганды можно выделить из природных источников или получить синтетически, например в результате химического синтеза или с использованием рекомбинантных методик.

В контексте настоящего изобретения нет необходимости в том, чтобы лиганды сохраняли какие-либо свои in vitro биологические активности помимо способности связываться с рецептором на клетке и способности к интернализации. Однако в некоторых контекстах может оказаться желательным, чтобы лиганд проявлял некоторые из своих биологических активностей. Например, если в качестве носителя для ДНК, кодирующей молекулу, пригодную для лечения ран, используют VEGF, желательно, чтобы VEGF проявлял активность в отношении проницаемости сосудов и в отношении стимулирования миграции фибробластов и ангиогенеза. В этих примерах FGF мутеины с пониженной митогенной активностью были сконструированы в результате сайт-направленного мутагенеза. Не митогенные протеины, или протеины с пониженной митогенной активностью также можно сконструировать путем обмена рецептор-связывающего домена с рецептор-связывающим доменом родственного протеина. Например, домен FGF2 можно заменить рецептор-связывающим доменом FGF7 для создания FGF, который не вызывает пролиферации и может изменить характер связывания. Если лиганд модифицирован таким образом, что в нем отсутствует одна или более из биологических активностей, связывание и интернализацию все еще можно анализировать с помощью любого из следующих тестов или других эквивалентных тестов. Обычно эти тесты включают введение метки в лиганд, инкубирование его с целевыми клетками и визуализацию или количественное определение внутриклеточных меток. Например, в лиганд можно ввести флуоресцентную метку FITC или радиометку ¹²⁵I, инкубированную с клетками, и определить интернализацию микроскопически с помощью флуоресцентного микроскопа или конфокального микроскопа. Из содержания настоящего изобретения будет ясно, какую именно из биологических активностей желательно сохранить.

А. Протеины, которые связываются с клетками и интернализуются

Лиганды можно получить рекомбинантными или другими способами получения для присоединения к фаговым капсидным протеинам. ДНК последовательности и способы получения последовательностей этих лигандов хорошо известны (см. GenBank). На основании ДНК последовательностей гены можно синтезировать либо синтетически (для маленьких протеинов) амплифицировать из клеточных геномных или кДНК, выделить из геномных или кДНК библиотек, и т.п. Для облегчения клонирования в фаговый или фагемидный вектор можно включить рестрикционные сайты, например в праймеры для амплификации.

Такие молекулы включают (но ими не ограничиваются) протеины, которые связывают раковые клетки, эндотелиальные клетки, клетки сердечно-сосудистой системы, клетки глаза и т.п. Такие лиганды включают факторы роста и цитокины. Многие факторы роста и семейства факторов роста разделяют структурные и функциональные свойства и могут быть использованы в настоящем изобретении. Семейства факторов роста включают факторы роста фибробластов FGF-1 до FGF-15 и факторы роста эндотелия сосудов (VEGF). В рамках настоящего изобретения могут быть использованы другие факторы роста, такие как PDGF (фактор роста, полученный из тромбоцита), TGF- (трансформирующий фактор роста), TGF-, HB-EGF, ангиотензин, бомбезис, эритопоэтин, фактор стволовых клеток, M-CSF, G-CSF, GM-CSF и эндоглин, также связывающиеся со специфическими идентифицированными рецепторами на поверхности клеток. Цитокины, включая интерлейкины, CSFs (колониестимулирующие факторы) и интерфероны, имеют специфические рецепторы и могут быть использованы, как здесь описано.

Например, лиганды и пары лиганд/рецептор включают урокиназа/урокиназа рецептор (GenBank регистрационный Х02760/Х74309); (-1,3-фукозилтрансферазу, 1-антитрипсин/Е-селектин (GenBank регистрационные М98825, D38257/M87862); лиганд гликопротеина Р-селектина, лиганд Р-селектина/Р-селектин (GenBank регистрационный U25955, U02297/L23088), VCAM1/VLA-4 (GenBank регистрационный Х53051/Х16983); Е9 антиген (Blann et al., Atherosclerosis 120:221, 1996)/TGF рецептор; фибронектин (GenBank регистрационный Х02761); тип I 1-коллагена (GenBank регистрационный Z74615), тип I 2-коллагена (GenBank регистрационный Z74616), гиалуроновая кислота/CD44 (GenBank регистрационный М59040); CD40 лиганд (GenBank регистрационный L07414)/CD40 (GenBank регистрационный М83312); EFL-3, LERTK-2 лиганды (GenBank регистрационный L37361, U09304) для elk-1 (GenBank регистрационный М25269); VE-кадхерин (GenBank регистрационный Х79981); лиганд для катенинов; ICAM-3 (GenBank регистрационный Х69819) лиганд для LFА-1, и фактор von Willebrand (GenBank регистрационный Х04385), фиброноген и фибронектин (GenBank регистрационный Х92461), лиганды для _v3 интегрина (GenBank регистрационный U07375, L28832).

Другие лиганды включают CSF-1 (GenBank регистрационный М11038, М37435); GM-CSF (GenBank регистрационный X03021); IFN- (интерферон) (GenBank регистрационный А02076; WO 8502862-A); IFN- (GenBank регистрационный А02137; WO 8502624-A); IL-1- (интерлейкин 1 альфа) (GenBank регистрационный Х02531, М15329); IL-1- (интерлейкин 1 бета) (GenBank регистрационный Х02532, М15330, М15840); IL-1 (GenBank регистрационный K02770, M54933, M38756); IL-2 (GenBank регистрационный A14844, A21785, X00695, X00200, X00201, X00202); IL-3 (GenBank регистрационный M14743, M20137); IL-4 (GenBank регистрационный М13982); IL-5 (GenBank регистрационный X04688, J03478); IL-6 (GenBank регистрационный Y00081, X04602, M54894, M38669, M14584); IL-7 (GenBank регистрационный J04156); IL-8 (GenBank регистрационный Z11686); IL-10 (GenBank регистрационный X78437, M57627); IL-11 (GenBank регистрационный M57765, M37006); IL-13 (GenBank регистрационный Х69079, U10307); TNF- (фактор некроза опухоли) (GenBank регистрационный А21522); TNF- (GenBank регистрационный D12614); и GP30 лиганд (S68256) для erbB2.

Дополнительно другие лиганды включают PDGF (GenBank регистрационный Х03795, Х02811), ангиотензин (GenBank регистрационный К02215), и все RGD-содержащие пептиды и протеины, такие как ICAM-1 (GenBank регистрационный Х06990) и VCAM-1 (GenBank регистрационный Х53051), которые связываются с рецепторами интегрина. Другие лиганды включают TNF(GenBank регистрационный А21522, Х01394), IFN- (GenBank регистрационный А11033, А11034), IGF-I (GenBank регистрационный

А29117, Х56773, S61841, Х56774, S61860), IGF-II (GenBank регистрационный A00738, X06159, Y00693), атриальный природный пептид (GenBank регистрационный Х54669), эндотелин-1-(GenBank регистрационный Y00749), фактор коагуляции Ха (GenBank регистрационные L00395, L00396, L29433, N00045, М14327), TGF-1 (GenBank регистрационный А23751), IL-1 (GenBank регистрационный Х03833), IL-I (GenBank регистрационный M15330) и эндоглин (GenBank регистрационный Х72012).

Семейство FGF протеинов в настоящее время включает FGF-I (кислотный FGF или aFGF), FGF-2 (основной FGF или bFGF), FGF-3 (int-2), FGF-4 (hst-1/K-FGF), FGF-5, FGF-6 (hst-2), FGF-7 (фактор роста кератиноцитов или KGF), FGF-8, FGF-9, FGF-11 (WO 96/39507), FGF-13 (WO 96/39508), FGF-14 (WO 96/39506), и FGF-15 (WO 96/39509). Для целей настоящего изобретения можно использовать другие полипептиды, которые реакционноспособны в отношении FGF рецептора, то есть любые полипептиды, которые специфически взаимодействуют с FGF рецептором, предпочтительно с большим сродством к FGF рецептору, и переносятся через эндосомы в клетку за счет их взаимодействия с FGF рецептором.

В. Антитела к рецепторам, которые интернализуются

Антитела к молекулам, которые экспрессированы на поверхности клеток, полезны в контексте настоящего изобретения до тех пор, пока эти антитела могут интернализоваться после связывания. Такие антитела включают (но ими не ограничиваются) антитела к FGF рецепторам, VEGF рецепторы, рецептор урокиназы, Е- и Р-селектины, VCAM-1, PDGF рецептор, TGF рецептор, эндосиалин, _v3 интегрин, LFA-1, E9 антиген, CD40, кадхерин и elk-1. Антитела, которые специфичны к молекулам клеточной поверхности, экспрессируемым клетками, легко получить как моноклональные или поликлональные антисыворотки. Многие такие антитела доступны (например, из American Type Culture Collection, Rockville, MD). В другом варианте можно также использовать антитела к лигандам, которые связываются/интернализуются. При таком подходе фаговые частицы должны иметь антитела на их поверхности, которые затем образуют комплексы с лигандом (см. обсуждение далее).

В контексте настоящего изобретения термин антитела, включает моноклональные антитела, поликлональные антитела, антиидиотипические антитела, фрагменты антител (например Fab, и F(ab")₂, F_v вариабельные участки или гипервариабельные участки. Антитела обычно рассматривают как специфические против индолицидиновых аналогов, если они связываются с K_d больше или равным 10^-7 М, предпочтительно, больше или равным 10^-8 М. Степень сродства моноклонального антитела или связывающего партнера может легко определить специалист (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949). После того как получены подходящие антитела, их можно выделить или очистить с помощью множества способов, известных специалистам.

Коммерчески доступные антитела к молекулам клеточных поверхностей можно использовать, если их интернализовать. Вкратце, антитела вырабатывают путем иммунизации мышей, крыс, кроликов или других животных с нормальными опухолегенными, или культивируемыми клетками. Различные схемы иммунизации можно найти, например, у Harlow и Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 и у Coligan с сотр. (Current Protocols in Immunology, Greene Publishing, 1995). После иммунизации извлекают селезенку или лимфатические узлы для создания гибридом или собирают сыворотку для поликлональных антител. Гибридомы предпочтительнее (патенты США RE 32011, 4902614, 4543439 и 4411993; Harlow и Lane, выше; и Coligan с сотр. выше). Гибридомы, секретирующие антитела, выращивают и антитела тестируют на связывание с иммунизованными клетками с помощью ELISA, секционного окрашивания, цитометрии в потоке, конфокальной микроскопии и т.п.

Далее позитивные антитела тестируют в отношении интернализации. Одним из используемых анализов является тест на поиски антитела, которое убивает клетки. Вкратце, тестируемое гибридомное антитело и тестируемые клетки инкубируют. Не связанные антитела смывают. Антитело второй стадии, такое как анти-IgG антитело, конъюгированное с сапорином, инкубируют с тестируемыми клетками. Гибель клеток оценивают известными способами, включая вытеснение трипаном синим, захват МТТ, окрашивание флуоресциндиацетатом и т.п.

Для конструирования моноклональных антител можно также использовать другие способы (Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-5732, 1989; Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9, 1990, описывающие рекомбинантные методики). Эти способы включают клонирование тяжелых и легких цепей кДНК иммуноглобулина в подходящие векторы, такие как ImmunoZap (Н) и lmmunoZap (L). Эти рекомбинанты можно скринировать индивидуально или соэкспрессировать для образования Fab фрагментов или антител (Huse et а1., ранее; Sastry et al., ранее). Позитивные бляшки можно затем превратить в нелитические плазмиды, что обеспечит высокий уровень экспрессии фрагментов моноклональных антител из E. coli.

Аналогично части или фрагменты, такие как Fab и Fv фрагменты антител, можно также сконструировать, используя обычные методики ферментативного расщепления или рекомбинантных ДНК, для выхода выделенных вариабельных участков антитела. В одном из вариантов гены, которые кодируют вариабельный участок из гибридомы, продуцирующей представляющий интерес моноклональное антитело, амплифицируют, используя нуклеотидные праймеры для вариабельного участка. Кроме того, можно использовать методики для изменения "мышиного" антитела на "человеческое" антитело, не изменяя специфичности связывания антитела.

С. Отбор других лигандов

В настоящем изобретении можно использовать другие связывающиеся с рецептором лиганды. Может быть использован любой протеин, пептид, аналог, пептидомиметик или его фрагмент, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется. Эти лиганды можно идентифицировать и отобрать таким способом, как фаговый дисплей (например, патент США 5223409 и находящуюся на одновременном рассмотрении заявку "Methods using phage display for selecting internalizing ligands for gene delivery", поданную 29 августа 1997).

Вкратце, в этом способе ДНК последовательности встраивают в ген III или ген VIII нитевидного фага, такого как М13. Несколько векторов с сайтами мультиклонирования были созданы для встраивания (McLafferty et al., Gene 128: 29-36, 1993; Scott и Smith, Science 249:386-390, 1990; Smith и Scott, Methods Enzymol. 217:228-257, 1993). Встроенные ДНК последовательности могут быть созданы случайно или могут быть вариантами известных связывающих доменов для связывания целевых клеток. Используя этот способ, можно легко создать одноцепочечные антитела. Обычно вставки кодируют от 6 до 20 аминокислот. Пептид, кодируемый последовательностью вставки, представляется на поверхности бактериофага. Бактериофаг, экспрессирующий связывающий домен для целевых клеток, отбирают по связыванию с клетками или предпочтительно по экспрессии детектируемого или селектируемого трансгена, кодируемого геномом бактериофага.

Для селекции трансгенов или способов детектирования клетки выращивают в селективной среде (например, содержащей лекарство) или выделяют на основании экспрессии (например, с помощью проточной цитометрии). Встроенную ДНК выделяют обычно с помощью амплификации подвергнутых лизису клеток, анализируют (например, в анализе последовательностей ДНК) и используют в настоящем изобретении (Barry et al. см. ранее). Элюированный фаг размножают в бактерии хозяине. В любом из этих способов можно осуществить дальнейшие циклы селекции для отбора нескольких фагов, отличающихся высоким сродством связывания. Затем определяют ДНК последовательность вставки в связывающем фаге. После того как предсказанная аминокислотная последовательность связывающего пептида известна, подходящий пептид для использования в химическом конъюгате можно создать с помощью рекомбинантных методик или синтетически и с помощью рекомбинантных методик для использования в качестве слитого протеина. Пептид может быть создан как тандем для двух или более пептидов для достижения максимального сродства, или связывания.

D. Модификация связывающих рецептор интернализованных лигандов

Предназначенные для использования здесь лиганды можно подогнать для конкретного применения. Средства для модификации протеинов представлены далее. Вкратце, добавления, замены и делеции аминокислот можно осуществить любыми обычно используемыми рекомбинантными ДНК методиками. Модифицированные пептиды, особенно те, которые лишены пролиферативной функции, и химерные пептиды, которые сохраняют свои активности специфического связывания и интернализации, также подходят для использования в настоящем изобретении. Модификации также включают добавления или делеции остатков, такие как добавление цистеина для облегчения конъюгации и для образования конъюгатов, которые отвечают определенному молярному отношению (например, 1: 1) полипептидов (например, патент США 5175147; РСТ заявку WO 89/00198, США 07/070797; РСТ заявку WO 91/15229 и США 07/505124). Другие полезные модификации включают добавление последовательности, которую подвергают посттрансляционной модификации (например, миристилированию, пальматилированию, фосфорилированию, рибозилированию), что улучшает или изменяет функции протеина, стабильность или т.п.

Модификацию полипептида можно осуществить любыми известными специалистам способами. Предпочтительные в рамках настоящего изобретения способы основаны на модификации ДНК, кодирующих полипептид и экспрессирующих модифицированную ДНК. ДНК, кодирующую один из связывающих рецептор интернализованных лигандов, обсуждавшихся ранее, можно подвергнуть мутации, используя стандартные способы. Так например, цистеиновые остатки, которые отвечают за образование агрегатов, можно удалить или заменить. При необходимости идентичность цистеиновых остатков, которые вносят вклад в образование агрегатов, можно определить эмпирически, удаляя и/или заменяя цистеиновый остаток и определяя, образует ли полученный протеин агрегаты в растворах, содержащих физиологически приемлемые буферы и соли. Кроме того, можно сконструировать и использовать фрагменты этих связывающих рецептор интернализованных лигандов. Участки связывания многих из этих лигандов были описаны. Так например, рецепторный участок связывания FGF2 был идентифицирован с помощью анализа мутаций и FGF пептидные агонисты/антагонисты находятся между остатками 33-77 и между 102-129 из 155 аминокислотной формы (Baird et al., PNAS 85:2324; Erickson et al. , Biochem 88:3441). Экзоны 1-4 из VEGF необходимы для рецепторного связывания. Можно также показать с помощью любого из описанных здесь тестов, что фрагменты связаны и интернализованы.

Любым из способов, известных специалистам, можно осуществить мутации, включая сайт-специфический или сайт-направленный мутагенез ДНК, кодирующей протеин, и использовать методы амплификации ДНК, используя праймеры для введения и амплификации изменений в матрице ДНК, такие как ПЦР сплайсинг, путем перекрывания участков липких концов (SОЕ). Сайт-направленный мутагенез обычно осуществляют, используя фаговый вектор, который имеет одноцепочечную и двухцепочечную формы, такой как фаговый вектор М13, который хорошо известен и коммерчески доступен. Можно использовать другие подходящие векторы, которые содержат одноцепочечное фаговое начало репликации (например, Veira et al., Meth. Enzymol. 15:3, 1987). Обычно сайт-направленный мутагенез осуществляют, получая одноцепочечный вектор, который кодирует представляющий интерес протеин (например, член семейства FGF или цитотоксичную молекулу, такую как сапорин). Олигонуклеотидный праймер, который содержит нужную мутацию в участке гомологичности с ДНК в одноцепочечном векторе, отжигают с вектором с последующим добавлением ДНК полимеразы, такой как E.coli ДНК полимераза I (фрагмент Кленова), которая использует двухцепочечный участок в качестве праймера для получения гетеродуплекса, в котором одна цепочка кодирует измененную последовательность, а другая исходную последовательность. Этот гетеродуплекс вводят в клетки соответствующей бактерии и отбирают клоны, которые включают целевую мутацию. Полученная измененная молекула ДНК может быть экспрессирована рекомбинантно в клетках соответствующего хозяина с получением модифицированного протеина.

Подходящие консервативные замещения аминокислот хорошо известны и могут быть осуществлены обычно без изменения биологической активности полученных молекул. Например, такие замещения обычно делают путем взаимозамены внутри групп полярных остатков, заряженных остатков, гидрофобных остатков, маленьких остатков и т.п. При необходимости такие замещения можно определить эмпирически, тестируя полученный модифицированный протеин на способность связываться с соответствующими рецепторами и интернализоваться после связывания. Те, что сохраняют эту способность, пригодны для использования в конъюгатах и способах настоящего изобретения. Как таковой аминокислотный остаток рецептор-связывающего интернализованного лиганда не существенен, если полипептид, который был модифицирован путем делении или изменения остатка, обладает практически той же способностью к связыванию со своим рецептором и интернализации связанного агента, что и немодифицированный полипептид.

Е. Лиганды-пептидомиметики

Лиганды или их фрагменты, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности и интернализуются, но которые являются имитацией "истинных" полипептидов, также пригодны для использования в настоящем изобретении. Так, в одном из аспектов настоящее изобретение включает получение и использование непептидных пептидомиметиков, пригодных для имитирования активности пептидов, что делает пептидомиметики дополнительным источником целевых лигандов, которые могут быть присоединены к векторам на основе фагов настоящего изобретения.

Способы создания и идентификации подходящих пептидомиметиков, как здесь раскрыто, известны специалистам (например, WO 93/17032). Например, вышеуказанная заявка описывает способ получения соединений-пептидомиметиков, которые пригодны для имитирования активности пептидов, и описывает пептидоподобную активность одной из таких имитаций. Аналогично продуцирование пептидомиметических лекарств за счет использования химически модифицированных фрагментов для имитации структуры антител на основе конформационных исследований раскрыто в патенте США 5331573. Способы тестирования полученных таким образом лекарств также там раскрыты. Пептидомиметики антител, таким образом, полезны, как здесь раскрыто, не только как лиганды, но и как молекулы, пригодные для связывания фаговых частиц с нацеленными лигандами.

Другие полезные пептидомиметические молекулы, пригодные в качестве лигандов и/или "линкеров" настоящего изобретения, раскрыты в опубликованной РСТ публикации WO 92/20704; Brandt et al., Antimicrob Agents Chemother, 40: 1078, 1996; Sepp-Lorenzino et al., Cancer Res. 55:5302, 1995: и Chancier et al., J.Pharm. Sci, 84:404, 1995.

Несмотря на тот факт, что такие имитации не являются истинными пептидами, различные ковалентные и нековалентные средства связывания таких пептидомиметических молекул с протеинами фаговой оболочки можно использовать, как здесь раскрыто.

F. Векторы экспрессии для получения лигандов

В том смысле, как здесь использован, термин "функциональное связывание" или функциональная ассоциация двух нуклеотидных последовательностей относится к функциональному взаимоотношению между такими последовательностями. Нуклеотидные последовательности включают (но ими не ограничиваются) ДНК кодирующую продукт, ДНК кодирующую сигнальную последовательность, промоторы, энхансеры, сайты окончания транскрипции и трансляции, и сигналы полиаденилирования. Например, функциональное связывание ДНК, кодирующей цитоцид с промотором, относится к физическому и функциональному взаимоотношению между ДНК и промотором, так что транскрипция ДНК инициируется из промотора за счет РНК полимеразы, которая специфически распознает ДНК, связывается с ДНК и транскрибирует ее.

Организмы хозяев включают такие организмы, в которых рекомбинантное продуцирование гетерологичных протеинов было осуществлено, такие как бактерии (например, E.coli), дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris), клетки млекопитающих и клетки насекомых. В настоящее время предпочтительными организмами в качестве хозяев являются бактериальные штаммы E. coli.

ДНК конструкцию, кодирующую целевой протеин, вводят в плазмиду для экспрессии в соответствующем хозяине. В предпочтительном варианте осуществления хозяином является бактериальный хозяин. Последовательность, кодирующую лиганд, предпочтительно кодон-оптимизируют для экспрессии в конкретном хозяине. Так, например, если в бактериях экспрессируется человеческий FGF-2, кодоны должны быть оптимизированы для использования в бактериях. Для небольших кодирующих участков ген можно синтезировать как единичный олигонуклеотид. Для более крупных протеинов можно использовать сплайсинг множества олигонуклеотидов, мутагенез или другие известные специалистам способы. Последовательности нуклеотидов в плазмидах, которые являются регуляторными участками, такие как промоторы и операторы, функционально связаны друг с другом для транскрипции. Последовательность нуклеотидов, кодирующая фактор роста или фактор роста-химеру, может также включать ДНК, кодирующую сигнал секреции, и тогда полученный пептид является предшественником протеина. Полученный процессированный протеин можно выделить из периплазмического пространства или ферментационной среды.

Плазмиды, используемые в настоящем изобретении, включают промотор в функциональной ассоциации с ДНК, кодирующей представляющий интерес протеин или полипептид, и сконструированы для экспрессии протеинов в бактериальном хозяине. Подходящие промоторы для экспрессии протеинов и полипептидов настоящего изобретения широко доступны и хорошо известны специалистам. Предпочтительны индуцируемые промоторы или конститутивные промоторы, которые связаны с регуляторными участками. Такие промоторы включают (но ими не ограничиваются) Т7 фаговый промотор и другие, подобные Т7 фаговому промотору, такие как Т3, Т5 и SP6 промоторы, trp, lpp и lac промоторы, такие как lаcUV5 из E. coli; P10 или промотор гена полиэдрона экспрессионной системы бакуловирус/клетка насекомого (например, патенты США 5243041, 5242687, 5266317, 4745051 и 5169784), и индуцируемые промоторы из других эукариотных экспрессионных систем. Для экспрессии протеинов такие промоторы встраивают в плазмиду в функциональном связывании с контрольным участком, таким как lac оперон.

Предпочтительными промоторными участками являются те, которые индуцируемы и функциональны в E.coli. Примеры подходящих индуцируемых промоторов и промоторных участков включают (но ими не ограничиваются) E.coli lac оператор, реагирующий на изопропил--D-тиогалактопиранозид (IPTG; Nakamura et al. , Cell 18:1109-1117, 1979); металлрегуляторные элементы промотора металлотионена, реагирующие на индуцирование тяжелым металлом (например, цинком) (патент США 4870009, выданный Evans et al.); фаговый Т71ас промотор, реагирующий на IPTG ( например, патент США 4952496; и Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990) и ТАС промотор.

Плазмиды также предпочтительно включают селективный маркерный ген или гены, которые функциональны в хозяине. Селективный маркерный ген включает любой ген, который придает фенотип бактерии, позволяющий трансформировать бактериальные клетки так, что их можно идентифицировать и селективно выращивать, выбрав из большего числа нетрансформированных клеток. Гены подходящих селектируемых маркеров для бактериальных хозяев, например, включают ген устойчивости к ампициллину (Amp^r), ген устойчивости к тетрациклу (Tc^r) и ген устойчивости к канамицину (Kan^r). Ген устойчивости к канамицину предпочтителен.

Плазмиды могут также включать ДНК, кодирующие сигнал для секреции функционально связанного протеина. Сигналы секреции, пригодные для использования, легко доступны и широко известны специалистам. Можно использовать прокариотные и эуакариотные сигналы секреции функциональные в E.coli. Предпочтительные в настоящее время сигналы секреции включают (но ими не ограничиваются) те, которые кодируются следующими генами E.coli: ompA, ompT, ompF, ompC, бета-лактамазы, и щелочной фосфатазы и тому подобными (von Heijne, J. Mol.Biol. 184:99-105, 1985). Кроме того, можно использовать бактериальный сигнал секреции ре1В гена (Lei et al., J.Bacteriol. 169:4379, 1987), phoA сигнал секреции и cek2, функциональные в клетках насекомых. Наиболее предпочтительным сигналом секреции является E.coli ompA сигнал секреции. Можно также использовать другие прокариотные и эукариотные сигналы секреции, известные специалистам (например, von Heijne. J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985). Используя описанные здесь способы, специалисты смогут заменить сигналы секреции, которые функциональны как в дрожжевых клетках, так и в клетках насекомых или млекопитающих, для секреции протеинов из этих клеток.

В предпочтительных вариантах ДНК плазмиды также включают последовательность терминации транскрипции. Полноразмерный терминатор транскрипции можно получить из протеин-кодирующего гена, который может быть тем же самым или может отличаться от встроенного гена или источника промотора.

Особенно предпочтительные плазмиды для трансформации клеток E.coli включают векторы экспрессии рЕТ (патент США 4952496; доступны от Novagen, Madison, WI). Такие плазмиды включают рЕТ 11а, который содержит Т71ас промотор, Т7 терминатор, индуцируемый E.coli lac оператор и lac репрессорный ген; рЕТ 12а-с, который содержит Т7 промотор; Т7 терминатор и E.coli ompT сигнал секреции; и рЕТ 15b, который содержит His-Tag^ТМ лидерную последовательность для использования при очистке на His колонке, и сайт расщепления тромбина, который позволяет осуществлять расщепление после очистки на колонке, Т7-1ас промоторный участок и Т7 терминатор.

Другие предпочтительные плазмиды включают рКК плазмиды, в частности рКК 223-3, которая содержит tac промотор (Pharmacia Biotech). Плазмида рКК была также модифицирована путем замены гена устойчивости к ампициллину кассетой устойчивости к канамицину (Pharmacia Biotech). Другие плазмиды включают pIN-IIIompA плазмиды (патент США 4575013), которые имеют сайт клонирования, связанный с транскрипционной рамкой считывания с четырьмя функциональными фрагментами, полученными из гена липопротеина E.coli и отрА сигнальной последовательности.

Бакуловирусные векторы, такие как pBlueBac (называемый также pJVETL и его производные), в частности pBlueBac III (Invitrogen, San Diego, CA), можно использовать для экспрессии полипептидов в клетках насекомых. ДНК конструкцию можно создать в бакуловирусном векторе, а затем сотрансформировать с вирусом дикого типа в sf9 клетки насекомых из Spodoptera frugiperda (например, Luckow et al. , Bio/technology 6: 47-55, 1988 и патент США 4745051).

Векторы экспрессии, совместимые с эукариотными клетками, предпочтительно совместимые с клетками млекопитающих, также можно использовать для создания рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот для использования в настоящем изобретении. Векторы экспрессии клеток млекопитающих хорошо известны специалистам и доступны из ряда коммерческих источников. Обычно предоставляются такие векторы, содержащие обычные рестрикционные сайты для встраивания нужного ДНК сегмента и обеспечения сигналов, необходимых для экспрессии генов в клетках млекопитающих. Типичными такими векторами являются pREP серии векторов и pEBVhis, доступные от Invitrogen (San Diego, CA), векторы pTDTl (ATCC 31255), pCPl (ATCC 37351) и pJ4W (АТСС 37720), которые можно получить из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC)).

Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, можно идентифицировать хорошо известными способами. Например, клетки, полученные в результате введения рДНК настоящего изобретения, можно подвергнуть анализу для определения присутствия специфической рДНК, используя метод гибридизации нуклеиновых кислот, как раскрыто Southern, J. Mol. Biol. 98:503, 1975 или Berent et al., Biotech. 3:208, 1985. Кроме непосредственного анализа присутствия рДНК успешные трансформации можно подтвердить хорошо известными иммунологическими способами определения присутствия экспрессированного протеина. Например, клетки, успешно трансформированные вектором экспрессии, продуцируют протеины, которые затем можно проанализировать непосредственно иммунологическими методами в отношении наличия функции экспрессированного протеина.

Другие подходящие векторы экспрессии млекопитающих хорошо известны, и их можно легко получить из различных начал (например, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al. , ранее; Invitrogen, San Diego, CA; Novagen. Madison, WI; Pharmacia Biotech; и др.).

В различных предпочтительных вариантах ДНК фрагмент реплицируются в бактериальных клетках, предпочтительно в E.coli. Предпочтительный фрагмент ДНК включает также бактериальное начало репликации. Предпочтительные бактериальные начала репликации включают (но ими не ограничиваются) fl-ori и col E1 начала репликации. Предпочтительные хозяева содержат хромосомные копии ДНК, кодирующей Т7 РНК полимераэу, функционально связанную с индуцируемым промотором, таким как lacUV промотор (патент США 4952496). Такие хозяева включают (но ими не ограничиваются) лизогенные штаммы E.coli HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) и BL21(DE3). Штамм BL21 (DE3) предпочтителен.

Предложенные ДНК фрагменты могут также содержать ген, кодирующий репрессорный протеин, который способен подавлять транскрипцию промотора, который содержит сайт связывания для репрессорного протеина. Этот промотор можно дерепрессировать, изменяя физиологические условия клетки. Предпочтительные репрессорные протеины включают (но ими не ограничиваются) E.coli lad репрессор, реагирующий на IPTG индукцию, термочувствительный с1857 репрессор и т.п.

В одном из описанных здесь предпочтительных вариантов "плазмидой" является фагемид pEGFP-N1 (Clontech; Palo Alto, CA), который содержит ген флуоресценцирующего зеленым протеина (GFP) под контролем CMV предраннего промотора. CMV промотор высоко активен в большом числе клеточных линий млекопитающих; однако можно использовать другие промоторы клеток млекопитающих. Примеры других подходящих промоторов, активных в клетках млекопитающих, включают вирусные промоторы (например, ретровирусные LTR(s), MMTV LTR, HIV LTR, SV40 ранний и поздний промоторы, бычий папилломавирус (BPV) или невирусные индуцируемые промоторы (например, промоторы, реагирующие на металлотионеин, термошок, стероидные гормоны). Еще другие промоторы включают те, которые являются конститутивными (например, бета-актин) или ткане-специфическими (например, альфа-фетопротеин (AFP), карциноэмбрионный антиген (СЕА), альфа-актин и Myo D). Дополнительно полезными промоторами являются те, которые здесь всюду описаны.

Предпочтительно, чтобы фагемид включал также SV40 начало репликации для усиления генной экспрессии. Другие вирусные системы репликации также можно использовать, например, как здесь раскрыто, используют EBV начало и EBNA или BPV.

Предпочтительным штаммом E.coli, в котором размножают фагемиды, является штамм E. coli DH5F". Подходящие системы настоящего изобретения могут также выиграть от использования хелперного бактериофага. Например, М13 хелпер М13К07 особенно полезен в сочетании с вышеупомянутыми бактериальными штаммами.

Способы получения фагемидных частиц известны специалистам и могут быть соответствующим образом модифицированы в зависимости от используемой системы, как очевидно специалистам (например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Rider et al., в Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996).

III. КОНСТРУИРОВАНИЕ ЛИГАНД-МОДИФИЦИРОВАННОГО БАКТЕРИОФАГА

Различные конструкции и методы можно легко адаптировать для использования при связывании фага с лигандом для использования специфического нацеливания и доставки терапевтического фрагмента или агента. Таким образом, фаг представляет лиганд, который является частью протеина слияния, непосредственной химической связи или сэндвича. Примеры способов модификации бактериофага лигандами настоящего изобретения описаны далее. Лиганды получают, как здесь раскрыто, любыми подходящими способами, включая рекомбинантные ДНК технологии, выделение из подходящего источника, покупку в коммерческих источниках или химический синтез. Различные предпочтительные способы и модификации лигандов, которые могут облегчить связывание лиганда с фаговым протеином, раскрыты в опубликованной РСТ публикации WO 96/36362.

Так, например, ДНК, кодирующую полипептидные лиганды, можно выделить, синтезировать или получить из коммерческих источников или получить, как здесь раскрыто. Экспрессию рекомбинантных полипептидов можно осуществить, как здесь раскрыто; и ДНК, кодирующую эти полипептиды, можно использовать в качестве исходных материалов для раскрытых здесь способов. ДНК можно получить синтетически на основании аминокислотных или ДНК последовательностей или можно выделить, используя известные специалистам способы, такие как ПЦР, зондовая гибридизация библиотек, и т.п., или получить из коммерческих или других источников.

А. Создание протеинов слияния

Протеины слияния настоящего изобретения предпочтительно включают ген, кодирующий весь лиганд или рецептор-связывающую полипептидную часть лиганда (например, FGF2), генетически слитую или связанную с геном, кодирующим оболочковый протеин частицы бактериофага, используя известные специалистам способы (например. Smith и Scott Meth Enzymol, 217:228-257, 1993; Kay et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996). Предпочтительно, чтобы фаг был нитевидным фагом; М13 раскрыт здесь как пример предпочтительного варианта. Здесь же раскрыто получение протеина слияния, включающего М13 гены III или VIII оболочкового протеина.

Следует отметить, что предпочтительно, чтобы если фаговые векторы объединены, лиганд-фаговый оболочковый протеины слияния были преобладающими видами. Обычно число копий слияний лиганд-фаговой оболочки по сравнению с протеинами оболочки дикого типа можно легко контролировать по появлению слияний с большим числом копий (векторы типа 3 или типа 8) или с малым числом копий (векторы типа 3+3 или типа 8+8).

Нуклеотидные последовательности для лигандов легко доступны (например, из GenBank) или могут быть синтезированы или выделены стандартными способами. Кодирующие лиганд участки встраивают в фаговые векторы, используя хорошо известные способы.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие слияния лиганд-фаг, можно также дальше модифицировать, встраивая репортерный ген млекопитающего для дальнейшей проверки связывания и интернализации и успешности экспрессии нуклеиновой кислоты. Одним из примеров репортерного гена млекопитающих является EGFP; другие включают последовательности для -галактозидазы, люциферазы, человеческого гормона роста (HGH) и секретированной щелочной фосфатаэы. Способы получения и использования таких последовательностей, как здесь раскрыто, известны специалистам (например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 1989).

В различных предпочтительных вариантах экспрессионная кассета включает также начало репликации. SV40 ori особенно подходит для осуществления репликации с большим числом копий в клеточных линиях, содержащих Т антиген (например, клетки COS). Доступно множество подходящих способов и схем, которые используют те или иные начала репликации (например, Sambrook et al., ранее).

Слияния лиганд-оболочкового протеина можно тестировать на связывание фага с подходящим рецептором (например, схожего рецептора с лигандом) известными способами, такими как ELISA. Связывание и интернализацию слияния легко определить известными специалистам способами, такими как иммуногистохимическими (Barry et al., Nature Med. 2: 299-305, 1996; Li, Nature Biotech. 15:559-563, 1997).

Модифицированный фаг можно далее протестировать в отношении трансдукции репортерного гена в клетки (предпочтительно в клетки млекопитающих), добавляя фаг к клеточным культурам на определенный промежуток времени; в зависимости от схемы и используемого репортера количество клеток, экспрессирующих репортерный генный продукт в последующий определенный момент времени, легко оценить, используя известные способы. Например, если репортерным геном является EGFP, который транслирован в флуоресцирующий зеленым протеин (GFP), если происходит доставка гена и экспрессия, можно легко измерить число автофлуоресцирующих клеток несколько часов спустя. Результаты легко подсчитать. Например, если используют флуоресцентные репортеры, проточная цитометрия особенно подходит для измерения распределения клеток, экспрессирующих флуоресцентный репортерный ген в популяции и можно с помощью флуорометрии клеточных экстрактов измерить полные количества экспрессированных репортерных протеинов.

Варианты вышеуказанных процедур включают конструирование протеина слияния, включающего всю молекулу антитела или ее часть и фаговый протеин, в результате чего получают фаговый конъюгат протеин-антитело. Хотя получение слияния одноцепочечное антитело - фаговый оболочковый протеин раскрыто в качестве примера, другие антитела и их фрагменты также можно использовать, как здесь раскрыто.

Обычно антитело или его часть, например mAb, Fab или ScFv, либо получают прямым синтезом (например, используя сплайсингом сайта перекрывающихся одноцепочечных участков ПЦР с необязательным добавлением рестрикционных сайтов с 5" и 3" концов последовательности) или отбирают и выделяют из асцитов, а затем очищают известными способами, такими как афинная хроматография. Если нужно использовать только Fab фрагмент, антитело, собранное из асцитов, модифицируют далее в соответствии со стандартными схемами получения Fab, например, используя папаиновое расщепление.

Одним из примеров антител, которые специфически нацелены на FGF рецептор, является 11А8 антитело, полученное из 11А8 гибридомы. 11А8, которое распознает ECDR1 с помощью Вестерн-блоттинга, может иммуноосадить FGFRs из экстрактов SK-HEP-1 и SK-MEL-28, клеток меланомы. Антитело 11А8 также окрашивает SK-HEP-1 клетки на клеточной поверхности. Рецептор-связывающие фрагменты и варианты 11А8 и аналогичных рецептор-связывающих антител, предпочтительно антител, которые также интернализуются, можно также нековалентно (или ковалентно) присоединить к фаговой оболочке для того, чтобы они могли функционировать как полезные лиганды, как здесь раскрыто. Другие антитела (и их фрагменты), которые специфически нацелены на клеточные рецепторы, предпочтительно те антитела и их фрагменты, которые связываются и интернализуются, можно идентифицировать и синтезировать в соответствии с раскрытыми здесь способами и путем использования других способов, описанных в этой области.

Диплифицированные тяжелые и легкие цепи клонируют в векторы экспрессии. Выбранный вектор экспрессии предпочтительно содержит соответствующие промоторы и также удобные рестрикционные сайты. Полученный протеин может быть необязательно экспрессирован как N-терминальный и как С-терминальный протеин слияния. Кроме того, гибкие линкеры могут быть добавлены между антителом и лигандом для того, чтобы способствовать правильной укладки протеина. Использование более мелких фрагментов антител (например. Fab или ScFv), по-видимому, еще более облегчает укладку. Экспрессию, очистку и оценку протеинов слияния антитело-фаг легко осуществить в клетках хозяина, например в клетках бактерий, используя известные схемы.

В другом варианте можно слить два моноспецифических антитела или их иммунологически активные части с различными протеинами фаговых оболочек, где каждое антитело направлено против того же самого рецептора, или против различных рецепторов. Такая конструкция может оказаться полезной в ситуациях, в которых экспрессируемые клеточные рецепторы являются полиморфными, а использование фаговых векторов направленно на два или более из указанных полиморфизмов должно иметь большее сходство с доставкой объекта к нужным клеткам. Достижение слияния между протеином фаговой оболочки и биспецифическими антителами также входит в объем настоящего изобретения.

В результате векторы доставки генов, направленные на один или более из рецепторов, можно легко получить в соответствии с раскрытыми здесь способами. В другом варианте часть (части) гибридного антитела нацеливают на другие лиганды в противоположность специфическим рецепторам скорее, нежели направляют антитела непосредственно к родственным рецепторам. Такая процедура может быть особенно полезной в ситуациях, когда способность лиганда связывать свой родственный рецептор зависит от способности лиганда достигать вторичной или третичной структуры, что вовсе не так легко осуществить, если лиганд был включен в протеин слияния лиганд-фаг.

Например, химерные антитела, включая рецептор-связывающие лиганды в месте их константного участка, такие, как те, которые описаны в опубликованной РСТ публикации WO 91/14438, можно использовать, как здесь раскрыто. Более того, биспецифические антитела, созданные, как раскрыто в опубликованной патентной заявке Великобритании GB 2197323, также предпочтительны для использования в настоящем изобретении. Далее, мостиковые антитела, такие как те, которые описаны в опубликованной РСТ публикации WO 92/08801, могут быть полезны при лечении состояний, при которых желательно "удлиненное по времени выделение" терапевтических нуклеотидных последовательностей. Так, использование биспецифических антител, которые связывают фаговый вектор с мишеневой клеткой во время совместного или последующего введения векторов, несущих высокоспецифичные протеазы, рибозимы или дезоксирибозимы, которые высвобождают связанные векторы, тем самым обеспечивая им возможность непосредственно связываться с их целевым рецептором и интернализовать вектор, также входят в объем настоящего изобретения.

Для того чтобы быть полезными в нацеливании векторов бактериофагов, рекомбинантный протеин слияния должен связываться с родственным рецептором. Протеины слияния можно анализировать в отношении их связывающей способности в анализе ELISA в соответствии с известными методиками. Для проверки функциональности домена связывания рецептора анализ связывания и интернализации можно осуществить на рецептор-позитивных клетках, а специфичность связывания определить, включая немеченый протеин слияния в качестве конкурента в стандартные схемы.

В одном из примерных способов интернализацию протеина слияния определяют, предварительно инкубируя рецептор-позитивные клетки с меченым протеином слияния, промывая клетки для удаления несвязанного меченого протеина и осуществляя дальнейшие инкубирования при заранее определенных температурах и для различных временных интервалов, для того чтобы обеспечить интернализацию рецепторов. После удаления связанного с поверхностью радиомеченного протеина клетки подвергают лизису и радиоактивность определяют для клеточного лизата. Этот анализ определяет способность протеинов слияния связываться с родственным рецептором в контексте протеина слияния.

Для облегчения присоединения последовательности лиганда к последовательности фага, протеин фага можно модифицировать на молекулярном уровне. Так, нуклеотидную последовательность, кодирующую терапевтическую молекулу, токсин или другие регуляторные молекулы, можно функционально связать для экспрессии с нуклеотидной последовательностью фага, в особенности с последовательностью, кодирующей структурный протеин. Например, протеин III или протеин VII нитевидного фага (например, М13) можно модифицировать путем присоединения гетерологичной нуклеотидной последовательности к С-концу гена, кодирующего указанный протеин. В другом варианте, одну или более из гетерологичных последовательностей можно встроить по внутреннему сайту, например, внутрь последовательности протеина фаговой оболочки. Различные способы получения таких слияний доступны специалистам и раскрыты в настоящем изобретении.

И, наконец, следует учитывать, что фаговые протеины можно модифицировать способами, которые не являются в точности "иммунологическими" или "генетическими". Модификация фаговых протеинов способами, которые отличаются от представленных здесь в качестве примеров, полностью входят в объем настоящего изобретения. Например, полезные векторы на основе нитевидных фагов настоящего изобретения можно подвергнуть химическим изменениям их оболочковых протеинов, например, таким способом, который влияет на иммуногенность векторов, для того чтобы регулировать захват и устойчивость векторов в клетках индивидуума, которому вводят раскрытые здесь терапевтические конструкции и композиции. Способы осуществления таких изменений протеинов химическими или физическими способами (например, термошок) известны специалистам, и могут быть легко найдены в соответствующей литературе.

В. Использование антител для связывания вектора и лиганда

Вариантом процедур, раскрытых выше, которые направлены на получение протеинов слияния, является использование биспецифических антител или их фрагментов, например, в форме биспецифических ScFv для нацеливания фага на конкретный клеточный рецептор, используя антитело или его часть, которое выработано против протеина фаговой оболочки и связывает это антитело с одним из тех, которые были выработаны против лиганда. Хотя это не совсем то же, что конструкция протеина слияния, различные методики, суммированные выше (например, в отношении получения ScFv), можно использовать для получения биспецифических антител для использования по способу настоящего изобретения.

В другом варианте протеин слияния, включающий протеин фаговой оболочки и моноспецифическое антитело, полезен для связывания фагового вектора с лигандом. Получение антитела или его фрагмента очевидно специалистам; см. также раздел А выше. Часть антитела из конструкции антитело-протеин слияния предпочтительно вырабатывают против предварительно выбранного лиганда, например такого, который нелегко включается в протеин слияния, возможно, из-за конформационных трудностей. Такой протеин антитело-фаговая оболочка можно затем использовать для связывания лиганда, который направляет специфический рецептор к фаговому вектору, с целью доставки объекта к клетке, экспрессирующей соответствующий родственный рецептор.

С. Использование авидин-биотина для связывания бактериофага с лигандом

Одним из способов нацеливания фага на клеточные рецепторы является связывание фага с лигандом за счет авидин-биотина, что можно осуществить следующим образом. Комплекс лиганд-фаг образуют в присутствии тестируемых клеток при 0^oС с последующим инкубированием при 37^oС для осуществления интернализации. Молекулу лиганда конъюгируют с биотином по одной свободной сульфгидрильной группе, используя биотин-ВМСС (Pierce; Rockfold, IL) в соответствии с указаниями изготовителя. Непрореагировавший биотин удаляют, пропуская реакционную среду через обессоливающую колонку PD-10.

Культивируемые клетки (например, COS клетки) инкубируют в течение заранее определенного промежутка времени (например, в течение 24 часов) перед добавлением фага. Клетки промывают, и затем добавляют биотинилированный лиганд (часто на льду), и препарат инкубируют в течение заранее определенного промежутка времени. Добавляют авидин (например, Neutravidin, нейтральный, лишенный углеводов авидин; Pierce; Rockfold, IL) и клетки повторно промывают. Добавляют биотинилированное антифаговое антитело (такое как анти-М13 антитело, если фагом является М13) и инкубируют в течение заранее определенного промежутка времени. Клетки снова промывают и добавляют достаточное количество колоний образующих единиц в каждую лунку или ячейку с последующим дальнейшим инкубированием, предпочтительно на льду. Клетки снова промывают, снова суспендируют в свежей среде, и обеспечивают дальнейшее инкубирование в течение соответствующего промежутка времени при определенной заранее температуре. После этого определяют экспрессию агента, кодируемого последовательностью терапевтической нуклеиновой кислоты, транспортированной фаговым вектором. В различных предпочтительных вариантах вектор еще включает репортерный ген, такой как EGFP, который можно легко контролировать с помощью флуоресцентной микроскопии или с помощью сортера активированных флуоресценцией клеток (FACS) в соответствии со стандартными способами.

D. Ковалентное связывание/химическая конъюгация

1. Связывание лигандов с бактериофагом с помощью поликатионов

Лиганд может быть альтернативно связан с поликатионом, таким как полилизин, который затем связывают с фагемидными частицами в результате взаимодействия позитивно заряженного поликатиона и негативно заряженного фага. В одной из приведенных в качестве примера процедур лиганд ковалентно связывают с полилизином, используя S-2-пиридилдисульфид (SPDP) известным способом (например, Sosnowski et al. , J.Bioi. Chem. 271:33647-33653, 1996). Затем фагемидные частицы смешивают с конструкцией лиганд-полилизин или одним только полилизином и оставляют при комнатной температуре на заранее определенный

промежуток времени перед тем, как тестировать конъюгаты в культивируемых клетках, или перед ex vivo или in vivo введением. Для подтверждения экспрессии можно включить в конструкцию лиганд-полилизин-фаг репортерную последовательность; флуоресцентные маркеры, такие как GFP и флуоресцин, особенно полезны для in vitro анализов.

В контексте процедуры анализа обработанные клетки исследуют обычными способами (например, с помощью флуоресцентной микроскопии или FACS). Далее, если репортерной последовательностью является EGFP, подсчитывают автофлуоресцентные GFP позитивные клетки для подтверждения того, что GFP ген (и присоединенные к нему нуклеотидные последовательности) были успешно трансдуцированы в клетки за счет фага, связанного с лигандом через полилизин. Этот метод фаговой трансдукции представляет привлекательную альтернативу применению описанной здесь системы авидин-биотин.

2. Связывание лигандов с бактериофагом с использованием перекрестносшивающих реагентов

Оболочковые протеины бактериофага, предпочтительно нитевидного бактериофага, можно конъюгировать непосредственно с лигандом, используя гетеробифункциональные перекрестносшивающие реагенты. Например, свободный лизин с N-конца гена VIII оболочкового протеина М13 фага доступен для химической модификации (Armstrong et al., EMBO J. 2:1641-1646, 1983) и может быть с успехом использован для этой цели. Обычно процедуру можно описать следующим образом.

Вначале тиолируют фаговые частицы (например, добавляя SPDP) в течение заранее определенного промежутка времени и при определенной температуре. Непрореагировавший реагент удаляют; затем осуществляют реакцию лиганда с тиолированным фагом. Свободный лиганд удаляют, а связанный с лигандом фаг очищают далее в соответствии со стандартными схемами. В аналогичных процедурах можно использовать N-сукцинимидил S-ацетилтиоацетат (SATA) и другие подходящие гетеробифункциональные химические реагенты для введения тиольной функции, а не SPDP в соответствии с известными способами. Например, выбранный линкер или линкеры связывают с рецептор-связывающими интернализованными лигандами с помощью химических реакций, обычно полагаясь на доступный тиол или аминогруппу на рецептор-связывающих интернализованных лигандах. Гетеробифункциональные линкеры особенно подходят для химической конъюгации) и включают такие молекулы, как сложный эфир m-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукциниимида, N-сукцинимидил-(4-иодоацетил)амино-бензоат и N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (например, опубликованные патентные заявки Великобритании GB 2268492, 2253626 и 2257431, включенные сюда в качестве ссылки).

Связь лиганда с фаговым протеином легко подтвердить с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном геле и иммуно-блоттинга фаговых протеинов. Например, в невосстанавливающих условиях модифицированный лигандом протеин гена VIII оказывается измененным по его очевидной молекулярной массе в несвязанной форме в сторону значительно большей очевидной молекулярной массы, если связь оказывается успешной. Добавление восстанавливающего агента к образцовому буферу разрушает дисульфидную связь и приводит к получению свободного лиганда и протеина гена VIII.

Затем химически модифицированные конструкции лиганд-фаг можно проанализировать по их способности к трансдукции клеток млекопитающих. Лиганд-модифицированные фагемидные частицы, несущие экспрессионную кассету, содержащую промотор и репортерную последовательность, добавляют к посеянным клеткам в многоячейковых планшетах. Клетки анализируют на предмет экспрессии маркерного протеина через заранее определенные интервалы после добавления конструкций лиганд-фаг.

3. Дополнительные способы связывания

Другие способы химического связывания лиганда с фаговыми частицами включают экспрессию специфического реакционноспособного фрагмента на поверхности фаговой частицы, где этот фрагмент затем конъюгируют специфически и непосредственно с выбранным лигандом. Примеры реакционноспособных фрагментов, которые можно легко сконструировать на поверхности протеина фаговой частицы, включают различные связывающие протеины, протеин А, цистеин и широкий круг реакционноспособных групп (например, опубликованные патентные заявки Великобритании GB 2268492 и 2257431, включенные сюда в качестве ссылки).

Способы конструирования таких фрагментов на поверхности фаговых частиц доступны специалистам и были также раскрыты в предыдущих разделах. Например, способ сайт-специфического мутагенеза можно использовать для изменения последовательности аминокислотных остатков протеина фаговой оболочки, тем самым облегчая связывание лиганда с родственным сайтом (сайтами). После этого предварительно выбранный лиганд (например, полипептид, который связывается с FGF рецептором) конъюгируют с поверхностью фага за счет реакционноспособного фрагмента. В добавлении к FGFR-связывающим полипептидам другие полезные лиганды, которые можно конъюгировать с поверхностью фаговых частиц, включают антитела и их фрагменты (например, 11А8), включая в качестве примеров одноцепочечные антитела и цистеин.

Другие лиганды также можно присоединить к оболочковым протеинам фаговой поверхности. Размер слияний с оболочковыми протеинами может быть небольшим, как в мелких случайных пептидах размером от 6 (Scott и Smith, Science, 249: 386-390, 1990) до 38 аминокислот (Кау, Gene 128:59-65, 1993), из которых были выделены пептиды, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности. Молекулы протеинов, такие как фрагменты Fab антитела (~50 кДa), также были слиты с протеинами фаговой оболочки. Целые протеины, такие как щелочная фосфатаза, ингибитор трипсина поджелудочной железы быка, трипсин, -лактамаза, цитокин IL3 и глутатион-S-трансфераза, PDGF рецептор (Chiswell и McCafferty, Trends Biotechnol. 10: 80, 1992) и IgE эктодомен (Robertson, J. Biol. Chem. 268: 12736, 1993) также были слиты с поверхностью фага. Известен к настоящему времени справочный список протеинов, представленных на фаге см. www.unc.edu/depts/biology/bkay/phagedisplay/html. Экспрессия мелких пептидов на поверхности фагов существенно эффективна, тогда как более крупные пептиды экспрессируются в количестве примерно 50 копий до менее 1 копии на фаг.

Е. Размножение модифицированного фага

Модифицированный фаг размножают по способу Sambrook et а1. Подходящую бактерию-хозяина, которая содержит F" эписому, выращивают из выделенной колонии до середины логарифмической фазы роста. Изоляты бактериофага можно отобрать с бляшек, которые образуются на газоне инфицированных клеток, выращиваемых на полутвердой среде. Мутные бляшки являются более медленно растущими инфицированными клетками, которые видны невооруженным глазом на газоне более плотных неинфицированных бактерий. Запас бляшек можно получить в жидкой культуральной среде из хорошо выделенных бляшек. Около 1/10 фагов из одной бляшки используют для инфицирования 50 мкл бактерий-хозяев в 2 мл среды. Культуру инкубируют при 37^oС в течение 5-6 часов при постоянном перемешивании. Более длительных времен инкубирования следует избегать для предотвращения делеционных мутантов. Бактерии осаждают микроцентрифугированием, и надосадочную жидкость переносят в свежую ампулу. Титр фага в надосадочной жидкости должен быть около 10¹² бое/мл, и его можно хранить при 4^oС или неограниченно долго при -20^oС.

IV. ТРАНСДУЦИРУЮЩИЕ ГЕНЫ

Трансдуцирующий ген в том смысле, как здесь раскрыто, относится к гену, который кодирует дедектируемый продукт в целевой клетке. Предпочтительно, чтобы трансдуцирующий ген был терапевтическим геном. Термины "терапевтическая нуклеиновая кислота" или "терапевтический ген" описывают любую молекулу нуклеиновой кислоты, используемую в контексте настоящего изобретения, которая осуществляет лечение, обычно за счет модификации транскрипции или трансляции гена. Она включает (но ими не ограничивается) следующие типы нуклеиновых кислот: нуклеиновые кислоты, кодирующие протеин, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту, ДНК, предназначенную для образования триплексных молекул, протеин, связывающий нуклеиновые кислоты и небольшие нуклеотидные молекулы. Как таковой продукт терапевтического гена может быть ДНК или РНК. Эти генные последовательности могут быть природно полученными последовательностями или полученными рекомбинантными методами. Терапевтическую нуклеиновую кислоту можно использовать для осуществления генной терапии, когда она служит взамен дефективного гена, путем кодирования терапевтического продукта, такого как TNF, или путем кодирования цитотоксической молекулы, особенно фермента, такого как сапорин. Терапевтическая нуклеиновая кислота может кодировать весь ген или его часть и может функционировать, рекомбинируя ДНК, которая уже присутствует в клетке, заменяя тем самым дефективную часть гена. Она может также кодировать часть протеина и проявлять этот эффект путем сосупрессии генного продукта.

Как обсуждалось выше, терапевтический ген представлен в функциональной связи с выбранным промотором и необязательно в функциональной связи с другими элементами, которые принимают участие в транскрипции, трансляции, локализации, стабильности и т.п.

Композиция терапевтических нуклеотидов настоящего изобретения имеет длину от около 20 пар оснований до около 100000 пар оснований. Предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала от около 50 пар оснований до около 50000 пар оснований. Более предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала от около 50 пар оснований до около 10000 пар оснований. И еще более предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала от около 50 пар оснований до около 4000 пар оснований.

Такие композиции нуклеиновых кислот можно доставить с помощью бактериофага настоящего изобретения различными способами, включая например, in vitro, in vivo,и ex vivo способы трансдукции.

А. Замена или усиление гена

Нуклеиновые кислоты для доставки включают также молекулы ДНК, которые кодируют протеины, которые должны заменить дефективные гены или обеспечить доставку факторов для борьбы с некоторыми заболеваниями или синдромами. Многие генетические дефекты вызваны мутациями в единичном гене. Введение гена дикого типа будет служить для ослабления дефицита или генетических отклонений. Такие гены включают HPRT, аденозиндеаминазу, LDL рецептор, фактор IX, фактор VIII, гормон роста, фактор von Willebrand, PTH (паратироидный гормон), M-CSF, TGF-, PDGF, VEGF, FGF, IGF, BMP (костный морфогенный протеин), коллаген типа VII, фибриллин, инсулин, регулятор трансмембранной проводимости при муковисцедозе, аденозиндиаминазу и т.п.

Так, например, при ишемии эндотелиальные клетки и клетки гладкой мускулатуры не могут пролиферировать. Конструкцию, которая экспрессирует FGF, отдельно или в сочетании с FGF протеином обеспечивает кратковременное облегчение и индуцирует FGF рецептор, можно использовать для борьбы с проявлениями ишемии. В этом случае предпочтителен FGF ген с лидерной последовательностью для стимулирования секреции. Кроме того, предпочтительно, чтобы FGF ген управлялся бы конститутивным промотором.

Кроме того, некоторые пациенты с ангиогенными заболеваниями страдают от недостатка ангиогенного фактора, и как следствие, наблюдается микрососудистая недостаточность. Некоторые аспекты репродукции, такие как овуляция, восстановление маток после менструаций и развитие плаценты зависят от ангиогенеза. Для репродуктивных расстройств, связанных с ангиогенной дисфункцией, могут оказаться благоприятными конструкции, которые экспрессируют FGF, VEGF или другие ангиогенные факторы.

Иммунотерапия цитокинами является модификацией иммуногенной терапии и включает введение вакцин опухолевых клеток, которые генетически модифицированы ex vivo или in vivo таким образом, чтобы экспрессировать различные гены цитокинов. В моделях с опухолями на животных перенос генов цитокинов приводил к значительной противоопухолевой иммунной реакции (Fearon et al., Cell 60: 387-403, 1990; Wantanabe et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86: 9456-9460, 1989). Так, в настоящем изобретении используют фаги для доставки ДНК, кодирующей цитокины, такие как IL-12, IL-10, IL-2, GM-CSF, INF-, или МНС ген, такой как HLA-B7. Доставка этих генов будет изменять иммунную систему, повышая потенциал противоопухолевого иммунитета хозяина. В другом варианте ДНК, кодирующую костимулирующие молекулы, такие как В7.1 и В7.2, лиганды для CD28 и CTLA-4 соответственно можно также доставить для повышения иммунитета, обеспечиваемого Т клетками. Эти гены можно доставить совместно с генами цитокинов, используя те же самые или другие промоторы, и необязательно с внутренним связывающим рибосомы сайтом. Аналогично, экспрессия -1,3-галактозил-трансферазы на опухолевых клетках обеспечит умерщвление клеток, опосредствованное комплементом.

Кроме того, приобретенные или комплексные мультиспецифические заболевания, такие как дефицит эритропротеина, вызванный почечной недостаточностью, болезнь Паркинсона (дефицит допамина), надпочечниковая недостаточность, иммунодефицит, циклическая нейтропения, можно лечить, используя терапевтические гены, доставляемые лигандами. В некоторых случаях желателен рост сосудов. Так как клетки гладкой мускулатуры выстилают сосуды, выгодна доставка эндотелиальных факторов роста, таких как FGF, особенно FGF2, VEGF, tie1 и tie2, через клетки гладкой мускулатуры.

В. Гены, кодирующие протеиновые цитоциды (включая пролекарства)

Цитоцид-кодирующим агентом является молекула нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), которая после интернализации клеткой и последующей транскрипции (если это ДНК) и/или трансляции в продукт становится цитотоксичной или цитостатичной для клетки, например, ингибируя клеточный рост за счет нарушения синтеза протеинов или в результате нарушения клеточного цикла. Такой продукт может действовать, расщепляя рРНК или рибонуклеопротеин, ингибируя фактор удлинения, расщепляя мРНК, или вследствие другого механизма, который уменьшает синтез протеина до такого уровня, что клетки не выживают. Этот продукт может быть протеином, рибозимом, дезоксирибозимом, антисмысловым и т.п.

Примеры подходящих продуктов включают, без ограничений, сапорин, рицины, абрин, другие инактивирующие протеины рибосомы (RIP), экзотоксин Pseudomonas, ингибиторы ДНК, РНК или синтеза протеинов, антисмысловые нуклеиновые кислоты, другие ингибиторы метаболизма (например, молекулы, расщепляющие ДНК), пролекарства (например, тимидинкиназа из HSV и бактериальная цитозиндеаминаза), активируемый светом порфирин, рицин, А цепь рицина, RIP кукурузы, гелонин, токсин дифтерии, А цепь токсина дифтерии, трихозантин, тритин, противовирусный протеин лаконоса (РАР), противовирусный протеин мирабилиса (MAP), диантинус 32 и 30, абрин, монордин, бриодин, шига, каталитический ингибитор биосинтеза протеина из семян огурца (например, WO 93/24620) экзотоксин Pseudomonas, биологически активные фрагменты цитотоксинов и другие известные специалистам.

Предпочтительны молекулы ДНК, которые кодируют фермент, приводящий к гибели клеток, или усиливает подверженность клеток гибели после добавления другого продукта. Инактивирующие рибосомы протеины (RIP), которые включают рицин, абрин и сапорин, являются растительными протеинами, которые каталитически инактивируют рибосомы эукариотов. Инактивирующие рибосомы протеины инактивируют рибосомы, вмешиваясь в синтез протеина на стадии удлинения протеина. Например, инактивирующий рибосомы протеин сапорин является ферментом, который расщепляет рРНК и ингибирует синтез протеинов. Другие ферменты, которые ингибируют синтез протеинов, являются особенно подходящими для целей настоящего изобретения. Любые из этих протеинов, если не получены из млекопитающих, могут использовать предпочтительные для млекопитающих кодоны. Примеры предпочтительного использования кодонов см. в Current Protocols in Molecular Biology, и у Zhang et al. (Gene 105:61, 1991).

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пролекарство, может быть альтернативно использована в контексте настоящего изобретения. Пролекарства неактивны в клетке хозяина до тех пор, пока не появляется либо субстрат, либо активирующая молекула. В том смысле, как здесь использован, термин "пролекарство" обозначает соединение, которое в результате метаболизма или как-либо иначе превращает неактивное, нетоксичное соединение в биологически, фармацевтически, терапевтически или токсически активную форму соединения, или модифицируется после введения, образуя активное соединение в результате метаболизма или других процессов. Чаще всего пролекарство активирует соединение с незначительной цитотоксичностью или без цитотоксичности в токсическое соединение. Две из наиболее часто используемых молекул пролекарств, пригодные для целей настоящего изобретения, являются HSV тимидинкиназой и E.coli цитозиндеаминазой.

Короче, широкий круг генных продуктов, которые либо непосредственно, либо косвенно активируют соединение с незначительной цитотоксичностью (или вовсе без нее) в токсический продукт, можно использовать в контексте настоящего изобретения. В качестве примеров таких генных продуктов можно привести HSVTK (тимидинкиназу вируса герпес симплекс) и VZVTK (тимидинкиназу вируса варицелла зостер), которые селективно фосфорилируют некоторые пуринарабинозиды и замещенные пиримидиновые соединения. Фосфорилирование превращает эти соединения в метаболиты, которые являются цитотоксичными или цитостатичными. Например, экспонирование лекарств ганцикловира, ацикловира или любого из их аналогов (например FIAU, FIAC, DHPG) клеткам, экспрессирующим HSVTK, обеспечивает превращение лекарства в его соответствующую активную нуклеотидтрифосфатную форму.

Другие генные продукты, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения включают E.coli гуанинфосфорибозил-трансферазу, которая превращает тиоксантин в токсичную тиоксантинмонофосфатную форму. (Besnard et al. , Mol. Cell. Biol. 7:4139-4141, 1987); щелочную фосфатазу, которая превращает неактивные фосфорилированные соединения, такие как митомицин-фосфат и доксорубицин-фосфат в токсичные дефосфорилированные соединения; грибковую (например, Fusarium охуsporum) или бактериальную цитозин-деаминазу, которая превращает 5-фторцитозин в токсичное соединение 5-фторурацил (Mullen, PNAS 89: 33, 1992); карбоксипептидазу G2, которая отщепляет глутаминовую кислоту от napa-N-бис(2-хлорэтил)аминобензоилглутаминовой кислоты, создавая при этом токсичную мустард бензойную кислоту; и пенициллин-V-амидазу, которая превращает производные доксорубицина и мелфалана в токсичные соединения (Vrudhula et al., J. of Med. Chem. 36(7):919-923, 1993; Kern et al., Canс. Immun. Immunother. 31(4):202-206, 1990). Более того, пригоден широкий круг Herpesviridae тимидинкиназ, включая вирусы герпеса как приматов, так и не приматов. Такие вирусы герпеса включают простой вирус герпеса типа 1 (McKnight et al., Nuc, Acids Res 8:5949-5964, 1980), простой вирус герпеса типа 2 (Swain и Galloway, J.Virol. 46:1045-1050, 1983), опоясывающий вирус Варицелла. (Davison и Scott, J.Gen.Virol. 67:1759-1816, 1986), вирус герпеса игрунка (Otsuka и Kit, Virology 135:316-330, 1984), кошачий вирус герпеса типа 1 (Nunberg et al., J.Virol. 63:3240-3249, 1989), вирус псевдобешенства (Kit и Kit, патент США 4514497, 1985), лошадиный вирус герпеса типа 1 (Robertson и Whalley, Nuc. Acids Res. 16:11303-11317, 1988), бычий вирус герпеса типа 1 (Mittal и Field, J.Virol 70:2901-2918, 1989), индюшачий вирус герпеса (Martin et al., J.Virol. 63:2847-2852, 1989), вирус болезни Марека (Scott et al. , J. Gen. Virol. 70:3055-3065, 1989), вирус герпеса Саимири (Honess et al. , J.Gen, Virol. 70:3003-3013, 1989) и вирус Эпштейна-Барра (Baer et al., Nature (London) 310:207-311, 1984). Такие вирусы герпеса можно легко получить из коммерческих источников, таких как American Type Culture Collection ("ATCC"; Manassas, VA).

Кроме того, как указано выше, широкий круг неактивных предшественников можно превратить в активные ингибиторы. Например, тимидинкиназа может фосфорилировать нуклеозиды (например, dT) и аналоги нуклеозидов, такие как ганцикловир (9-{ [2-гидрокси-1-(гидроксиметил)этоксил метил}гуанозин], фамцикловир, буцикловир, пенцикловир, валцикловир, ацикловир (9-[2-гидрокси этокси)метил]гуанозин), трифтортимидин, 1-[2-дезокси, 2-фтор, бета-D-арабино фуранозил] -5-иодоурацил, ара-А (аденазин-арабинозид, виварабин), 1-бета-D-арабинофураноксил тимин, 5-этил-2"-дезоксиуридин, 5-иодо-5"-амино-2,5"-дидезоксиуридин, идоксиуридин (5-йодо-2"-дезоксиуридин), AZT (3" азидо-3" тимидин), ddC (дидезоксицитидин), AIU (5-иодо-5" амино 2",5"-дидезоксиуридин) и АrаС (цитидинарабинозид). Другие генные продукты могут делать клетки подверженными токсическим агентам. Такие продукты включают фактор некроза опухоли, вирусные протеины и мембранные протеины, которые транспортируют лекарства.

Более того, цитоцид-кодирующий агент можно сконструировать как пролекарство, которое, будучи экспрессировано в клетки подходящего типа, процессируется или модифицируется в активную форму. Например, ген сапорина можно сконструировать с N- или С-терминальными липкими концами, содержащими протеазочувствительный сайт. Липкие концы делают исходно транслированный протеин неактивным, и последующее расщепление в клетке, экспрессирующей соответствующую протеазу, возвращает ферментную активность.

Последовательности ДНК этих продуктов хорошо известны (GenBank). Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую одну из них, можно выделить стандартными способами, такими как амплификация (например, ПЦР), зондовая гибридизация геномной или кДНК библиотек, скринирование антителами экспрессионных библиотек, химический синтез, или их можно получить из коммерческих или других источников.

Дополнительные типы цитоцидов, которые можно доставить способами настоящего изобретения, являются молекулы антител, которые предпочтительно экспрессированы внутри целевых клеток, поэтому этим молекулам антител было дано название "интратела". Обычные способы получения антител и их секвенирования можно использовать для получения интрател и кодирующих их последовательностей нуклеиновых кислот, именно сайт действия интрател придает определенную новизну таким молекулам. (Для обзора различных способов и композиций, полезных для изменения функций протеинов в клетках в результате использования интрател, см. опубликованную международную заявку WO 96/07321).

Интратела представляют собой антитела и производные антител (включая одноцепочечные антитела или "SCA"), введенные в клетки как трансгены, которые связываются с внутриклеточным протеином или инкапсулируются в нем в клетках, которые экспрессируют антитела. В том смысле, как здесь использован термин, интратела охватывают моноклональные, одноцепочечные антитела, V участки и т. п., если только они связываются с целевым протеином. Интратела к протеинам, которые участвуют в репликации клеток, опухолегенезе и т.п. (например, HER2/neu, VEGF, VEGF рецептор, FGF рецептор, FGF) особенно полезны.

Например, антитела к HER2/neu (называемые также еrbВ-2) можно использовать для ингибирования функций этого протеина. HER2/neu играет центральную роль в развитии некоторых опухолей молочной железы и яичников человека, а также карциномы легких. Так, ингибирование функций HER2/neu может привести к замедлению или остановке роста опухоли (например, патент США 5587458). С учетом того факта, что HER2/neu является рецепторным протеином, он может также функционировать как "мишень" для антитела, конъюгированного с поверхностью фаговой частицы, как далее раскрыто по всему описанию.

С. Антимысловые последовательности и рибозимы

Представленные здесь конъюгаты можно также использовать для доставки рибозима, антисмысловой последовательности, и т.п. к целевым клеткам. Такие продукты включают антисмысловые РНК, антисмысловые ДНК, рибозимы, дезоксирибозимы, образующие триплекс олигонуклеотиды и олигонуклеотиды, которые связывают протеины. Нуклеиновые кислоты могут также включать РНК транспортные сигналы, такие как последовательности упаковки вирусов (например, Sullenger et al., Science 262:1566, 1994).

Нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды, предназначенные для использования как раскрыто выше, можно синтезировать любым известным специалистам способом (например, WO 93/01286, заявку США 07/723454, патенты США 5218088, 5175269, 5109124). Идентификация олигонуклеотидов и рибозим для использования в качестве антисмысловых агентов и ДНК кодирующих генов для целевой доставки при генной терапии включает известные специалистам способы. Например, нужные свойства, длины и другие характеристики таких олигонуклеотидов хорошо известны. Антисмысловые олигонуклеотиды можно сконструировать так, чтобы они были устойчивы к расщеплению под действием эндогенных нуклеолитических ферментов, используя связи, такие как фосфоротиолат, метилфосфонат, сульфон, сульфат, кетил, фосфородитиоат, фосфороамидат, сложные фосфатные эфиры и т. п. (например, Stein в: Oligodeoxynucleotides. Аntisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, с. 97-117, 1989); Jager et al., Biochemistry 27:7237, 1988).

Антисмысловыми нуклеотидами являются олигонуклеотиды, которые связываются последовательность-специфическим образом с нуклеиновыми кислотами, такими как мРНК или ДНК. Будучи связаны с мРНК, которая содержит комплементарные последовательности, антисмысловой олигонуклеотид предотвращает трансляцию мРНК (например патенты США 5168053, 5190931, 5135917, 5087617). Триплексные молекулы относятся к сигнальным ДНК цепочкам, которые связывают дуплекс ДНК, образуя колинеарную триплексную молекулу, предотвращая тем самым транскрипцию (например патент США 5176996).

Особенно полезными антисмысловыми нуклеотидами и триплексными молекулами являются молекулы, которые комплементарны или связаны со смысловой цепочкой ДНК или мРНК, которые кодируют протеин, участвующий в клеточной пролиферации, такой как онкоген или фактор роста, (например, bFGF, int-2, hst-1/K-FGF, FGF-5, hst-2/FGF-6, FGF-8). Другие полезные антисмысловые олигонуклеотиды включают те, которые специфичны для IL-8 (например, патент США 5241049), c-src, c-fos H-ras (рак легких), K-ras (рак молочной железы), урокиназа (меланома), BCL2 (лимфома Т-клеток), IGF-1 (глиобластома), IGF-1 рецептор (глиобластома), TGF-1 и CRIPTO EGF рецептор (рак толстой кишки). Эти конкретные антисмысловые плазмиды снижают опухолегенность у атимичных и сингенных мышей.

Рибозим является РНК молекулой, которая специфически расщепляет РНК субстраты, такие как мРНК, что приводит к ингибированию или нарушению роста клеток или экспрессии. Существует, по крайней мере, пять классов рибозимов, принимающих участие в расщеплении и/или лигировании РНК цепей. Рибозимы можно направить к любому РНК транскрипту, и они могут каталитически расщепить этот транскрипт (например, патент США 5272262, патент США 144019 и патенты США 5168053, 5180818, 5116742 и 5093246).

Кроме того, ингибиторы или индуцируемая синтаза окиси азота (NOS) и эндотелиальная синтаза окиси азота являются цитоцидами, которые пригодны для доставки к клеткам. Предполагается, что окись азота (NO) участвует в регуляции роста сосудов и тонуса при атеросклерозе. NO образуется из L-аргинина за счет синтазы окиси азота (NOS) и изменяет иммунную, воспалительную и сердечно-сосудистую реакцию.

Как здесь раскрыто, фаговые векторы настоящего изобретения можно использовать для доставки различных терапевтических последовательностей к целевым клеткам. В различных вариантах терапевтические последовательности кодируют или включают ферментные ДНК и/или РНК молекулы, которые способны расщеплять другие молекулы нуклеиновых кислот, включая молекулы ДНК, молекулы РНК и их гибриды. Так, векторы экспрессии, полезные в таких вариантах, также включены в объем настоящего изобретения (например, опубликованные международные заявки WO 92/06693, WO 96/17086 и WO 95/31551; и патенты США 4987071, 5580967 и 5595873, раскрытие которых включено сюда по ссылке).

Вкратце, используя ферментные РНК молекулы ("рибозомы") в качестве примера, способ создания векторов экспрессии ферментных РНК молекул включает обеспечение вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую первый рибозим, и обеспечение одноцепочечной ДНК молекулы, кодирующей второй рибозим. Затем одноцепочечную ДНК подвергают отжигу с образованием частично дуплексной ДНК, которую можно достроить в результате обработки подходящим ферментом, таким как ДНК полимераза, в присутствии dNTPs с образованием дуплексной ДНК, которую затем можно лигировать в вектор.

Затем можно выбрать крупные векторы, получающиеся в результате использования этого способа, чтобы убедиться, что большое число копий одноцепочечной ДНК, кодирующей ферментную РНК молекулу, включено в вектор. Подходящие сайты рестрикционных эндонуклеаз также можно обеспечить для облегчения конструирования такого вектора в ДНК векторах или в реквизитных ДНК векторах РНК экспрессионной системы.

Настоящее изобретение также раскрывает экспрессию векторов, включая сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующей ферментную ДНК или РНК молекулу, предпочтительно таким способом, который позволяет осуществить экспрессию этой НК молекулы в целевой клетке. Так, обычно вектор экспрессии, применяемый вместе с рибозимами или дезоксирибозимами, включает бактериальный, вирусный или эукариотный промотор в плазмидном, космидном, фагемидном, вирусном, вироидном или фаговом векторе. Другие подходящие векторы включают двухцепочечную ДНК (dsDNA), частично двухцепочечную ДНК, двухцепочечную РНК (dsRNA), частично двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК (ssRNA) или ДНК (ssDNA). Следует учитывать, что подходящие векторы настоящего изобретения не должны быть замкнутыми.

Предпочтительно также, чтобы нуклеотидная последовательность, кодирующая ферментную НК молекулу, была транскрипционно связана с промоторной последовательностью. Например, вектор настоящего изобретения может включать ферментную РНК молекулу под контролем вирусного промотора, такого как промотор вируса Эпштейн-Барра (EBV). Специалистам известны различные вирусные промоторы, пригодные для этой цели, (например, те, которые раскрыты в опубликованной РСТ заявке WO 93/23569, включенной сюда в качестве ссылки).

В другом варианте в вектор могут быть включены одна или более из дополнительных нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферментную РНК молекулу, причем указанные дополнительные последовательности, кодирующие ферментную РНК молекулу, могут быть расположены с любой стороны или с обеих сторон нуклеотидной последовательности, кодирующей первую ферментную РНК молекулу. Предпочтительно, чтобы существовали прерывающие нуклеотиды или нуклеотидные последовательности между последовательными последовательностями, кодирующими ферментную РНК молекулу.

Если необходима доставка вектора, включающего рибозимную или дезоксирибозимную конструкцию, к эукариотной клетке, клеточные сплайсинговые механизмы в целевой клетке (клетках) можно использовать или интегрировать для отщепления терапевтической второй ферментной РНК молекулы (молекул) путем кодирования распознающих последовательностей для вторых ферментных РНК молекул внутри фланкирующих последовательностей экспрессированного транскрипта. Можно обеспечить множественные копии выделенной первой ферментной РНК молекулы для усиления выделения второй (т.е. терапевтической) ферментной РНК молекулы, если скорость превращения меньше, чем скорость расщепления второй ферментной РНК молекулы.

Способы создания векторов экспрессии ферментной РНК молекулы и продуцирования ферментных РНК молекул описаны более подробно в вышеуказанных опубликованных заявках и выданных патентах, включенных сюда в качестве ссылки.

V. КОМПОЗИЦИИ И ВВЕДЕНИЕ НОСИТЕЛЕЙ ДОСТАВКИ

Предложенные здесь конъюгаты и комплексы применимы для лечения и профилактики различных заболеваний, синдромов и гиперпролиферативных нарушений, таких как рестеноз, других заболеваний клеток гладкой мускулатуры, опухолей, таких как меланомы, рак яичников, нейробластомы, птеричий, вторичное помутнение хрусталика, и т. п. В том смысле, как здесь использован, термин "лечение" означает любой способ, при котором симптомы состояния, нарушения или заболевания ослабляются или как-либо изменяются в благоприятную сторону. Лечение также охватывает любое фармацевтическое использование композиций настоящего изобретения. В том смысле, как здесь использован, термин "ослабление" симптомов конкретного нарушения относится к любому уменьшению независимо от того, временное оно или постоянное, длительное или кратковременное, которое можно приписать или связать с введением композиции.

В некоторых вариантах композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения ангиогенеззависимых заболеваний. При таких заболеваниях наблюдается избыточный рост сосудов или нежелательный рост других тканей за счет притока крови. Такие заболевания включают ангиофиброму, артериовенозные злокачественные новообразования, артриты, атеросклеротические бляшки, неоваскуляризацию трансплантатов роговицы, замедленное заживление ран, диабетическую ретинопатию, грануляции, связанные с ожогами, гемангиомы, гемофилию суставов, гипертрофированные рубцы, неоваскулярную глаукому, переломы со смещением, синдром Osler-weber, псориаз, пиогенную гранулему, ретролентальную фиброплазию, склеродерму, твердые опухоли, трахому и слипание сосудов.

Путем ингибирования образования сосудов (ангиогенез), нежелательный рост можно замедлить или предотвратить, тем самым ослабив заболевание. В нормальном сосуде монослой эндотелиальных клеток выстилает просвет, и рост сосуда требует пролиферации эндотелиальных клеток и клеток гладкой мускулатуры.

Фаги настоящего изобретения можно также использовать для лечения опухолей. При этих заболеваниях рост клеток избыточен, или не поддается контролю. Опухоли, которые можно лечить в контексте настоящего изобретения, включают (но ими не ограничиваются) опухоли молочной железы, глиомы, меланомы, рак простаты, гепатомы, саркомы, лимфомы, лейкемии, опухоли яичников, тимомы, нефромы, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки, рак головы и горла, рак желудка, рак легких, мезотелиомы, миеломы, нейробластомы, ретинобластомы, рак шейки матки, рак матки и карциному сквамозных клеток кожи. Для такого лечения выбирают такие лиганды, которые связываются с рецепторами клеток поверхности, которые обычно преимущественно экспрессируются в опухолях.

За счет доставки композиций настоящего изобретения нежелательный рост клеток можно замедлить или прекратить, тем самым ослабив заболевание. Способы, используемые в настоящем изобретении, специфически метят и убивают опухолевые клетки или прекращают пролиферацию опухолевых клеток, которые содержат рецепторы для лигандов на своих поверхностях.

Фаги также можно использовать для лечения или предотвращения атеросклероза и стеноза, процесс и возникающее вследствие этого состояние которых наблюдаются после ангиопластики, при которой наблюдается повторная закупорка артерий. Обычно лечение атеросклероза включает расширение просвета стенозного сосуда, обеспечивая больший поток крови и оксигенацию периферических тканей. К сожалению, эти процедуры вызывают обычные реакции заживления в сосудах, что приводит к рестенозу. Из трех компонентов нормальной реакции сосудов на повреждение, тромбоз, эластичную тягу и пролиферацию клеток гладкой мускулатуры, антитромботические/тромбоцитные ингибиторы и сосудистые стенты эффективно помогают при острых/подострых трмбозах и эластичной тяге соответственно. Однако никакая терапия не может изменить ремоделирование сосуда, которое связано с пролиферацией клеток гладкой мускулатуры в месте поражения, и отложение внеклеточной матрицы и последующее образование неоинтимы. Соответственно фаги можно использовать для доставки терапевтических нуклеоиновых кислот или протеинов, которые могли бы ингибировать рестеноз.

Раневая реакция наблюдается также после других вмешательств, таких как баллонная ангиопластика коронарных и периферических сосудов с или без стентов, каротидные эндартерэктомии; трансплантаты вен и синтетические трансплантаты периферических артерий и артериовенозные шунты. Хотя временной характер раневых реакций не вполне определен, длительного преимущества можно достичь, если такую реакцию можно подавить в течение короткого промежутка времени (примерно 2 недели).

В некоторых вариантах бактериофаги настоящего изобретения можно использовать для лечения различных генетических нарушений, таких как дефицит важных функциональных ферментов. Примеры таких заболеваний включают болезнь Гошера (дефицит глюкоцереброзидазы), мукополисахаридоз (дефицит бета-глюкуронидазы), гипераммонемию (дефицит оринитин-транскарбамилазы) и др.

Специалистам должно быть ясно, что фаги настоящего изобретения можно доставить in vivo путем введения индивидууму обычно путем системного введения (например, перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно или интракраниально) или путем местного применения (например, через кожу и мембраны слизистой оболочки). Используемые направленные лиганды, бактериофаги настоящего изобретения способны направляться к клеткам конкретного типа для трансдукции.

В другом варианте фаги настоящего изобретения можно доставить в клетки ex vivo. Ex vivo лечение предусматривает извлечение или удаление популяции клеток у пациента, трансдукцию с помощью бактериофага, содержащего терапевтическую нуклеиновую кислоту, и реимплантацию в организм пациента. Примеры процедур для осуществления обобщенной ех vivo генной терапии раскрыты в патентах США 5399346 и 5665350. Кроме того, клетки, которые были трансдуцированы фагами ех vivo, можно повторно вводить пациенту или животному способами, которые хорошо известны. (например, патенты США 5399346, 5665350, РСТ публикацию WO 92/15676 (заявляющую приоритет по США серийному 667169), РСТ публикацию WO 90/06997 (заявляющую приоритет по США серийному 283586)).

Примеры клеточных популяций для ех vivo трансдукции включают клетки костного мозга, клетки печени, клетки поджелудочной железы, все гемопоэтичные клетки и пупочные клетки. Такие клетки можно обработать для выделения нужной клеточной популяции для трансдукции, например, для получения специфического субнабора клеток для трансдукции. Предпочтительные способы очистки включают различные методики сортинга клеток, такие как пэннинг антител, FАСS и афинная хроматография, использующая матрицу с присоединенными антителами, специфически реакционноспособными с нужным субнабором клеток. Затем выделенные клетки можно трансдуцировать и повторно вводить пациенту или в другом варианте клетки можно размножить в культуре перед повторным введением.

А. Получение фармацевтических агентов

Фармацевтические носители или агенты доставки, пригодные для введения конъюгатов и комплексов, здесь представленные, включают любой из таких носителей, который, как известно специалистам, пригоден для конкретного способа введения. Кроме того, бактериофаг можно приготовить как отдельный фармацевтически активный ингредиент в композиции или можно объединить с другими активными ингредиентами.

Бактериофаг можно вводить любым подходящим способом, например перорально, парентерально, включая внутривенное, чрезкожное, подкожное и местное введение, в жидкой, полужидкой или твердой форме, после приготовления его в форме, подходящей для каждого из способов введения. Предпочтительные способы введения зависят от лечебных показаний.

Бактериофаг можно подготовить в виде фармацевтических композиций, пригодных для локального, внутривенного и системного введения. Желательны также формы с отсроченным по времени выделением. Эффективные концентрации бактериофага смешивают с подходящим фармацевтическим носителем или агентом доставки. В том смысле, как здесь использован, термин "эффективное количество" соединения для лечения конкретного заболевания является таким количеством, которого достаточно для ослабления или каким-либо другим способом уменьшения симптомов, связанных с этим заболеванием. Такие количества можно вводить в виде единичной дозы или можно вводить в соответствии со схемой, если это эффективно. Это количество может вылечить заболевание, но обычно его вводят с целью ослабления симптомов заболевания. Для достижения необходимого ослабления симптомов может понадобиться повторное введение.

Фаговые векторы настоящего изобретения особенно подходят для перорального введения, и обладают способностью доставлять терапевтические генные последовательности на системном уровне в отличие от большинства векторов доставки генов, находящихся в настоящее время на стадии проверки и использования. Как было указано выше, фаги способны выдерживать жесткие условия окружающей среды и такие условия, как те, которые наблюдаются обычно в пищеварительном тракте млекопитающих; таким образом, они идеально подходят для приготовления и для введения пероральных/системных композиций. Дополнительным преимуществом раскрытых здесь векторов является тот факт, что многие из лигандов, описанных здесь как предпочтительные варианты, являются протеазоустойчивыми, такие лиганды особенно предпочтительны для использования в рецептурах и композициях, созданных для перорального/системного введения.

Терапевтически эффективные концентрации и количества можно определить эмпирически, тестируя конъюгаты и комплексы в известных in vitro и in vivo системах, таких, как здесь описаны; дозы для людей или других животных можно экстраполировать из них. Бактериофаг включен в фармацевтически приемлемый носитель в количестве, которого достаточно для проявления терапевтически полезного эффекта в отсутствии нежелательных побочных эффектов в отношении пациента. Фаг можно доставить в виде фармацевтически приемлемых солей, сложных эфиров или других производных конъюгатов, включая любые соли, сложные эфиры или производные, которые могут легко получить специалисты, используя известные методы для таких модификаций, в результате которых получают соединения, которые можно вводить животным или людям без существенных токсичных эффектов. Следует учитывать, что число и степень побочных эффектов зависит от состояния, для лечения которого вводят эти конъюгаты и комплексы. Например, некоторые токсичные и нежелательные побочные эффекты могут допускаться при лечении угрожающих жизни заболеваний, таких как опухоли, тогда как они недопустимы при лечении менее угрожающих заболеваний.

Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного, подкожного или местного введения могут включать любой из следующих компонентов: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, густое масло, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антимикробные агенты, такие как бензиловый спирт и метилпарабен, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота и бисульфит натрия, хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); буферы, такие как ацетаты, цитраты и фосфаты; и агенты для регулирования токсичности, такие как хлорид натрия или декстроза. Препараты для парентерального введения могут быть заключены в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы, содержащие множество доз, выполненные из стекла, пластика или других подходящих материалов.

Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор или физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) и растворы, содержащие загущающие и солюбилизирующие агенты, такие как глюкоза, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль и их смеси. Липосомные суспензии также можно использовать в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Их можно получить в соответствии с известными специалистам методами.

Фаг может также быть смешан с другими активными материалами, которые не придают необходимого действия, или с материалами, которые дополняют необходимое действие.

Фаги можно приготовить с носителями, которые предотвращают их быстрое выведение из организма так, чтобы обеспечить композиции с замедленным выделением или с нанесенным покрытием. Такие носители включают композиции с контролируемым выделением, такие как (но ими не ограничиваются) имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки, и биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, сложные полиортоэфиры, полимолочная кислота и другие. Например, композицию можно нанести во время хирургической операции, используя тампоны, такие как коммерчески доступные тампоны (например, патенты США 3956044 и 4045238), пропитанные фагом. Фаг можно также принимать в виде пилюль (таких как пилюли Элвакса (сополимерная смола этилен-винилацетат)). Предпочтительные в этом плане носители включают генактивированную матрицу (GAM), как раскрыто в РСТ публикации WO 97/38729 (заявленный приоритет по США серийному номеру 08/631334) и РСТ публикация WO 95/22611 (заявленный приоритет по США серийному номеру 08/199780 и 08/316650). Короче, ген-активированная матрица является матрицей из любого материала, содержащей ДНК, кодирующую терапевтический агент, например бактериофаг настоящего изобретения. Далее предпочтительно, чтобы такие ген-активированные матрицы были получены из любого биосовместимого материала.

Если желательно пероральное введение, фаг следует ввести в композицию, которая защитит его от кислотной среды желудка, например в желудочное покрытие, или использовать в сочетании с антацидом. В другом варианте высушенные замораживанием бактерии, которые "инфицированы" фагом, можно использовать для целей перорального введения, так как они обладают способностью размножаться в кишечнике и выделять фаг.

Обычно композиции для перорального введения включают инертный разбавитель или съедобный носитель и могут быть спрессованы в таблетки или заключены в желатиновые капсулы. Таблетки, пилюли, капсулы, лепешки и т.п. могут содержать любые из следующих ингредиентов или соединений аналогичного характера: связующее, такое как микрокристаллическая целлюлоза, смола трагаканта и желатин; наполнитель, такой как крахмал и лактоза, разрыхляющий агент, такой как (но ими не ограничиваются) альгиновая кислота и кукурузный крахмал; смазывающий агент, такой как (но ими не ограничиваются) стеарат магния; скользящее, такое как (но ими не ограничиваются) коллоидная двуокись кремния; подслащивающий агент, такой как сахароза или сахарин, и корригент, такой как мята, метилсалицилат и фруктовые вкусовые добавки. Если единичная дозовая форма представляет собой капсулу, она может содержать помимо материала вышеуказанного типа такой жидкий носитель, как жирное масло.

И наконец, соединения могут быть упакованы согласно заводским технологиям по использованию упаковочного материала, один или более из конъюгатов и комплексов или композиций, предложенных в настоящем изобретении, внутри упаковочного материала, и метки, которые содержат указания относительно показаний, для которых предназначен конъюгат.

В. Тестирование конструкций

Носители для доставки нуклеиновых кислот могут быть проанализированы в любой из множества in vitro и in vivo модельных систем. Как здесь обсуждалось и как показано в примерах, фаг должен связываться с клеткой специфическим образом и интернализоваться (по-видимому, по эндосомальной схеме). Более

того, трансген должен экспрессироваться клетками хозяина (целевыми клетками). Так, подходящие анализы включают, без ограничений, анализ связывания для проверки того, что фаги присоединились к целевым клеткам, анализ вытеснения, чтобы показать, что фаг может быть вытеснен избытком свободного лиганда, и анализ интернализации, чтобы продемонстрировать, что фаги интернализованы (Barry et al., см. выше; Dunn, выше; и Hart et al., выше), и функциональный анализ, чтобы показать, что трансген активен в клетках хозяина (например, США, предварительный серийный номер 60/057067).

Нижеследующие примеры предложены с целью иллюстрации и не являются ограничительными.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Получение фагемидных частиц

Фагемид pEGFP-N1 (Clontech; Palo Alto, CA) содержит ген флуоресцирующего зеленым протеина (GFP) под контролем CMV предраннего промотора. CMV отличается высокой активностью в большом числе клеточных линий млекопитающих, однако можно использовать и другие промоторы клеток млекопитающих. RC-CMVb фагемид является производным pRC-CMV (InVitrogen; San Diego, CA). Ген lacZ E.coli встраивают в pRC-CMV фагемид по EcoRV сайту мультиклонирования, расположенному в прямом направлении от CMV промотора, для получения pRC-CMVb. Оба фагемида содержат три начала ДНК репликации: pUC начало репликации как двухцепочечной плазмиды в E.coli; F1 начало репликации как одноцепочечной фаговой ДНК, и SV40 начало для большого числа копий репликаций в COS-1 (большое содержание Т-антигена) клетках млекопитающих. Они также содержат ген неомицинфосфотрансферазы, регулируемый SV40 ранним генным промотором, который придает устойчивость к антибиотику G418, будучи экспрессирован в клетки млекопитающих (Southern и Berg, J.Mol. Appl. Genet. 1:327-341, 1982).

Фагемид pEGFP-N1 размножают в E. coli штамме-хозяине, DH5F", чтобы обеспечить суперинфицирование М13 хелперным бактериофагом, М13К07. Фагемидные частицы получают известными способами (например Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989; и Rider et al. в Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996). Свежую бактериальную колонию, содержащую pEGFP-Nl, суспендируют в 3 мл 2Х YT среды, М13К07 добавляют до конечного титра 2Х10⁷ бое/мл и культуру инкубируют в течение 1 часа при 37^oС. Добавляют канамицин до конечной концентрации 70 мкг/мл и инкубирование продолжают в течение 14-18 часов. Бактериальную культуру осаждают при 12000g в течение 10 минут и надосадочную жидкость переносят в свежую ампулу. Фагемидные частицы осаждают, добавляя 1/3 объема 30% полиэтиленгликоля (PEG)-1,5 M NaCl. Раствор центрифугируют и охлаждают в течение 1 часа на льду и в течение ночи при 4^oС. Фаг осаждают центрифугированием при 12000g в течение 10 минут при 4^oС. Осадок осторожно сливают и снова суспендируют в 1/10 исходного объема PBS (буферированный фосфатом физиологический раствор рН 7,4). PEG осаждение повторяют и осадок снова суспендируют в 1/20 объема PBS. Фагемидную суспензию предварительно пастеризуют, нагревая при 65^oС в течение 5 минут, фильтруют через 0,45 мкМ фильтр и хранят при 4^oС.

ПРИМЕР 2

Получение модифицированных векторов для трансдукции клеток млекопитающих

Экспрессионную кассету млекопитающих встраивают в вектор на основе фага или фагемида и используют для определения опосредствованного лигандом включения фага за счет экспрессии репортерного гена в клетках млекопитающих. Нитевидный фаговый вектор типа 3 модифицируют для трансдукции клеток млекопитающих, встраивая GFP экспрессионную кассету, содержащую CMV промотор транскрипции млекопитающих, флуоресцирующего зеленым ген протеина, из pEGFP-N1 (Clontech; Palo Alto, CA), терминатор транскрипции бычьего гормона роста и сигнал полиаденилирования для получения вектора MEGFP3 (фиг.1А). Экспрессионная кассета млекопитающих содержит также SV40 начало репликации, присоединенный к CMV промотору. Аналогичные конструкции для контроля за включением с последующей экспрессией геномов фагов в клетках млекопитающих создают из других векторов на основе фагов или фагемидов, включая pCANTAB 5 Е (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) или М13 типа 3 или 33 для слияний гена III (Кау, В. К. et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996, McConnell, S.J. et al., Mol. Divers. 1:165-176, 1996) и М13 типа 8 или 88 вектор для слияний с протеином гена VIII (Roberts et al., Methods Enzymol. 267:68-82, 1996; Markland, W. et al., Gene 109:13-19, 1991).

ПРИМЕР 3

Связывание FGF с фагемидными частицами с использованием авидин-биотина

Одним из способов направленной доставки фага к FGF рецепторам является связывание фага с FGF с помощью авидин-биотина. Такой комплекс FGF-фаг собирают в присутствии тестируемых клеток при 0^oС с последующим инкубированием при 37^oС для обеспечения интернализации. Подвергнутый мутации FGF, FGF2-3 (Cys остатка 96 изменен в результате мутации на Ser) (Sosnowski et al., J. Biol. Chem. 271: 33647-33653, 1996) конъюгируют с биотином по одной свободной сульфгидрильной группе, используя биотин-ВМСС (Pierce; Rockford, IL) в соответствии с рекомендациями изготовителей. Непрореагировавший биотин удаляют, пропуская реакцию через PD-10 обессоливающую колонку. При необходимости биотинилированный трансферин покупают в Sigma (St. Louis, МО), а биотинилированный EGF покупают в Molecular Probes (Eugene, OR).

Клетки COS инкубируют в 12 ячеечных пластинах при концентрации 20000 кл/ячейку в течение примерно 24 часов перед добавлением фага. Клетки промывают дважды в ледяном PBS/FBS (PBS с 2% плодной бычьей сывороткой). Затем добавляют 1,2 мкг B-FGF (биотинилированный FGF) на льду в течение 15 минут. Добавляют нейтравидин (NAV; нейтральный без углеводов авидин; Pierce, Rockford, IL) в концентрации 10 мкг/мл в 1 мл PBS/FBS в течение 15 минут на льду. Клетки повторно промывают и добавляют биотинилированное анти-М13 антитело (овечий анти-М13-биотин, 5 Prime --> 3 Prime, Inc.; Boulder, CO) в концентрации 10 мкг/мл в 1 мл PBS/FBS в течение 15 минут на льду. Клетки снова промывают и в каждую ячейку добавляют 10⁸ колонийобразующих единиц в 1 мл PBS/FBS в течение 1 часа на льду. Клетки снова промывают, снова суспендируют в свежей среде и возвращают в инкубатор при 37^oС. GFP экспрессию в клетках контролируют с помощью флуоресцентной микроскопии (Nikon Diaphot инвертированный микроскоп), используя набор флуоресцеиновых фильтров (FITC).

В одном из экспериментов после 72 часов инкубирования наблюдают около 30-35 автофлуоресцирующих GFP-экспрессирующих клеток. Несколько меньше автофлуоресцирующих клеток наблюдают по мере того, как уменьшается количество добавленных фагов. В случаях для 10⁵ CFU или меньше фагов на ячейку позитивно флуоресцирующих клеток вовсе не наблюдается.

Результаты контрольных экспериментов представлены в таблице. Обработка одноцепочечной нуклеазой (нуклеаза фасоли-маш; New England Biolabs, MA) не влияет значительно на эффективность GFP экспрессии, что указывает на то, что трансфекция наблюдается за счет интактных фагов, а не связана со свободной одноцепочечной фаговой геномной ДНК. Аналогичные результаты получены с использованием ДНКазы I, одно- и двухцепочечной нуклеазы вместо нуклеазы фасоли-маш. Добавление 2 мкг EGFP-N1 ДНК вместо фага не приводит к получению каких-либо GFP позитивных клеток, что указывает на то, что GFP инфицирование не связано с интернализацией примесных плазмидных ДНК в фаговых препаратах.

Как видно, появление GFP-экспрессирующих клеток зависит от присутствия биотинилированного-FGF, NAV и анти-М13 антитела (таблица). Включение только биотинилированного-FGF и NAV, или только анти-М13 и NAV, приводит к значительному снижению эффективности трансфекции (1 позитивная клетка по сравнению с 35 на ячейку). Никаких позитивных клеток не наблюдается, если опускают стадию добавления NAV или если добавляют только эквивалентные титры фага.

Если свободный FGF (не биотинилированный) добавляют до полного количества с биотинилированным FGF, захват фага ингибируется (фиг.2). Свободный FGF добавляют за 5 минут до добавления биотинилированного FGF в увеличивающихся концентрациях. Как видно на фиг.2, количество автофлуоресцирующих клеток ингибируется зависимым от дозы образом по мере того, как добавляют больше FGF. Эти результаты свидетельствуют о том, что интернализация фага происходит за счет взаимодействия биотинилированного FGF с его рецептором.

В другом эксперименте клетки COS инкубируют в 6 ячеечных пластинах при плотности 40000 кл/ячейку в течение 24 часов перед добавлением фага. Комплекс FGF2-фаг собирают на поверхности клеток, используя модификацию процедуры, описанной Моrо et al. для нацеливания антител к опухоли (Моrо et al., Cancer Res. 57:1922-1928, 1997). Клетки дважды промывают ледяным PBS/FBS (PBS с 2% плодной бычьей сывороткой) и в течение 15 минут добавляют биотинилированный FGF, биотинилированный трансферин или биотинилированный FGF. Затем добавляют нейтравидин (NAV), нейтральный авидин без углеводов (Pierce, Rock-ford, IL) для связывания биотинилированного FGF2 на поверхности клеток в ледяном PBS/FBS еще на 15 минут, и клетки снова промывают. Спустя 15 минут после добавления аликвоты биотинилированного анти-М13 антитела (кроличий анти-М13-биотин, Sigma; St. Louis, МО) (30 мкг/мл), для реакции с NAV-биотинилированным FGF2 комплексом на клеточной поверхности, клетки промывают и добавляют фаг в PBS/FBS. После часа на льду клетки промывают, помещают в свежую культуральную среду и возвращают в инкубатор при 37^oС для проведения интернализации. В некоторых случаях хлорохин (50-100 мкМ) добавляют в среде в течение 2 часов после удаления фага.

Экспрессию GFP и -галактозидазы оценивают в обработанных фагемидными частицами клетках и COS-1 контрольных клетках через 72 часа после добавления фагемидных частиц. Экспрессию GFP в обработанных фагом клетках определяют, подсчитывая количество автофлуоресцентных клеток. Клетки дважды промывают в PBS/FBS, и в каждую ячейку добавляют 1 мл PBS Дульбекко. Флуоресцентные клетки определяют непосредственно в культуральных пластинах, используя эпифлуоресцентный инвертированный микроскоп (Nikon Diaphot), снабженный набором фильтров флуоресцеинизотиоцианата (FITC). Эксперименты GFP проводят трижды и повторяют, по крайней мере, один раз.

-галактозидазу в лизатах определяют из клеток, обработанных фагемидными частицами, используя систему для анализа люминесцентной -галактозидазы от Clontech (Palo Alto, CA) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Клетки промывают в PBS, соскребают в 1,5 мл микроампулы, и определяют концентрации осажденных протеинов в лизатах. Активность эндогенного фермента определяют в нетрансфектированном клеточном экстракте COS и это значение вычитают из каждого результата. Эксперименты с -галактозидазой проводят в двойных ячейках и повторяют, по крайней мере, один раз.

В типичном эксперименте 250-1800 (в зависимости от используемого титра фага, см. график зависимости от дозы на фиг.3А) GFP-экспрессируюшие и автофлуоресцирующие клетки наблюдают в ячейках через 72 часа после направления FGF2 к COS-1 клеткам. Как видно на фиг.3А, всего лишь 10 фагов (m.o.i. 250) приводит к обнаружению GFP-экспрессирующих клеток. Как видно на фиг.3В, необходимо больше RC-CMV-фагемидных частиц для обнаружения трансгенной активности, что указывает на то, что анализ -галактозидазы полного клеточного лизата менее чувствителен, нежели обнаружение GFP-позитивных клеток при непосредственном наблюдении.

Результаты нескольких контрольных экспериментов представлены на фиг. 4А-4С. Если для конкуренции с целевым связыванием с фагом используют увеличенное количество FGF2, 100-кратный молярный избыток свободного FGF2 успешно блокирует зависящую от фагемидных частиц трансфекцию клеток COS-1 (фиг. 4А). На неспецифическую трансдукцию, которая наблюдается только с фагом, не влияет добавление такого же количества свободного FGF2 (не показано). Для дальнейшего исследования возможности того, что трансдукция клеток за счет FGF2-целевой доставки фага зависит от высокого сродства FGF рецептора, фаговые частицы нацеливают на L6 крысиные миобластные клетки, в клеточной линии которых отсутствует сродство к высокоафинным рецепторам FGF2 (Olwin и Hauschka, J.Cell Biochem. 39:443-454, 1989; доступны из АТСС; Manassas. VA) и сравнивают с реакцией на стабильные трансфектанты L6 (Flg37), которые конститутивно сверхэкспрессируют FGFR1 (получены от Dr. Murray Korc, UCI; Irvine, CA: кроме того, их легко могут получить специалисты). Как видно на фиг.4В, присутствие отличающихся высоким сродством FGF2 рецепторов облегчает FGF2-нацеленный перенос гена фага. Более высокую эффективность трансдукции наблюдают у FGFR-позитивных Flg37 клеток, чем у родительских L6 клеток и никаких GFP позитивных клеток не наблюдают ни для каких клеточных линий в отсутствии NAV. Сравнение между FGF2 нацеливанием и 2 другими нацеливающими лигандами, трансферрином (Zatloukal et al., 1992) и EGF (Watkins et al., Gene Ther. 4:1004-1012, 1997), также легко осуществить. Оба они относительно неэффективны в отношении доставки фага к COS-1 клеткам для экспрессии гена. Количество GFP-экспрессируюших клеток заметно снижается, если биотинилированные FGF2 заменяют на биотинилированный трансферрин или биотинилированный EGF (фиг.4С).

ПРИМЕР 4

Внутриклеточная направленная миграция

COS клетки обрабатывают хлорохином по способу Sosnowski et al., (J. Biol. Chem. 271:33647-33653, 1996), обычно в концентрациях от 50 до 100 мкМ в течение 2 часов. Sosnowski с сотр. продемонстрировали потенциирующее действие хлорохина, когда FGF2 нацеливает голую плазмидную ДНК, однако, если хлорохин используют в комбинации с трансдукцией клеток FGF2-нацеленными фагемидными частицами, хлорохин неожиданно оказывает ингибирующее действие на трансдукцию целевых клеток (фиг.4В).

ПРИМЕР 5

Связывание FGF с фагемидными частицами с использованием полилизина

В этом примере FGF связывают с полилизином, который затем связывается с фагемидными частицами в результате взаимодействия между положительно заряженным полилизином и отрицательно заряженным фагом.

FGF ковалентно связывают с поли-D-лизином (средняя длина полимера 84), используя S-2-пиридилдисульфид (SPDP) по способу Sosnowski с сотр. (J. Biol. Chem. 271: 33647-33653, 1996). EGFP-N1 фагемидные частицы смешивают с 5 мкг FGF-полилизина или 2,5 мкг одного только полилизина (FGF-полилизин составляет примерно 50% полилизина по весу) и оставляют при комнатной температуре на 30 минут перед добавлением к COS клеткам, которые выращивают в 12 ячеечных пластинах. Клетки исследуют через 72 часа с помощью флуоресцентной микроскопии и подсчитывают количество автофлуоресцентных GFP позитивных клеток.

Как видно на фиг.5, GFP ген трансдуцирован в COS клетки за счет фага в присутствии FGF-полилизина. Увеличение титра фага приводит к увеличению числа GFP позитивных клеток. Примерно 1/3 GFP позитивных клеток представляет фон, связанный с неспецифическим захватом фагов, покрытых только полилизином.

ПРИМЕР 6

Ковалентное связывание FGF с фагемидными частицами

В этом примере оболочковые протеины М13 фага конъюгируют непосредственно с FGF, используя гетеробифункциональные перекрестносшивающие реагенты. Свободный лизин с N-конца оболочкового протеина гена VIII доступен для химической модификации (Armstrong et al., EMBO J. 2:1641-1646, 1983). В этом способе фаговые частицы вначале тиолируют, добавляя 3-30 молярный избыток SPDP в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5, 0,1 М NaCl на 30 минут при 23^oС. Непрореагировавший реагент удаляют с помощью гель-фильтрации. FGF2-3 мутеин FGF подвергают затем взаимодействию с тиолированным фагом в 2-10 кратном молярном избытке на 24 часа при 23^oС. Свободный FGF2-3 удаляют гель-фильтрацией. Связанный с FGF фаг подвергают дальнейшей очистке с помощью афинной хроматографии на колонке с гепарин-сефарозой.

Связывание FGF с фаговым протеином подтверждают с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблоттинга фагового протеина. В невосстанавливающих условиях FGF модифицированный протеин гена VIII сдвигается по значениям кажущейся молекулярной массы с 5500 до 23500 Дa. Добавление восстанавливающего агента к тому же самому буферу приводит к разрушению дисульфидной связи и образованию свободного FGF (примерно 18000 Дa) и протеина гена VIII.

Химически модифицированный FGF-фаг анализируют по способности к трансдукции клеток млекопитающих. FGF модифицированные pEGFP-N1 фагемидные частицы, содержащие CMV-GFP экспрессионную кассету, добавляют к COS клеткам, посеянным в концентрации 20000 кл/ячейку в 12-ячеечные пластины. Клетки анализируют по GFP экспрессии с помощью флуоресцентной микроскопии через 72 часа после добавления фага.

ПРИМЕР 7

Генетическое слияние FGF с оболочковым протеином фага

В нижеследующих примерах фаг, который представляет FGF2 на своей поверхности, используют для связывания с FGF2 рецептором на клетках млекопитающих, и он интернализуется. FGF2 ген субклонируют в модифицированный М13 фаговый типа 3 вектор, MEGFP3 (фиг.1А), для создания фага, представляющего лиганд, MF2/1G3 (фиг.1В). Вектор MEGFP3 был модифицирован экспрессионной кассетой млекопитающих, сконструированной для экспрессии репортерного гена GFP для контроля за трансдукцией клеток млекопитающих фагом. Результаты трансдукции определяют затем количественно с помощью проточной цитометрии (FACscan, Becton Dickinson, Mountain View, CA) для определения распределения GFP экспрессирующих клеток в популяции, и с помощью флуориметрии клеточных экстрактов для определения полного количества продуцированных GFP. Другие векторы включают pCANTAB 5 Е (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) или М13 типа 3 или 33 для гена III слияний (Кау et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996; McConnell et al., Mol. Divers. 1: 165-176, 1996). Аналогично FGF2-3 клонируют в М13 типа 8 или 88 вектор для слияния с протеином гена VIII (Roberts et al., Methods Enzymol. 267: 68-82, 1996; Markland et al., Gene 109:13-19, 1991).

Для облегчения клонирования FGF2 ген амплифицируют с помощью ПЦР, используя олигонуклеоидные праймеры, которые содержат соответствующие рестрикционные эндонуклеазные сайты в фаговом векторе гена III или VIII. Полученный фаг экспрессирует FGF2 на их оболочке поверхности, что определяют с помощью анти-FGF2 антител в Вестернблоттинге (фиг.6) и с помощью ELISA (фиг. 7). Связывание FGF2 фага слияния с FGF2 рецептором определяют с помощью ELISA, где рекомбинантный FGF2 рецептор присоединен к твердой фазе, и антитело антифаг используют в качестве антитела первичного детектирования. При определении с помощью Вестернблоттинга FGF2-pIII слияния используют экстракты из эквивалентных фаговых титров очищенного FGF2 фага и контрольного фага (MEGFP3), разделяемых с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и блоттинга на нитроцеллюлозе. FGF2 и FGF2-фаг слияния детектируют с помощью анти-FGF2 моно-клонального антитела (Transduction Labs; Lexington, KY) и HRP конъюгированного антимышиного вторичного антитела (American Qualex; San Clemente, CA) с возникновением хемилюминесценции. Одиночная полоса протеина определяется в цезийхлоридом очищенном FGF2-фаговом экстракте, которая смещена примерно на 80 кДa. Это примерно соответствует предсказанию для FGF2-pIII протеина слияния (FGF2 (18 кДa), слитый с pIII (смещается на ~60 кДa)). Очистку с помощью CsCl осуществляют для удаления всех не ковалентно связанных FGF2 протеинов слияния из фаговых частиц.

Связывание FGF2 фага слияния с FGF2 рецептором определяют с помощью ELISA, где рекомбинантный FGF2 рецептор прикреплен к твердой фазе, и антитело антифаг используют в качестве первичного детектирующего антитела. Короче, фаги захватываются анти-FGF2 кроличьей поликлональной антисывороткой, связанной с ячейками пластины. HRP, конъюгированное анти-М13 антитело (Pharmacia Biotech; Piscataway, NY) используют для определения связанного фага. Если антифаговое антитело используют для захвата фага и эквивалентная ОП (оптическая плотность) наблюдается как для контрольного (MEGFP3), так и для FGF2-фага (MF2/1G3), указывая на то, что эквивалентные фаговые частицы внесены на пластину (фиг. 7). На фиг.7В повышенная ОП указывает на присутствие FGF2 на MF2/1G3 FGF2-фаге.

ПРИМЕР 8

Трансдукция клеток млекопитающих с помощью FGF-лиганд представляющего фага

FGF2, представляющий фаг (MF2/1G3), и идентичный фаг, у которого отсутствует FGF2 ген (MEGFP3), сравнивают в отношении опосредствованной рецептором интернализации и экспрессии репортерного гена в COS клетках. Фаг инкубируют с клетками в течение 4 часов при 37^oС в DME (Дульбекко модифицированная среда Игла; Sigma Chemical; St. Louis, МО), содержащей 2% BSA (бычьего сывороточного альбумина) в качестве блокирующего агента. После промывки для удаления несвязанного фага, клетки возвращают в инкубатор на дополнительные 72 часа. Трансдукцию измеряют, подсчитывая GFP позитивные автофлуоресцентные клетки. Как видно на фиг.8В, FGF2, представляющий фаг, отличается примерно в 10 раз большей эффективностью трансдукции, нежели контрольный фаг, что свидетельствует о том, что представление FGF2 лиганда на поверхности фаговых частиц приводит к рецептором опосредствованному связыванию и интернализации фага с последующей экспрессией репортерного гена фага. Специфичность FGF2-фага, опосредующего трансдукцию, демонстрируется путем последовательного ингибирования трансдукции избытком свободного FGF2 (2 мкг/мл) (фиг. 8В). На низкий уровень неспецифического захвата и трансдукции контрольным фагом (MEGFP3) не влияет присутствие избытка FGF2.

Важно показать, что MEGFP3 контрольный фаг одинаково способен к трансдукции клеток млекопитающих, как фаг представления, когда он соответствующим образом нацелен. Для сравнения трансдукционной способности как FGF2-фага, так и контрольного фага эквивалентные титры каждого из фагов используют для трансфекции COS клеток, используя метод авидин-биотин FGF2 мечения. В этом способе биотинилированный FGF2 контактируют с клетками и используют для захвата фаговых частиц путем добавления авидина и биотинилированного антифагового антитела. Связывание фаг/FGF2/клетка осуществляют на льду, несвязанный фаг удаляют промывкой, клетки возвращают в инкубатор при 37^oС и трансдукцию регистрируют через 72 часа. Как видно на фиг.8А, не наблюдается существенной разницы для трансдукции между FGF2-фагом и контрольным фагом, если FGF2 присоединен к фагу за счет авидин-биотиновой связи. В этом случае биотинилированный FGF2 оказывается в избытке FGF2, представленного на фаговой поверхности, так что ожидается, что интернализация происходит главным образом за счет биотинилированного FGF2. Эти данные демонстрируют опосредствованную специфическим рецептором трансдукцию клеток млекопитающих нитевидным фагом, который генетически представляет нацеливающий лиганд (FGF2).

ПРИМЕР 9

Непрерывная экспрессия за счет селективного давления

Для определения, может ли трансгенная экспрессия сохраняться в клетках после введения в клетку фагемидных частиц, устойчивость к неомицину используют для отбора трансфектированных клеток. Клетки обрабатывают фагемидными частицами, как описано выше, и спустя 48 часов клетки разводят в свежей среде в соотношении 1:10. Среду удаляют и заменяют селективной средой, содержащей G418 (700 мкг/мл) через 24 часа. По мере образования выживающих колоний (7-10 дней) содержание в них GFP оценивают с помощью флуоресцентной микроскопии. Клеточные линии, полученные из этих колоний, поддерживают при G418 отборе (более 3 месяцев).

Как видно на фиг.9А (стократное увеличение), если трансдуцированные клетки культивируют в присутствии G418, устойчивые к лекарству колонии, которыми, по-видимому, были почти все клетки, оказались позитивными в отношении GFP активности. Колонии были размножены и их сохраняли как стабильные клеточные линии, экспрессирующие GFP протеин, более 3 месяцев (фиг.9В (увеличение в 400 раз)).

Следует учитывать, что хотя здесь были описаны с целью иллюстрации конкретные варианты, различные модификации могут быть осуществлены в рамках сути и объема настоящего изобретения. Соответственно настоящее изобретение ничем не ограничено кроме как прилагаемой формулой изобретения.