универсальный способ получения материала для генодиагностического исследования влагалищной микрофлоры больших групп женщин

Формула изобретения

1. Способ получения материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры, включающий взятие биологического материала влагалища и проведение генамплификационного анализа клеточной ДНК, отличающийся тем, что взятие биологического материала осуществляют с гигиенического тампона, находящегося в контакте с влагалищем не менее 6 ч и помещенного после этого в герметический полимерный контейнер с жидким консервантом, прекращающим рост бактерий, а при проведении генамплификационного анализа тампон отжимают в контейнере 4-5 раз для полноты смыва клеток.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве жидкого консерванта в контейнер помещают раствор, содержащий 0,9% хлорид натрия и 0,05% азид натрия в воде.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии, акушерству, диагностике и эпидемиологии урогенитальных инфекций, и может применяться для профилактических, контрольных и лечебных обследованиях рожениц и других групп женщин.

С бактериальной микрофлорой влагалища женщин могут быть связаны не только воспалительные процессы урогенитальных и репродуктивных органов, но и так называемые внутриутробные и постнатальные инфекции новорожденных. Широкий ИФА- и NAT-скрининг в отношении вирусов, передающихся через кровь, уже является состоявшейся практикой во всем мире. Однако NAT-скринирование бактериальной микрофлоры и герпес-вирусов влагалищ женщин затруднен из-за отсутствия простых, стандартных и беззатратных способов получения материала для исследования.

Известные методы забора материала, потенциально содержащего влагалищную микрофлору, состоят во взятии соскобов и мазков со слизистой (например, при помощи шпателей, специальных щеток и скарификаторов) в амбулаторных или больничных условиях (В. М. Лифшиц, В.И. Сидельникова. Медицинские лабораторные анализы. Справочник. М.: Триада-Х, 2000, с. 61-65). При этом эффективность генамплификационного обнаружения бактерий зависит от качества проведения процедуры взятия материала медперсоналом, что в свою очередь зависит также от состояния пациентки в момент обследования. В любом случае вероятным является недостаточный объем материала в соскобе или мазке, что может привести к ложно-отрицательным результатам при небольших степенях инфицирования; попытки же увеличить этот объем связаны с неоправданным усилением воздействия (в том числе и болевого) на обследуемых. Наконец, возможность скрининга влагалищной микрофлоры в больших группах женщин ограничена необходимостью личного прихода обследуемых в медицинские учреждения.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры путем взятия биологического материала в виде соскоба со слизистой влагалища (Madico G. et al. Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples. - Journal of Clinical Microboilogy 1998, v. 36, No. 11, p. 3205-3210). Метод также не позволяет иметь биологический материал для исследования в достаточном объеме и сложен по исполнению для профилактических обследований больших групп женщин.

Целью изобретения является создание простой беззатратной методики взятия биологического материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры в достаточном объеме без усиления воздействия на обследуемого, а также возможности проведения скрининга влагалищной микрофлоры в больших группах женщин.

Поставленная цель достигается тем, что получение материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры проводят путем взятия биологического материала влагалища и проведение генамплификационного анализа клеточной ДНК, при этом взятие биологического материала осуществляют с гигиенического тампона, находящегося в контакте с влагалищем не менее 6 часов и помещенного после этого в герметический полимерный контейнер с жидким консервантом, содержащим 0,9% хлорид натрия и 0,05% азид натрия в воде. Причем при проведении генамплификационного анализа тампон отжимают в контейнере 4-5 раз.

Способ осуществляется следующим образом.

В полимерные одноразовые контейнеры объемом 20 мл с герметическими завинчивающимися крышками вносят по 10 мл стабилизирующего раствора, имеющего состав: 0,9% хлорида натрия и 0,05% азида натрия в воде. Такие контейнеры с указанным раствором рассылают для сбора проб. Использованный тампон, находящийся в контакте с влагалищем не менее 6 часов, помещают в такой контейнер и плотно завинчивают крышку. После этого флакон маркируют и отправляют на анализ. Пробы перевозят и хранят (накапливают) при обычных температурах без заморозки. Бактериальные клетки пригодны для генодиагностики даже после нескольких недель хранения в таких условиях. При проведении анализа в генодиагностической лаборатории тампон во флаконе 4-5 раз отжимают для полноты смыва клеток. При этом окраска пробы (от крови или выделений) с тампона смывается не полностью, что указывает на частичную сорбцию на нем возможных ингибиторов ПЦР. Далее отбирают 1-1,4 мл жидкой фазы в пробирку типа Эппендорф и центрифугируют 5 мин при 12000 g на настольной микроцентрифуге. Полученный осадок клеток, как правило, достаточно чист от слизи и других компонентов пробы, так что препарат ДНК для ПЦР может быть получен из него простым методом термического лизиса с сорбентом.

Применение таких влагалищных тампонов женщинами в настоящее время широко распространено и рекомендуется, оно полностью безопасно и не связано с болевыми ощущениями. В то же время тампон, находящийся в плотном контакте с обследуемой слизистой в течение длительного времени (несколько часов), собирает в себя выделения вместе с материалом для генодиагностического обследования (микрофлорой и отслоившимся эпителием) в количествах, существенно больших и стабильных, чем при обычных взятиях мазков и соскобов. А содержание затем тампона с собранным материалом в герметически закрытом пластиковом контейнере с жидким консервантом - 0,9% хлоридом натрия и 0,05% азидом натрия в физиологическом растворе прекращает рост бактерий, но хорошо сохраняет их в неразрушенном виде в течение длительного времени. Помещение использованного тампона в заранее приготовленный контейнер составляет всю операцию по взятию материала для генодиагностического обследования, которую можно проводить в любых условиях вне медицинского учреждения, в том числе и самой обследуемой женщиной.

Пример 1. Сохранность бактериальных клеток в стабилизирующем растворе в условиях транспортировки и хранения проб.

Для оценки такой сохранности были взяты клетки бледной трепонемы, которые быстро погибают и не культивируются in vitro. Эти клетки были добавлены в указанный раствор в концентрации 100 клеток в 1 мл. Полученная суспензия была проанализирована методом РНК-ПЦР на рибосомальную 16S РНК (по методике, описанной в патенте РФ 2164532), которая намного менее стабильна, чем ДНК до и после двух месяцев хранения при комнатной температуре. Приведенная на фиг. 1 электрофореграмма результата этого анализа показывает сохранность в этих условиях даже рибосомальной РНК. Другой наш эксперимент (Федоров Е.Н., Петухова И. И. , Суханов Ю.С., Елов А.А., Федоров Н.А. ПЦР-детекция ДНК и РНК Тгероnеmа pallidum в крови серопозитивных доноров. - Вестник службы крови России 2001, 3, с. 42-46) показал, что и в более агрессивной среде - цельной крови - рибосомальная РНК в составе бледной трепонемы стабильна 6 недель при 4^oС.

Пример 2. Анализ проб двух пациенток, полученных с использованием тампонов, на хламидии, микоплазму, уреаплазму и трихомонаду.

Пробы на тампонах обработаны по приведенной выше методике. Клеточный осадок был обработан термолизисом 15 мин при 95^oС в суспензии фосфоцеллюлозы (аналог обработки Insta Gene фирмы Bio-Rad), экстракт ДНК введен в ПЦР. Для определения возбудителей использованы амплификационные реагенты, изготовленные d cоответствии с патентом РФ 2164532. Из электрофореграммы на фиг.2 видно, что у обеих пациенток обнаружена уреаплазма, а у пациентки 2 - также и хламидия; микоплазма и трихомонада у них отсутствует. Ингибирования ПЦР, несмотря на самый простой метод обработки проб, не наблюдается. В целом при использовании тампонов, как показывает опыт, ингибирование ПЦР, требующее повтора с дополнительной промывкой осадка или использования более сложного выделения ДНК из клеток методом сорбции на силикагеле, наблюдается не чаще, чем при обычной работе с мазками и соскобами. Даже при такой простой обработке в полученном экстракте ПЦР на обычные урогенитальные возбудители проходит достаточно эффективно.

Пример 3. Параллельный анализ проб одних и тех же пациентов, взятых с помощью тампонов и обычных соскобов.

По договоренности с рядом медицинских учреждений врачи-гинекологи наряду с соскобами брали у пациенток на анализ также и влагалищные тампоны (обычно "мини" фирм "Always", "Kou", "Ob"), находившиеся во влагалище 6-10 часов и подготовленные по приведенной выше инструкции. Тампоны и соскобы обрабатывались как в примере 2 и выше, на экстрактах ДНК проведена ПЦР на заказанные врачами инфекции. Результаты обследования 195 человек приведены в таблице 1.

В работе был использован полуколичественный метод оценки результатов ПЦР-анализа по внутреннему стандарту. Для упрощения трактовки результатов во врачебной практике они были переведены в следующую систему оценки:

(+) - 50-500 копий геномов возбудителя на пробу.

(++) - 500-5000 копий геномов возбудителя на пробу.

(+++) - 5000-50000 копий геномов возбудителя на пробу.

(++++) - более 50000 копий геномов возбудителя на пробу.

Сравнение положительных результатов по такому критерию для разных методов забора биоматериала приведено в таблице 2.

Приведенные в примере 3 сопоставление анализов проб одних и тех же пациенток, полученных с помощью обычных соскобов и с использованием тампонов по приведенной выше методике, показал, что при использовании тампонов выявляемость инфекций повышается примерно в два раза и сигналы ПЦР становятся более интенсивными. Это подтверждает эффективность предложенного метода сбора проб влагалищной микрофлоры.