способ определения окислительной устойчивости плазмы крови

Формула изобретения

Способ определения окислительной устойчивости плазмы крови, включающий медьиндуцированное окисление, отличающийся тем, что используют разведение плазмы стандартным буферным раствором 1: 20-1: 50, окисление осуществляют добавлением к 2 мл разведенной плазмы 0,1 мл водного раствора CuSO₄5H₂O с концентрацией 20 мкмоль CuSO₄, полученную смесь инкубируют при 37^oС при периодическом перемешивании, через 24 ч инкубации регистрируют накопленное количество продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в пересчете на 1 мл неразведенной плазмы, и сравнивают с показателем окислительной устойчивости плазмы крови, определенным для здоровых людей.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине - области кардиологии, общей патологии, клинической патофизиологии.

Лабораторные разработки и клинические исследования указывают на ключевую роль свободнорадикальных процессов, в том числе и перекисного окисления липидов (ПОЛ), в патогенезе атеросклероза и различных клинических форм ишемической болезни сердца (ИБС). При этом в подавляющем большинстве проводимых ранее исследований измерялись стационарные концентрации липопероксидов и других продуктов ПОЛ [1-5]. Поскольку липопротеины (ЛП) приобретают атерогенные свойства после их окисления в стенке сосудов, то более корректным является оценка способности ЛП к окислению, т.е. их окисляемость. Оценка окислительной способности ЛП является более адекватной, чем измерение стационарной концентрации продуктов ПОЛ. Переход к исследованиям окисляемости ЛП был связан также с тем, что окисленные ЛП, в которых содержатся первичные продукты ПОЛ, имеют более короткое время жизни в кровотоке по сравнению с неокисленными, т.к. поглощаются клетками ретикулоэндотелиальной системы.

Роль окисленных ЛП подтверждена на всех этапах развития атеросклеротического процесса: они вызывают нарушение проницаемости эндотелия, адгезию моноцитов, превращение в пенистые клетки и пролиферацию макрофагов и гладкомышечных клеток, также разрывы фиброзных бляшек и усиленное тромбообразование [6-8] . Было показано, что во время приступа стенокардии в ишемизированном участке миокарда происходит "свободнорадикальный взрыв", ведущий к выраженной активации ПОЛ и соответственно формированию окисленных ЛП [9].

Окисляемость ЛП зависит от их жирнокислотного состава и содержания антиоксидантов. Определяют 3 характеристики интенсификации ПОЛ: а) лаг-период -промежуток времени с начала окисления до момента, начиная с которого скорость накопления продуктов ПОЛ резко увеличивается, б) скорость образования продуктов ПОЛ - характеристика накопления продуктов окисления в единицу времени, в) максимальное количество образовавшихся продуктов - максимальное количество стабильных продуктов ПОЛ, образующихся за тот временной интервал, когда накопление продуктов выходит на неизменяемый (стационарный) уровень.

В большинстве опубликованных ранее исследований изучалась готовность к окислению in vitro изолированной фракции ЛП низкой плотности (ЛПНП) [6-8, 10-11] и их окисляемость характеризовали лаг-периодом.

Метод оценки окислительной устойчивости выделенных ЛП имеет три главных недостатка: 1) отсутствие учета условий in vivo, 2) оценка лаг-фазы, 3) трудоемкость выделения фракции ЛПНП (длительный период времени и дорогостоящее специальное оборудование).

1. Согласно последним исследованиям о роли окисленных ЛП в патогенезе атеросклероза, окисление ЛП происходит непосредственно в тканях, в стенке сосудов и в крови. При этом на процессы окисления влияют присутствующие в крови белки, низкомолекулярные антиоксиданты и антиоксидантные ферменты. Этот фактор не учитывается при окислении выделенных ЛП. Кроме того, атерогенными свойствами обладают не только окисленные ЛП низкой плотности, но и окисленные ЛП очень низкой плотности, а окисленные ЛП высокой плотности уменьшают способность акцептировать холестерин из клеток [12,13], что способствует его накоплению в сосудах. При этом необходимо учитывать трудоемкость процесса выделения фракции ЛПНП, вследствие которого в ней могут произойти существенные изменения.

2. Оценка лаг-фазы имеет два существенных недостатка:

а) Лаг-период в основном зависит от содержания антиоксидантов в ЛП и не является полной характеристикой окисляемости липопротеинов. Окисляемость ЛП зависит от их жирнокислотного состава и содержания антиоксидантов. Поэтому для характеристики окисляемости ЛП более корректным является определение максимального количества накопившихся при окислении продуктов. Однако первичные продукты ПОЛ - диеновые конъюгаты и гидроперекиси разлагаются в ходе окисления, превращаясь во вторичные. Это приводит к уменьшению содержания первичных продуктов в процессе окисления. Поэтому более адекватным является определение максимального количества вторичных продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой - ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП). Определение лаг-периода для ТБК-реактивных продуктов нецелесообразно, т.к. лаг-период зависит от содержания антиоксидантов и не зависит от жирнокислотного состава, который является определяющим для количества образовавшихся ТБК-РП.

б) Неудобство непрерывной регистрации в течение длительного периода времени (3-6 часов), что неприемлемо для широкого клинического применения.

Таким образом, окисляемость in vitro изолированной фракции ЛПНП путем оценки лаг-периода не учитывает целый ряд значимых факторов, влияющих на окислительный процесс in vivo, и не дает о нем полной информации. Поэтому более корректным является изучение окисляемости не выделенных ЛП, а окисляемости ЛП непосредственно в плазме.

В последнее время появились единичные работы, в которых используют способность к свободнорадикальному окислению in vitro плазмы [14-19] или сыворотки [20-23]. Такой подход более приближен к условиям in vivo, т.к. устраняет недостатки оценки окисляемости изолированной фракции ЛПНП. В этих исследованиях методическим подходом при оценке окислительной устойчивости плазмы являлось измерение лаг-периода в накоплении первичных продуктов окисления - гидроперекисей [22] диеновых конъюгатов [17-20]. Тем не менее эти работы наиболее близки к предлагаемому в данной заявке методу.

Однако примененный методический подход прежний - измерение лаг-периода. Недостатки оценки лаг-периода приведены выше. Они аналогичны как для изолированной фракции ЛПНП, так и для плазмы или сыворотки. Измерение лаг-периода не дает полной информации об окислительной устойчивости плазмы. Для получения такой характеристики наиболее информативным является измерение максимального количества стабильных продуктов ПОЛ. На наш взгляд, наиболее отвечает таким требованиям измерение вторичных продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, основным из которых является малоновый диальдегид. При этом время окисления определяется периодом, в течение которого скорость накопления продукта мала, т.е. количество образующихся продуктов мало меняется со временем. Для определения всех перечисленных условий необходимо исследование кинетики накопления продуктов ПОЛ при различных концентрациях ионов меди и различных разведениях плазмы. Такого типа исследований в доступной нам литературе не найдено.

Таким образом, окисление плазмы с измерением максимального накопления ТБК-РП позволяет в большей степени приблизиться к условиям in vivo.

Актуальность разработки методики оценки окислительной устойчивости плазмы продиктована ее клинической востребованностью. На данный момент в клинической практике не определяется активность свободнорадикальных процессов и их влияние на тяжесть течения заболевания у больных ИБС. Из патогенетических факторов риска прогрессии атеросклероза оцениваются лишь количественные характеристики липидного состава крови: содержание триглицеридов и холестерина, а также липидный спектр (фракции липопротеинов). Качественные характеристики, к которым можно отнести окисляемость ЛП в плазме, не учитываются. Это связано в первую очередь с отсутствием клинически разработанных показателей и доступных методик их определения.

Цель предложенного изобретения - разработка доступного для широкого клинического применения метода определения окислительной устойчивости плазмы при максимальном приближении к условиям in vivo, позволяющего оценить тяжесть течения ИБС и контролировать назначение и эффективность антиоксидантной терапии.

Поставленная цель достигается тем, что кинетику накопления ТБК-РП исследуют непосредственно в плазме крови.

Метод выполняется следующим образом.

Для исследований проводили забор крови утром натощак в интервале между 8.00 и 9.00 часами. 5,0 мл крови из локтевой вены вносили в пластиковый контейнер, содержащий 1 мл 1% раствора цитрата натрия (для определения продуктов ПОЛ), и в стеклянную пробирку без консерванта - 10 мл (для определения липидного спектра).

Для разработки условий окисления использовали плазму крови 10 здоровых лиц и 40 больных ИБС. В качестве антикоагулянта для получения плазмы использовали цитрат натрия (на 100 мл ₂О 6,42 г цитрата натрия и 0,102 г NaH₂PO₄, рН 7,2-7,4). Плазму разводили буферным раствором, в состав которого входили 150 мМ NaCL и 10 мМ NaH₂PO₄ (на 400 мл Н₂О 3,42 г NaCL, 0,48 г NaH₂PO₄, рН 7,2-7,4).

В экспериментах пробы подвергались разведениям: 0 (исходная плазма), 1: 5, 1: 10, 1:20, 1:50. На основании проведенных исследований выбран рабочий интервал для разведения плазмы 20-50 раз. Следует отметить, что результаты измерения ТБК-РП, наблюдаемые при разведении плазмы, более чем 1:20 совпадали с результатами, наблюдаемыми при разведении 1:20. Поэтому, в целях экономии крови, можно использовать разведение в интервале 20-50 раз. Кроме того, скорость накопления ТБК-РП в неразведенной плазме чрезвычайно мала из-за присутствия водорастворимых соединений, препятствующих окислению (таких как мочевая кислота). При разведении плазмы такое влияние становится менее выраженным, а при разведении плазмы 1:20 и выше - нивелируется.

В качестве инициатора окисления использовали водный раствор CuSO₄ 5Н₂О. С целью сохранения точного соотношения между плазмой и медью разведению подвергали заранее подготовленный раствор: к 2 мл плазмы добавляли 0,1 мл 20 мкмоль раствора СuSO₄. Свободнорадикальное окисление и аутоокисление проводили в стеклянных сосудах с завинчивающимися крышками емкостью 6 мл. Общий объем растворов во всех пробах соответствовал 2 мл. Инкубацию проб проводили при 37^oC (условия, близкие к физиологической температуре тела), периодически перемешивая. Через определенные промежутки времени брали аликвоты для определения продуктов окисления, объем которых составлял 0,1-0,2. За интенсивностью процесса следили по содержанию в пробах ТБК-РП. Временные промежутки для регистрации показаний в первые 10 часов инкубации составили 1 час, а в последующий период - от 10 до 24 часов инкубации - 2 часа. Увеличение времени инкубации проб свыше 24 часов не приводило к увеличению накопления ТБК-РП (фиг.1). Таким образом, исследуемые продукты окисления являются относительно стабильными в течение 48 часов инкубации в присутствии 2-х валентных ионов меди.

Была изучена кинетика индуцированного ионами меди накопления продуктов ПОЛ в плазме при различных концентрациях меди. Количество ТБК-РП нарастало с увеличением концентрации ионов меди, начиная с 10 до 20 мкмоль сульфата меди. Дальнейшее увеличение концентрации ионов меди не приводило к увеличению количества ТБК-РП, что наглядно представлено на фиг.2.

Таким образом, наиболее информативными для сравнения степени окисляемости плазмы различных групп больных, а также выявления взаимосвязи окисляемости с клиническими проявлениями оказались результаты реакции с 10-20 мкмоль сульфата меди и показатели ТБК-РП через 24 часа реакции.

Диаграммы, представленные на фиг.1, показывают количественные соотношения между ТБК-РП в исходной плазме и после 24-часового Сu-индуцированного окисления в разведенной в 20 раз плазме. Приведенные соотношения показывают, что содержание продуктов ПОЛ в исходной плазме является слишком малым по сравнению с содержанием их в окисленной плазме.

Отсюда следует, что при определении окисляемости плазмы количеством продуктов ПОЛ в исходной плазме можно пренебречь.

ТБК-РП определяли, опираясь на методику [24]. К 1,5 мл 1% раствора фосфорной кислоты добавляли аликвоты проб. Для прекращения процесса свободнорадикального окисления добавляли 0,025 мл 510^-4 М спиртового раствора ионола, затем 0,5 мл 0,5% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты. Полученные растворы инкубировали в термостате при 100^oС в течение 45 мин. В охлажденные до комнатной температуры растворы добавляли 2 мл бутанола и интенсивно встряхивали в течение нескольких минут. После центрифугирования отделяли верхний слой и измеряли спектры поглощения бутанольной фракции. Спектры снимали в диапазоне 450-650 нм. Из спектров рассчитывали оптическую плотность в максимуме поглощения 532 нм при коэффициенте молярной экстинкции для продуктов реакции ТБК с альдегидными группами - 1,5610⁵ М^-1 см^-1. В качестве контрольного раствора использовали бутанол. Концентрацию ТБК-РП выражали в нмолях на 1 мл не разведенной плазмы. Дополнительно, с целью подтверждения результатов, рассчитанных на 1 мл плазмы, делался перерасчет на 1 мг белка плазмы [25] и на 1 мг общих липидов [26].

Для контроля антиоксидантной терапии рекомендуется дополнительная регистрация показаний концентрации ТБК-РП через 4 часа инкубации плазмы с ионами меди. Данный временной интервал объясняется следующим.

При исследовании кинетики накопления продуктов ПОЛ выявлено, что на начальных этапах окисления скорость их образования мала из-за присутствия в крови эндогенных антиоксидантов. Резкий скачок в накоплении продуктов окисления происходит лишь после расходования эндогенных антиоксидантов. Регистрируя накоплении продуктов окисления на начальном этапе, можно получить информацию о влиянии присутствующих антиоксидантов как эндогенных, так и дополнительно назначаемых экзогенных. Применительно к разработанным нами условиям окисления, небольшая скорость накопления продуктов окисления наблюдалась во временном промежутке - от 0 до 6 часов инкубации. Для большинства больных скачок в накоплении продуктов окисления отмечался после 4-х часов инкубации. Поэтому для оценки влияния экзогенных антиоксидантов на окисление плазмы нами было выбрано время окисления - 4 часа.

Параллельно с измерением окислительной устойчивости плазмы проводилось определение общих липидов, общего холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), холестерина ЛП низкой плотности (ХС-ЛПНП) и холестерина ЛП высокой плотности (ХС-ЛПВП). Общие липиды выделяли путем экстрагирования плазмы хлороформ-метанольной смесью по Фолчу [26]. Содержание ХС, ТГ и ХС-ЛПВП в сыворотке крови определяли на автоанализаторе "Centrifichem - 400" после ферментативного гидролиза с разным набором реагентов, готовых к использованию (фирма "Boechringer Mannheim GmbH", Германия), Определение ХС-ЛПВП проводили после осаждения апо-В-содержащих ЛП фосфорно-вольфрамовой кислотой и MgCl2 [27]. ХС-ЛПНП рассчитывали по формуле W.Friedewald и соавт. [28].

Математическая обработка данных производилась на персональном компьютере с использованием программы "Statistica". Результаты представлены в виде средней арифметической и ее средней ошибки (Мm), различия считали достоверными при р < 0,05.

Информативность и высокая чувствительность разработанного метода подтверждена результатами клинического исследования.

Результаты исследования

Обследовано 253 больных ИБС со стабильной стенокардией напряжения II-III функциональных классов (ФК). У 14 больных III ФК за год наблюдения имели место госпитализации по поводу нестабильной стенокардии. Аналогичные показатели изучались у 11 больных ИБС с нестабильной стенокардией, 30 больных с постинфарктным кардиосклерозом и без стенокардии напряжения (ПК) и 40 здоровых лиц (доноров).

Окисляемость плазмы у больных ИБС достоверно выше (т.е. окислительная устойчивость плазмы ниже,) чем у здоровых лиц, причем степень окисляемости плазмы нарастает со степенью тяжести стенокардии (табл., фиг.3).

При анализе уровней ТБК-РП в пересчете на 1 мл плазмы (наиболее простой и удобный вариант расчета) у больных с различной степенью тяжести ИБС прослеживается следующая взаимосвязь.

У больных с ПК и без стенокардии напряжения концентрация ТБК-РП была достоверно выше показателя доноров на 15%. Далее, уровень ТБК-РП последовательно увеличивался с нарастанием степени тяжести стенокардии. У больных ПФК концентрация ТБК-РП достоверно превышала показатель больных с ПК на 28% и на 46% была выше показателя группы доноров. При ШФК концентрация ТБК-РП оказалась достоверно выше, чем у доноров на 77%. Достоверное различие с группой больных ПФК составило 21%.

У больных со стенокардией III ФК и нестабильными состояниями в анамнезе и в группе больных с нестабильной стенокардией выявлена максимальная степень окисляемости плазмы или наименьшая окислительная устойчивость плазмы. У больных со стенокардией III ФК и нестабильными состояниями в анамнезе концентрация ТБК-РП достоверно превышала показатель группы больных III ФК на 18,5%. У больных с нестабильной стенокардией достоверное различие с группой больных III ФК составило 25%. При этом в рассматриваемых группах больных не обнаружено достоверных различий по показателям липидного спектра крови (табл., фиг. 4). У больных с нестабильной стенокардией липидный спектр крови не определялся, поскольку при остром коронарном синдроме инициируются воспалительные реакции, которые существенно влияют на липидный обмен. Поэтому определение составляющих липидного спектра крови у больных с острым коронарным синдромом некорректно.

С целью подтверждения данных, полученных при расчете на 1 мл плазмы, использовался вариант пересчета концентрации ТБК-РП на 1 мг белка плазмы и на 1 мг липидов. Такие варианты пересчета провести целесообразно, поскольку белки плазмы могут влиять на процессы ПОЛ - некоторые фракции сами подвергаются окислению, другие выступают в роли антиоксидантов. Вместе с тем, основным субстратом окисления в ЛП являются липиды. Поэтому логичной представляется попытка расчета образования ТБК-реактивных продуктов и на 1 мг липидов. Такой расчет позволяет уравнять качественные и количественные аспекты окисляемости ЛП плазмы. Выставляя в знаменателе общее количество липидов, можно получить показатель, иллюстрирующий накопление продуктов ПОЛ, образующихся из 1 мг липидов, что позволяло бы нивелировать различия в содержании ЛП плазмы у того или иного больного.

При анализе уровней ТБК-РП в пересчете на 1 мг белка плазмы и на 1 мг липидов у больных с различной степенью тяжести ИБС прослеживалась аналогичная данным пересчета на 1 мл плазмы взаимосвязь: концентрация ТБК-РП нарастала со степенью тяжести стенокардии (табл.). Совпадение характера зависимости между окислительной устойчивостью плазмы и степенью тяжести стенокардии по показателям ТБК-РП /1 мл плазмы с показателями, рассчитанными на 1 мг белка и 1 мг липидов, позволяет рекомендовать для практического применения более простой и не требующий дополнительных перерасчетов показатель концентрации ТБК-РП /1 мл плазмы крови.

Выводы:

1. Метод медьиндуцированного окисления плазмы - простой и доступный для оценки окислительной устойчивости плазмы, применим в условиях клинической практики. Наиболее информативным и пригодным для практического использования является показатель уровня ТБК-РП на 1 мл плазмы.

2. Результаты проведенных исследований позволяют выделить патогенетическую взаимосвязь между окислительной устойчивостью плазмы крови и вариантами клинического течения стенокардии у больных ИБС.

Научное и практическое значение и эффективность изобретения

Разработан новый, клинически доступный и чувствительный метод определения окислительной устойчивости плазмы крови, позволяющий оценивать тяжесть течения заболевания и возможность дифференцированного подхода к лечению больных с различными формами ИБС, в том числе и превентивному.

Литература

1. Калмыкова В.И., Бурлакова Е.Б. Нарушение взаимосвязи между содержанием липидов и продуктов их перикисного окисления и пути ее коррекции при атеросклерозе коронарных артерий и инфаркте миокарда. Сов. Мед. 1982;4:3-7.

2. Коган А.Х., Ершов В.И., Соколова И.Я. О механизмах усиления свободнорадикальных процессов у больных ИБС - стенокардией в зависимости от ее тяжести. Тер.Архив. 1994;4:32-36.

3. Ланкин В. З. , Закирова А.Н. и др. Перикиси липидов и атеросклероз. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в крови больных ишемической болезнью сердца. Кардиология. 1979; 10:69-72.

4. Ledwozyw A. The relationship between plasma triglycerides, cholesterol, total lipids and lipid peroxidation products during human atherosclerosis. Clin. Chim. Acta. 1986;155(3): 275-283.

5. O"Keefe J., Lavie C., McCallister B. Insights into the pathogenesis and prevention of coronary artery disease. Mayo Clin. Proc. l995;70(l): 69-79.

6. Cushing S. D., Berliner J. A., Volente A. J. et al. Minimally modified low density lipoprotein induces monocyte chemotactic protein 1 in human endothelial cells and smooth muscle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990; 87:5134-5138.

7. Frostegard J. , Wu R., Haegerstand A. et al. Mononuclear leucocytes exposed to oxidized low density lipoprotein secrete a factor that stimulates endothelial cells to express adhesion molecules. Atherosclerosis 1993; 103: 213-219.

8. Stico A, Regnstrom J, Shah PK. et al. Active oxygen species and lysophosphatidylcholine are involved in oxidized low density lipoprotein activation of smooth muscle cell DNA synthesis, Atheroscl. Thromb. Vase. Biol. 1996; 6:194-200.

9. Liu К., Cuddy Т. Oxidative status of lipoproteins in coronary artery disease patients. Am. Heart J. 1992;123(2):285-90.

10. Miwa K., Miyagi Y., Fugita M. Susceptibility of plasma low-density lipoprotein to Cu²⁺ ion-induced peroxidation in patients with variant angina. J.Am. Col. Cardiol. 1995; 26:632-638.

11. Cominacini L., Garbin U., Pastorino A. M. et al. Predisposition to LDL oxidation in patients with and without angiographically established coronary artery disease Atherosclerosis. 1993; 99:63-70.

12. Musanti R. , Chirelli G. Interaction of oxidized HDLs with J774-A1 macrophages causes intracellular accumulation of unesterified cholesterol. Arterioscl. Thromb. 1993; 13: 1334-1345.

13. Nogano Y., Arai H., Kit A. High density lipoprotein loses its effect to stimulate efflux of cholesterol from foam cells after oxidative modification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1991; 88:6457-6461.

14. Subbaiah P.V., Liu M. Disparate effects of oxidation on plasma acyltransferase activities: Inhibition of cholesterol esterification but stimulation of transesterification of oxidized phospholipids. Lipid. Metab. 1996; 1301:115-126.

15. Karten В., Beisiegel U., Gercken G. et al. Mechanisms of lipid peroxidation in human blood plasma: a kinetic approach. Chem. Phys. Lipids. 1997;88:83-96.

16. Kontush A., Karten В., Kohlschutter A., Beisiegel U. Antioxidant and prooxidant activity of alpha-tocoferol in of human plasma and low density lipoprotein. J. Lipid. Res. 1996;37:1436-1448.

17. Spranger Т. , Finckh В., Fingerhut R. et al. How different constituents of human plasma and low density lipoprotein determine plasma oxidizability by copper. Chem. Phys. Lipids. 1998; 91:39-52.

18. Kontush A., Baum K., Spranger Т., Finckh B. et al. Plasma ubiquinol -10 is decreased in patients with hyperlipidemia. Atherosclerosis. 1997; 129:119-126.

19. Schnitzer E, Pinchuk I, Fainaru M, Schafer Z, Lichtenberg D. Copper-induced lipid oxidation in unfractionated plasma: the lag preceding oxidation as a measure of oxidation-resistance. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 216(3): 854-861.

20. Camejo G. , Halberg C., Manschiklundin A.et al. Hemin binding and oxidation of lipoproteins in serum: mechanisms effect on the interaction of LDL with human macrophages. J. Lipid. Res. 1998:39:755-766.

21. Mecmetcik G., Toker G., Uysal M. Endogenous and copper-induced lipid peroxidation and antioxidant activity of serum in hypercholesterolemic subjects. Horm. Metab. Res. 1997:29:63-65.

22. Proudfoot L., Puddey L., Blien L., Stocker R. et al. Unexpected dose respons of copper concentration on lipoprotein oxidation in serum. Free Rad. Biol. Med.l997:23(5):699-705.

23. Regnstrom J. , Strom K., Moldeus P. N., Nilsson J. Analysis of lipoprotein diene formation in human serum exposed to copper. Free Rad. Res. Commun. 1993;19:267-278.

24. Uchiyama M., Michara M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Analytical Biochemistry. 1978; 86: 271-278.

25. Locory O.H., Nira J. Rosebrough, A. et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951;! 93:265-275.

26. Кейтс M. Техника липидологии. Москва, 1975; 376.

27. Burstein M., Sholnick H.R., Morfin R. Rapid method for isolation of lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions. J. Lipid. Res. 1970;11:583-595.

28. Friedewald W. Т. , Levy R.I., Fredrickson D.S. Estimation of the concentration of low density lipoprotein cholesterol in plasma without use of the preparative ultracentrifuge. Clin. Chem. 1972; 18:499-502.