способ идентификации bacillus anthracis

Формула изобретения

Способ идентификации Bacillus anthracis, включающий посев исследуемой культуры на питательную среду, инкубирование с последующим учетом результатов роста по формированию преципитации, отличающийся тем, что посев исследуемой культуры осуществляют отдельными колониями (бляшками), в качестве питательной среды используют агар Хоттингера с 1% бикарбоната натрия и 10% инактивированной лошадиной сыворотки, культивирование проводят при 35-37^oС при 10-20%-ном содержании СО₂, формирование преципитации осуществляют с помощью бумажных индикаторов в виде полосок, пропитанных противосибиреязвенным глобулином жидким (коммерческим).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для идентификации возбудителя сибирской язвы по способности к токсинообразованию и капсулообразованию при лабораторном исследовании.

Основой идентификации B. anthracis является определение его патогенных свойств. Патогенность, как известно, определяется двумя особенностями возбудителя - это способностью образовывать капсулу и токсин.

Два фактора патогенности (токсин и капсула) сибиреязвенный микроб продуцирует в организме чувствительного к сибирской язве животного или человека. В случае высокой патогенности у больных или павших животных помимо гибели о наличии способности к токсинообразованию судят также по обнаружению желеобразного отека тканей в месте введения микроба. Капсулообразование выявляется в мазках-отпечатках из органов павших животных, окрашенных по Ребигеру. Однако не все штаммы могут вызвать гибель животных. К примеру, акапсульные варианты сибиреязвенного микроба не вызывают гибели животных, хотя способность к токсинообразованию у этих штаммов сохраняется.

Известны способы определения капсуло- и токсинообразования in vitro. Для капсулообразования известна питательная среда с добавлением 1% бикарбоната натрия и при условии выращивания в атмосфере CO₂ (Методические указания по лабораторной диагностике сибирской язвы у животных и людей и обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения в объектах внешней среды. - М., 1989).

Известна питательная среда СОПЭК (Еременко Е.И., патент на изобретение 2092550. - 10.10.1997), на которой сибиреязвенный микроб образует капсулу и токсин. В состав этой среды входят в определенных соотношениях следующие аминокислоты и соли: L-аланин, L-аргининНСl, L-аспарагиновая кислота, L-валин, L-гистидинНСl, глицин, L-глютамат натрия, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-тирозин, L-триптофан, L-фенилаланин, L-цистин, аденин, урацил, тиаминНСl, CaCl₂H₂O, MgSO₄H₂O, FeSO₄7Н₂О, MnSO₄7H₂O, K₂НРO₄, NaHCO₃, d(+) глюкоза, агароза, противосибиреязвенный глобулин жидкий, вода дистиллированая. Полученный раствор питательной основы стерилизуют путем фильтрации через мембранный фильтр. Затем расплавляют навеску агарозы 10-15 г в 500 мл дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием при 121^oС в течение 20 мин. К расплавленной и охлажденной до 50^oС агарозе добавляют стерильно раствор питательной основы в объеме 400-425 мл и противосибиреязвенный глобулин жидкий в объеме 100-75 мл, перемешивают и разливают в чашки Петри по 10-12 мл. Посевной материал (споры или вегетативные клетки) наносят петлей бляшками диаметром 3-4 мм или репликатором от 5 до 25 инокулятов. Чашки с посевами помещают в микроанаэростат с содержанием от 10 до 20% углекислоты. Посевы выращивают при 35-37^oС в течение 40-48 ч, затем чашки переносят из микроанаэростата в холодильник и выдерживают там 48-72 ч при 4-10^oС. По окончании этих сроков просматривают чашки. Продуцирующие капсулу культуры формируют колонии в SM-форме - округлые, гладкие, слизистые. Не продуцирующие капсулу культуры растут в R-форме.

Для обнаружения токсинообразования чашки просматривают при естественном освещении на черном фоне, пользуясь листом черной бумаги. Вокруг продуцирующих токсин колоний в среде формируются ореолы преципитации в виде тонких колец. Не продуцирующие токсин колонии лишены таких ореолов.

Среда-прототип имеет существенные недостатки: во-первых, сложный состав питательной среды, сложность ее приготовления и дороговизна; во-вторых, большой объем введения дорогостоящего противосибиреязвенного глобулина жидкого (коммерческого) в среду, отсюда еще более увеличивающаяся дороговизна питательной среды. Поэтому использование этой питательной среды для выявления токсинообразования у сибиреязвенного микроба в лабораторных условиях весьма проблематично.

Наиболее близким по назначению является способ обнаружения токсинообразования у микробов с помощью индикаторных бумажек, смоченных антитоксической сывороткой (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М. : "Медицина", 1982. - С.239-240). Такой способ используется для определения токсигенности у дифтерийного микроба. Агар, приготовленный для испытания токсигенности, растапливают, охлаждают до 50^oС, добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки и разливают по 12-15 мл в стерильные чашки Петри. Полоску фильтровальной бумажки (1,5 на 8 см) пропитывают антитоксической дифтерийной сывороткой, предварительно разведенной изотоническим раствором хлорида натрия до содержания 500 АЕ в 1 мл. На смачивание бумажки указанных размеров должно быть израсходовано 0,25 мл разведенной сыворотки. Смоченную бумажку накладывают на поверхность уже застывшего агара, после чего чашки подсушивают в течение 30 мин при 37^oС. Изучаемые культуры засевают по обеим сторонам бумажки в виде бляшек на расстоянии 0,6-0,8 см от бумажки и 1-1,5 см друг от друга. Посевы оставляют при 37^oС на 24-48 ч. При наличии у культуры способности образовывать токсин на месте встречи антигена и антител формируется белый преципитат, располагающийся в виде линий.

Способ оказался неэффективным при обнаружении возбудителя сибирской язвы.

Техническим результатом изобретения является упрощение методики и повышение надежности обнаружения у возбудителя сибирской язвы способности токсинообразования. Указанный технический результат достигается тем, что предварительно готовят питательный агар для образования токсина у сибиреязвенного микроба на основе агара Хоттингера, к которому добавляют 1% соды и 10% инактивированной лошадиной сыворотки. Готовят полоски фильтровальной бумажки (1,5 на 8 см), которые стерилизуют в автоклаве при температуре 121^oС в течение 20 мин. Затем бумажки пропитывают неразведенным противосибиреязвенным глобулином жидким (коммерческим). Смоченную бумажку накладывают на поверхность уже застывшего агара, после чего чашки подсушивают в течение 30 мин при 37^oС. Изучаемые культуры в вегетативной форме засевают по обеим сторонам бумажки в виде бляшек на расстоянии 1 см от бумажки и 2-2,5 см друг от друга. Инкубацию проводили в течение 48 ч при 37^oС в анаэростатах при содержании 10-25% CO₂.

По истечении этого срока учитывают капсулообразование. Вирулентные культуры сибиреязвенного микроба вырастают в виде крупных слизистых колоний в SM-форме, акапсульные варианты или апатогенные вырастают в R-форме. Затем чашки переносят в холодильник и выдерживают в условиях холодильника (температура 4-10^oС) 48-72 ч.

Для обнаружения токсинообразования чашки просматривают при естественном освещении на черном фоне, пользуясь листом черной бумаги. При наличии у культуры способности образовывать токсин на месте встречи антигена и антител формируется белый преципитат, располагающийся в виде 1-3 линий. Не продуцирующие токсин колонии лишены таких линий.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Добавление в питательный агар 1% бикарбоната натрия и 10% инактивированной лошадиной сыворотки, выращивание культур в анаэростате при повышенном содержании СО₂ в течение 48 ч при 37^oС. Этот прием обеспечивает не только капсулообразование, но и токсинообразование у сибиреязвенного микроба.

Накладывание на питательный агар фильтровальной бумажки, смоченной противосибиреязвенным глобулином жидким обеспечивает диффундирование антитоксических антител в питательный агар.

Посев сибиреязвенных культур в виде бляшек обеспечивает хороший рост микроба и выделение при этом токсина, который диффундирует в питательный агар. На стыке встречи токсина (антиген) и противосибиреязвенного глобулина (антитела) образуется иммунопреципитат в виде белых полосок (см. чертеж).

Использование питательной среды с 1% соды и 10% лошадиной сыворотки и индикаторных бумажных полосок, смоченных противосибиреязвенным глобулином, обеспечивает достаточно быстрое и надежное выявление у сибиреязвенного микроба способности не только к капсулообразованию, но и токсинообразованию в условиях in vitro.

Возможность практического использования заявленного способа иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Изучали 6 штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных из почв старых скотомогильников: 537/308, 643 /267, 644/268, 645/291, 646/294, 940/16 и 81/1 - тест штамм. Готовили взвесь спор этих штаммов с таким расчетом, чтобы в 0,5 мл содержалось 100, 1000, 10000, 1 млн, 10 млн спор. Этими дозами заражали белых беспородных мышей (по 5 животных на одну дозу). Регистрировали гибель животных в течение 10 сут после заражения. После этого высчитывали LD₅₀. Павших животных вскрывали, делали высев из органов на агар Хоттингера, отмечали паталогоанатомические изменения у животных и делали мазки-отпечатки из органов с последующей окраской их по Ребигеру.

Одновременно с этим готовили чашку с агаром Хоттингера, предварительно в расплавленный и остуженный до 50^oС агар добавляли 1% бикарбоната натрия и 10% инактивированной лошадиной сыворотки. Стерильные фильтровальные бумажки (1,5 на 8 см) смачивали противосибиреязвенным коммерческим глобулином, накладывали их на остывший агар. Чашки для подсушивания ставили на 20 мин в термостат при 37^oС. После этого бляшками делали посев 7 штаммов из агаровых 1-суточных культур. Бляшки располагали по обе стороны бумажки. Для контроля токсигенности использовали вирулентный тест-штамм 81/1. Посевы ставили в микроанаэростат, затем вакуумным насосом откачивали 25% воздуха и замещали его углекислым газом. Посевы выращивали при 35-37^oС в течение 48 ч, затем чашку с посевами переносили в холодильник на 72 ч. Результаты даны в таблице 1.

Представленные сибиреязвенные штаммы были с пониженной вирулентностью, о чем свидетельствуют данные LD₅₀, а штамм 644/268 можно отнести к акапсульному варианту, штамм 81/1 - высоковирулентный штамм.

При заражении штаммом 644/268 у павших мышей при вскрытии не был обнаружен желеобразный отек подкожной клетчатки на месте введения. Поэтому токсинобразование у этого штамма в организме мышей оказалось под сомнением. Однако при посеве этого штамма на предложенную питательную среду с индикаторными бумажками четко были обнаружены линии преципитации. Такие же линии преципитации давали и другие штаммы.

Таким образом, можно предлагаемым способом выявить факторы патогенности сибиреязвенного микроба (токсино- и капсулообразование), не прибегая к проверке этих свойств на биопробных животных.

Пример 2. Готовили в соответствии с прописью две чашки среды СОПЭК и две чашки агара Хоттингера с 1% бикарбоната натрия и 10% инактивированной лошадиной сыворотки. На поверхность бикарбонатного агара накладывали фильтровальные полоски бумаги, смоченные коммерческим противосибиреязвенным глобулином, в то время как в среду СОПЭК коммерческий противосибиреязвенный глобулин добавляли в количестве 5,0 мл. Чашки с бумажками подсушивали в термостате 20 мин. Затем бляшками засевали среду СОПЭК и бикарбонатный агар 1-суточными агаровыми культурами различных сибиреязвенных штаммов. Засевали 23 штамма B. anthracis. На бикарбонатном агаре бляшки размещали по обе стороны бумажек, на расстоянии 1 см от края и 2 см друг от друга. Засеянные чашки помещали в микроанаэростат, из которого откачивали 25% воздуха и замещали углекислым газом, выдерживали при 35-37^oС в течение 48 ч, после чего учитывали капсулообразование, а затем чашки переносили в холодильник и выдерживали при 10^oС в течение 72 ч. По окончании этого срока учитывали токсинообразование. Сравнительные результаты по выявлению капсулообразования и токсинообразования предлагаемым способом и способом-прототипом отражены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, все испытуемые штаммы образовывали капсулу на обеих средах, за исключением 5 штаммов, выделенных из проб почв старых скотомогильников. Как уже было сказано выше, эти штаммы оказались с пониженной вирулентностью. По способности к токсинообразованию две среды также показали аналогичные результаты, исключение составляют два штамма - 1203 и 228/269, которые не образовали ореолы вокруг бляшек на среде СОПЭК. Следует отметить, что слизистые колонии, характерные для капсулообразующих штаммов, были более крупные и слизистые на бикарбонатном агаре; линии иммунопреципитации были более выражены также на этом агаре.

Таким образом, предлагаемый способ идентификации B.anthracis по способности образовывать токсин и капсулу in vitro повышает точность идентификации. Способ экономичен, не связан с использованием лабораторных животных и дорогостоящих аминокислот, а также прост для использования в лабораторных условиях.