способ иммунотерапии костно-мозговыми дендритными клетками больных солидными опухолями

Формула изобретения

Способ иммунотерапии костно-мозговыми дендритными клетками больных солидными опухолями, отличающийся тем, что после оперативного удаления опухолевого очага препарат в дозе 3х10⁶ клеток/кг веса пациента, находящегося в 3,0 мл официнального 0,9%-ного физиологического раствора для инъекций и 0,6 мл раствора альбумина человека, вводят внутрикожно в область опухоли и область регионарных лимфатических узлов в 12 точек по 0,3 мл, причем 3 первые вакцинации проводят каждый 7-й день, последующие от 3-х до 12-ти каждый 21-й день.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и может быть использовано для лечения больных с солидными опухолями.

Известен способ противоопухолевой иммунотерапии дендритными клетками больных солидными опухолями, полученными из аутологичных моноцитов периферической крови и активированных (нагруженных) опухолеассоциированными антигенами in vitro (Velu Т., Toungouz M., Faid L. et al. Immunotherapy using dendritic cells - Eur. Cytokine Netw., 2000, Vol.11, N 2, pp.306-308).

Прототипом нашего способа является противоопухолевая иммунотерапия аутологичными дендритными клетками, полученными из их костно-мозговых предшественников с фенотипом CD34⁺HLADR⁺CD13⁺CD14, активированных in vitro опухоль-ассоциированными антигенами (Nestle F. Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells: a follow-up, 6^th International Symposium on Dendritic Cells, 2000, Port Douglas, Australia: 46).

Согласно современным представлениям, индукция полноценного противоопухолевого иммунного ответа требует кооперации, по крайней мере, между тремя элементами иммунной системы: антигенпредставляющими клетками (АПК), Т-хелперами и цитотоксическими Т-лимфоцитами, где АПК, в том числе дендритные клетки, осуществляют представление специфических опухолевых антигенов в ассоциации с антигенами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) и костимулирующими сигналами для Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов.

Считается, что феномен "уклонения" опухолевых клеток от иммунологического надзора обусловлен уклонением от регуляторных влияний Т-лимфоцитов. Повреждение регуляторных функций Т-клеток в классическом цитотоксическом иммунном ответе рестриктированном антигенами ГКГС может привести к развитию злокачественной опухоли. Эти положения предопределили многочисленные попытки, предпринимаемые в настоящее время, воздействия на иммунную систему больных со злокачественной опухолью, путем активации лимфоцитов с противоопухолевой активностью (лимфокинактивированные киллеры, опухоль-инфильтрирующие лимфоциты) или стимуляция цитотоксических лимфоцитов иммунизацией опухоль-ассоциированными антигенами пациентов (вакцины). Это в ряде случаев позволяет преодолевать ареактивность иммунной системы в отношении опухоли и достигать отчетливого клинического эффекта. Однако фактическая эффективность подобной иммунотерапии недостаточна как с точки зрения частоты эффектов, так и их продолжительности. Одной из главных причин этого может быть быстрое подавление образования цитотоксических Т-лимфоцитов, которое в настоящее время объясняется дефектом АПК, в том числе дендритных клеток, представляющих большинство специфических антигенов для Т-клеток. Специфичность взаимодействия дендритных клеток с Т-хелперами и цитотоксическими Т-клетками обусловлена некоторыми их особенностями: эксперссией на поверхности высокого уровня молекул ГКГС класса I и II, и таким же высоким уровнем экспрессии разнообразных адгезивных и костимулирующих молекул. В связи с этим данные клетки оказываются наиболее эффективными в стимуляции вторичного иммунного ответа (в 100-1000 раз сильнее, чем В-клетки или макрофаги) и обладают исключительной способностью стимулировать первичный иммунный ответ, включая цитотоксические Т-лимфоциты.

Вместе с тем, как показали исследования, дендритные клетки, выделенные из периферической крови, как от экспериментальных животных с опухолями, так и от больных с установленным раком, были не способны стимулировать специфический ответ цитотоксических Т-лимфоцитов и слабо стимулировали Т-хелперы. Кроме того, на их поверхности было выявлено снижение экспрессии адгезивных и костимулирующих молекул и критическое снижение экспрессии молекул ГКГС, особенно класса I. Предполагается, что это может быть одной из главных причин отсутствия полноценного иммунного ответа на развивающуюся опухоль. Выращивание дендритных клеток из моноцитов периферической крови in vitro в условиях, позволяющих получить их максимальный рост и активацию, приводило к увеличению экспрессии поверхностных молекул, но уровень их оказывался недостаточным для устойчивого ответа специфических цитотоксических Т-лимфоцитов.

Наибольшей способностью по сравнению с дендритными клетками, полученными из моноцитов, к представлению специфического опухолевого антигена Т-лимфоцитам обладают костно-мозговые предшественники дендритных клеток с фенотипом CD34⁺HLADR⁺CD13⁺CD14, активированные in vitro опухоль-ассоциированными антигенами (Gabrilovich D. I., Ciernic I.F., Carbone D.P. Dendritic cells in antitumor immune responses. II. Dendritic cells grown from bone marrow pecursors, but not mature DC from tumor-bearing mice, are effective antigen carriers in the therapy of established tumors. Cell. Immunol., Vol.170, pp. 111-119). Только такие дендритные клетки в большинстве случаев стимулировали нормальный ответ цитотоксических Т-лимфоцитов. Имеющиеся экспериментальные и клинические данные, подтверждают противоопухолевую эффективность костно-мозговых дендритных клеток, стимулированных специфическими опухолеассоциированными антигенами. Результатов клинического исследования, аналогичного нашему методу, у больных солидными опухолями в доступной литературе не обнаружено. Это, наряду с безопасностью метода, позволяет считать активированные костно-мозговые дендритные клетки перспективными кандидатами для активной специфической иммунотерапии пациентов с распространенными формами солидных опухолей, в том числе и резистентных к стандартному лечению (химиотерапии, иммунотерапии, лучевой терапии).

Технический результат настоящего изобретения состоит в активации специфического противоопухолевого иммунного ответа на проводимую иммунотерапию. Этот результат достигается путем

- стимуляции выхода стволовых кроветворных клеток из костного мозга в периферическую кровь с помощью гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) ("Лейкомакс", 8 мкг/кг веса пациента подкожно, в течение 4-х дней);

- афереза стволовых кроветворных клеток на 5-й день на сепараторе клеток крови "Coba Spectra". При этом получают клеточную суспензию мононуклеаров, содержащую 40-8010⁶ клеток в 1 мл;

- выращивания клеточной суспензии в присутствии ГМ-КСФ в течение 12-14 дней. Разработанная методика позволяет получить 12610⁷-18910⁷ и более функционально полноценных неактивированных дендритных клеток с иммунофенотипом CD1a⁺HLА DR⁺CD14^-CD19^- CD3^-CD56^-;

- активации дендритных клеток аутологичным опухолевым лизатом в течение 48 часов и экспрессии на их клеточной поверхности костимулирующих антигенов CD80⁺, CD86⁺, а также адгезивной молекулы CD54⁺);

- введения аутологичных активированных дендритных клеток внутрикожно после оперативного удаления опухолевого очага по разработанной нами схеме:

- одна доза препарата - 310⁶ клеток/кг веса пациента находится в 3,0 мл официнального 0,9% физиологического раствора для инъекций и 0,6 мл раствора альбумина человека;

- вводится внутрикожно в область опухоли и область региональных лимфатических узлов в 12 точек по 0,3 мл;

- 3 первые вакцинации проводятся каждый 7-й день, последующие, от 3-х и до 12, каждый 21-й день (число вакцинаций определяется количеством выращенных дендритных клеток).

Большим преимуществом нашего метода является и тот факт, что мы руководствуемся критериями "включения" и "исключения" в исследование больных солидными опухолями, а также проводим оценку токсичности и эффективности иммунотерапии костно-мозговыми дендритными клетками у этой категории больных.

Критерии включения:

1. Гистологически или цитологически верифицированный диагноз метастатической формы солидной опухоли с очагами поражения, доступными для биопсии.

2. Мужчины и женщины старше 18 лет.

3. Наличие измеримых или оцениваемых очагов поражения, которые могут быть легко контролируемы физикальным обследованием или неинвазивными инструментальными методами.

4. Отсутствие какого-либо противоопухолевого лечения (химиотерапия, иммунотерапия, гормонотерапия) в течение последних 4-х недель или наличие явных признаков прогрессирования после их проведения.

5. Лабораторные исследования:

- клинический анализ периферической крови;

- биохимический анализ крови;

- иммунологические исследования.

6. Общее удовлетворительное состояние (индекс Карновского не менее 70%).

7. Ожидаемая продолжительность жизни не менее 3-х месяцев.

8. Подписание больным информированного согласия на участие в данном исследовании.

Критерии исключения:

1. Наличие метастатического поражения ЦНС.

2. Активный аутоиммунный процесс.

3. Больные с одной из перечисленных ниже инфекций: HIV-1, HIV-2, HBV, HCV, HTLV-1.

4. Наличие признаков системной инфекции или других тяжелых заболеваний сердечно-сосудистой, нервной, респираторной или эндокринной системы.

5. Наличие беременности или лактации.

6. Нарушение функции печени или почек (билирубин периферической крови >1,5N, креатинин - >1,5N).

7. Гематологические показатели:

- лейкоциты <2,510⁹/л

- лимфоциты <1,010⁹/л

- гемоглобин <90 г/л

- тромбоциты <7510⁹/л

8. Наличие в анамнезе опухоли другой локализации.

Оценка токсичности. Препарат должен быть безвреден для аутологичного больного. Контроль проводится в соответствии с критериями токсичности, рекомендованными ВОЗ. Мониторинг основных жизненных параметров (индекс Карновского, ЧСС, АД, температура оцениваются через 10, 30, 60 мин, 24 и 48 часов. Особое внимание уделяется лихорадке, гастроинтестинальной и гематологической токсичности, а также функции печени, почек и нервной системы. В случае развития выраженных побочных эффектов (3 или 4 степени) повторное введение аутологичных антигенспецифических дендритных клеток этому пациенту применяться не будет. Больной будет исключен из исследования, однако, динамическое наблюдение за ним будет продолжено.

Оценка эффективности. Оценка эффективности проводится на основании частоты и степени выраженности объективных лечебных эффектов и продолжительности лечебного эффекта. Выраженность объективного лечебного эффекта определяется перед каждым введением препарата на основании рекомендаций ВОЗ (Miller A. et al., 1981). Кроме того, у больных отдельно оценивается иммуногенная активность препарата для людей. Установлено, что аутологичный препарат вызывает рестриктированный иммунный ответ на опухолеассоциированные антигены солидной опухоли у 63% первично иммунизированных пациентов. Это проявляется приростом количества иммунокомпетентных клеток и усилением их функциональной активности. В связи с этим до начала иммунотерапии костно-мозговыми дендритными клетками больных солидными опухолями, а также перед 3-м и 6-м введением препарата и через 30 дней после его введения, а также через 6 и 12 месяцев от начала лечения определяются иммунологические показатели (гиперчувствительность замедленного типа, количество и функциональная активность цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-хелперов, В-клеток, естественных киллерных клеток и др.).

Изобретательский уровень и новизна метода заключается в том, что углубленное понимание механизмов прогрессии опухоли и взаимоотношений иммунной системы и опухоли, а также развитие биотехнологии обусловили реальные перспективы улучшения результатов лечения опухолей с помощью методов иммунотерапии. Несомненно этот метод позволит определить место иммунотерапии костно-мозговыми дендритными клетками в комплексном лечении больных солидными опухолями, наряду с химиотерапией, гормонотерапией, лучевой терапией и хирургическим лечением.

Положительный эффект нашего изобретения состоит в том, что мы предлагаем способ активации специфического противоопухолевого иммунитета на проводимую иммунотерапию аутологичными костно-мозговыми дендритными клетками в комплексном лечении больных распространенными формами солидных опухолей, в том числе резистентных к стандартному лечению (химиотерапии, иммунотерапии, лучевой терапии) с обязательным использованием показаний и противопоказаний к данному виду иммунотерапии.

Для лучшего понимания сущности заявленного изобретения, а также для подтверждения его соответствия условию "промышленная применимость", приводим примеры конкретной реализации способа.

Пример 1. Больной Е., 46 лет. Диагноз: Рак левой почки с метастазами в параортальные лимфатические узлы и в левые надключичные лимфоузлы. Лечение: Левосторонняя нефрэктомия (26.08.1999). Проведено 2 курса вакцинотерапии - 11 вакцинаций (1 курс - 5 вакцинаций) дендритными клетками, выращенных из аутологичных костно-мозговых предшественников и активированных лизатом аутологичных опухолевых клеток, с интервалом одна неделя был проведен с 11.02.2000 по 17.03.2000. В процессе 1-го курса вакцинотерапии наблюдалось прогрессирование заболевания (увеличение на 0,9 см в диаметре надключичных лимфоузлов слева), в то время как в области параортальных лимфатических узлов наблюдалась стабилизация метастатического образования (по данным компьютерной томографии). С 28.04.2000 по 02.06.2000 был проведен 2-й курс вакцинотерапии (6 вакцинаций). В области параортальных лимфатических узлов - по-прежнему стабилизация метастатического образования; в надключичной области - тенденция к росту, увеличение метастатического образования на 0,2 см в период с 28.04.2000 по 19.09.2000. С 19.09.2000 г. больной получил 20 сеансов лучевой терапии на аппарате РОКУС. 23.10.2000 г. отмечен регресс метастатического образования в левой надключичной области >50%. На момент последнего обследования (май 2001 г.) - состояние метастатических образований параортальных лимфатических узлов и надключичных лимфатических узлов оценивалось как стабилизация.

Пример 2. Больной П., 47 лет. Диагноз: Рак левой почки, вторичные изменения в области рукоятки грудины (деструкция небольшого участка верхней трети грудины). Лечение: Нефрэктомия слева (13.12.2000 г.). Проведен 1 курс вакцинотерапии - 10 вакцинаций дендритными клетками (с 26.01.2001 по 11.05.2000), выращенных из аутологичных костно-мозговых предшественников и активированных лизатом аутологичных опухолевых клеток: с интервалом одна неделя - 5 вакцинаций; две недели - последующие 5 вакцинаций. На основании заключений компьютерной томографии (от 06.12.2000 г. и 16.08.2001 г.) отмечается стабилизация метастатического образования.

Таким образом, мы предлагаем способ иммунотерапии костно-мозговыми дендритными клетками больных солидными опухолями наряду с традиционными методами: химиотерапией, лучевой терапией, хирургическим лечением.