способ определения ингибирующего действия веществ на комплемент in vivo на модельных животных

Формула изобретения

Способ определения ингибирующего действия веществ на комплемент in vivo на модельных животных, отличающийся тем, что в качестве модельного животного используют беспородных мышей, которым вводят сыворотку крови норок в количестве, вызывающем гибель животных, при этом одновременно или за 2 мин до введения сыворотки крови норок вводят исследуемое вещество, эффективность ингибирующего действия которого определяют по его минимальной концентрации, отменяющей гибель модельных животных.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения ингибирующего действия веществ на комплемент на модельных животных.

Наиболее близким прототипом является животная модель на основе морской свинки [1] , которой внутривенно вводят кроличью иммунную сыворотку, содержащую антитела к эритроцитам морской свинки. В результате такого введения часть животных гибнет, после забоя всей группы животных проводится оценка степени кровоизлияния в легкие. Кровоизлияние наблюдается у всех животных группы. Для изучения способности веществ отменять действие комплемента за две минуты до введения иммунной сыворотки животным также внутривенно вводят тестируемое вещество. По отмене гибели животных и снижения степени кровоизлияния в легкие судят об эффективности ингибирующего действия вещества на комплемент in vivo.

Недостатком этого способа является относительная дороговизна морских свинок, отсутствие простого однозначного ответа (неполнота гибели животных), необходимость приготовления дополнительно иммунной сыворотки с достаточно высоким титром и необходимость проведения дополнительных исследований степени кровоизлияния в легкие у экспериментальных животных.

Задача: упрощение и удешевление определения ингибирующего действия веществ на комплемент in vivo на модельных животных.

Разработан способ, позволяющий определять ингибирующее действие веществ на комплемент на модельных животных с использованием в качестве модельных животных беспородных мышей, а в качестве источника комплемента и антител к клеткам крови животного сыворотку норок, комплемент которой обладает высокой активностью и в которой присутствуют в высоких титрах естественные антитела к эритроцитам мышей.

Техническим результатом заявленного изобретения является относительная дешевизна и доступность беспородных мышей, однозначность ответа (выживание - гибель), не требующая дополнительных исследований, и использование в качестве дополнительных средств только сыворотки норки без дополнительной иммунизации животных.

Способ осуществляется следующим образом. Мышам вводят внутривенно (в ретроорбитальное венозное сплетение) сыворотку норки в количестве менее 0,1 мл на мышь, которое приводит к гибели мыши (зависит от веса мыши и активности имеющейся сыворотки норки). Для исследования действия ингибитора последний вводят одновременно или за 2 мин до введения сыворотки норки. Эффективность ингибитора определяют по тому его минимальному вводимому количеству, которое отменяет гибель животных. Способ основан на способности сыворотки норки убивать мышей при внутривенном введении благодаря действию системы комплемента.

Пример. В опытах использовали белых беспородных мышей весом 16-18 г. В контрольных группах животным вводили в ретроорбитальное венозное сплетение 0,06-0,08 мл сыворотки крови норки, доведенной до объема 1 мл раствором 0,15 М NaCl. В опытных группах животных в этом растворе дополнительно содержалось 10 мг ингибитора. В одном из опытов 10 мг ингибитора в объеме 0,5 мл вводили за 2 мин до введения сыворотки норки также в общем объеме 0,5 мл. В качестве ингибиторов использовали известные ингибиторы комплемента гепарин [2] и сурамин [3]. Число погибших животных подсчитывали через сутки. Результаты опытов приведены в таблице.

Из данных таблицы следует, что введение 3 мг сурамина или 0,3 мг гепарина на мышь отменяет гибель мышей, вызываемую внутривенным введением 0,08 мл сыворотки норок. Таким образом, известные ингибиторы комплемента способны ингибировать его действие in vivo на модельных животных, при этом эффективность гепарина в 10 раз выше эффективности сурамина.

ЛИТЕРАТУРА

1. Higgins P.J., Ko J.-L., Lobell R., Sardonini C., Alessi M.K., Yeh C. G. A soluble chimeric complement inhibitory protein that possesses decay-accelerating and factor I cofactor activities // J. Immunol. 1997. V.158. 6. Р.2872-2881.

2. Maillet F., Petitou M., Choay J., Kazatchkin M.D. Structure-function relationships in the inhibitory effect of heparin on complement activation: independency of the anty-coagulant anti-complementary sites on the heparin molecule // Molecular Immunology. 1988. V.25. 9. P.917-923.

3. Saez C., Thielens N.M., Bjes E.S., Esser A.F. Association of terminal complement proteins in solution and modulation by suramin // Biochemistry. 1999. V.38. 21. Р.6897-6816.