способ приготовления инактивированной вакцины против лейкоза крупного рогатого скота

Формула изобретения

Способ приготовления инактивированной вакцины против лейкоза крупного рогатого скота, включающий культивирование вируссодеращих лейкоцитов периферической крови крупного рогатого скота больного лейкозом, инактивацию и получение антигена, отличающийся тем, что, культивирование лейкоцитов проводят 24-26 ч при посевной концентрации 5-1010⁶ клеток на 1 мл среды, затем осаждают лейкоциты центрифугированием, готовят суспензию на среде Игла с концентрацией 10 млн клеток на 1 мл среды, фиксируют лейкоциты и инактивируют содержащийся в них вирус путем добавления 5 объемов 2-3%-ного раствора глютарового альдегида, инкубируют при комнатной температуре в течение 30-40 мин, лейкоциты трижды отмывают в забуференном физрастворе с рН 7,2-7,4, ресуспендируют в среде Игла из расчета 100 млн лейкоцитов в 1 мл и используют их в качестве иммунизирующего агента.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способам производства вакцин против гемобластозов крупного рогатого скота.

Лейкоз крупного рогатого скота широко распространен в нашей стране, и в большинстве регионов мира, нанося большой ущерб животноводству.

В настоящее время известны способы получения вакцин против лейкозных заболеваний у различных видов животных.

Известен способ получения вакцины для иммунизации птиц против лимфоидного лейкоза и эритробластоза путем получения смеси живых клеток и измельченных тканей, инфицированных этим вирусом, в фармацевтической жидкости, при этом концентрация смеси такова, что в 10-200 мл жидкости содержится 1 г смеси. В качестве исходного материала используют ткань почки, селезенки или печени больного животного [1].

Известен способ приготовления вакцины против лейкоза кошек, получаемой из клеток культуры, инфицированной вирусом лейкоза кошки. Вакцина состоит из клеток, зараженных вирусом лейкоза кошки, или из инактивированных частиц вируса лейкоза, выделенных из клеток культуры [2].

Известен также способ получения вакцины против лейкоза крупного рогатого скота, включающий культивирование вируссодержащих клеток, выделение клеток и вирусного материала из культуральной жидкости, разрушение клеток и вирусного материала с одновременным инактивированием содержащихся в них нуклеиновых кислот и последующим выделением белковых фракций р25 и gp70, используемых в качестве иммунизирующего агента [3].

Задачей наших исследований было разработать способ получения экологически безопасной инактивированной вакцины, обладающей иммуногенностью против лейкоза крупного рогатого скота

Сущность предложенного способа заключается в том, что в качестве иммуногена используют лейкоциты периферической крови крупного рогатого скота, больного лейкозом, несущие как вирус лейкоза крупного рогатого скота, так и опухолевые и трансплантационные антигены, культивированные в течение 24-36 ч в питательной среде, состоящей из среды Игла или РПМИ 1640 - 90% и 10% инактивированной сыворотки эмбрионов коров или овечьей сыворотки. Культивированные клетки и содержащийся в них вирусный материал, опухолевые и трансплантационные антигены подвергают фиксации 2-3% раствором глютарового альдегида в течение 30-40 мин с одновременным инактивированием вируса и ресуспендируют в забуференном физрастворе рН 7,2-7,4 из расчета 1010⁷ клеток в 1 мл. Одна иммунизирующая доза составляет 50-10010⁶ клеток.

К вакцине прилагается адъювант, гидрат окиси алюминия коллоидный по ГОСТ 18287-81. Непосредственно перед применением вакцину смешивают с адъювантом в соотношении 1:1. Вакцину вводят подкожно в область шеи.

Иммунизацию проводят трехкратно с интервалом 10-14 дней в вышеуказанной дозе.

Инактивированная вакцина против лейкоза крупного рогатого скота, приготовленная согласно предложенному способу, апробирована с положительным результатом в лабораторных и производственных условиях.

Вакцина безвредна и нереактогенна при трехкратном введении подкожно для крупного рогатого скота в возрасте от 2 мес до 2 лет (табл.).

Пример 1.

Из периферической крови выделяют лейкоциты методом гемолитического шока эритроцитов путем добавления к 1 объему стабилизированной крови двух объемов дистиллированной воды с последующим восстановлением изотоничности раствора или двух объемов 0,85%-ного раствора хлорида аммония. Выделенные клетки ресуспендируют в культуральной среде следующего состава: инактивированная сыворотка эмбрионов коров или овечья сыворотка - 10%, среда Игла или РПМИ 1640 - 90% из расчета 1010⁶ клеток на 1 мл среды. После 24 ч культивирования при 37^oС лейкоциты осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 мин и ресуспендируют в среде Игла или РПМИ 1640 из расчета 10 млн клеток на 1 мл среды.

К 100 мл полученной суспензии добавляют 500 мл 3,0%-ного раствора глютаральдегида и инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Затем клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок трижды отмывают в забуференном физрастворе с рН 7,2-7,4 и ресуспендируют в среде Игла из расчета 100 млн клеток в 1 мл.

Иммунизацию проводят трехкратно с интервалом 14 дней.

При первой иммунизации полученный материал вводили подкожно в дозе 100 млн клеток в области шеи телятам в возрасте 2-3 мес с адъювантом в соотношении 1:1.

Вторую и третью иммунизацию проводили без адъюванта в тех же дозах.

Через 2 недели после третьего введения препарата проводили контрольное заражение вирусом лейкоза крупного рогатого скота всех вакцинированных и невакцинированных животных контрольной группы. Заражение проводили лейкоцитами, выделенными из крови больного лейкозом животного, в дозе 250000 клеток на одно животное, что составляет 100 инфекционных доз.

Все животные контрольной группы заразились вирусом лейкоза, тогда как вакцинированные животные оставались неинфицированными. Напряженность иммунитета составляет 8 мес.

Пример 2.

Из периферической крови больного лейкозом крупного рогатого скота животного выделяют клетки, как описано в примере 1. Клетки культивируют в среде РПМИ 1640, содержащей 10% инактивированной сыворотки овец из расчета 5,010⁶ клеток на 1 мл среды. После 36 ч культивирования лейкоциты фиксируют 2% раствором глютарового альдегида в течение 40 мин.

Полученную вакцину с адъювантом вводят подкожно нетелям 20 -24- месячного возраста по схеме, аналогичной примеру 1. Вакцинированных нетелей размещают в неблагополучном по лейкозу стаде (с уровнем инфицированности 70%) в условиях тесного контакта.

Через 12 месяцев наблюдения 85% вакцинированных животных оставались незараженными.

Изготовленная по предложенному способу вакцина найдет применение в неблагополучных по лейкозу хозяйствах, позволит ускорить в 2-3 раза сроки оздоровления этих хозяйств и снизить затраты на оздоровление.

Источник информации

1. Патент США 3590128, кл. 424-89, 1973.

2. Патент Франции 2243702, кл. A 61 K 39/12, 1975.

3. Авт.св. СССР 820015, кл. A 61 K 39/12, 1980.