композиция для ухода за кожей

Формула изобретения

1. Косметическая композиция для ухода за кожей, включающая 0,0001-50% органического экстракта нута обыкновенного, обеспечивающего эстрогенную активность, эквивалентную по крайней мере 1 нмоль экстрадиола, 5-99% косметически приемлемого носителя, включающего косметически приемлемый разбавитель, диспергатор и/или наполнитель, необязательно 5-99% косметически приемлемых смягчителей, растворителей, увлажняющих веществ, загустителей.

2. Косметический способ снабжения кожи человека фитоэстрогеном, включающий нанесение на кожу косметической композиции по п.1.

3. Косметический способ улучшения внешнего вида морщинистой, со складками, сухой, шершавой, старой или фотоповрежденной кожи и улучшения толщины, эластичности, гибкости и упругости кожи, включающий нанесение на кожу косметической композиции по п.1.

4. Косметический способ повышения пролиферации фибробластов в коже человека, включающий нанесение на кожу косметической композиции по п.1.

5. Косметический способ повышения пролиферации эпидермальных клеток кожи, включающий нанесение на кожу косметической композиции по п.1.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Косметические композиции, содержащие органический экстракт нута обыкновенного, и способы кондиционирования кожи путем нанесения таких композиций на кожу.

Предпосылки создания изобретения

Кожа человека состоит из двух основных слоев: нижнего, более толстого слоя, дермы, и верхнего, более тонкого слоя, эпидермиса. Дерма представляет собой слой, который обеспечивает прочность, эластичность и толщину кожи.

Главным типом клеток дермы являются фибробласты, которые ответственны за синтез и выделение всех компонентов дермальной матрицы, таких, как коллаген, эластин и гликозамингликаны. Коллаген обеспечивает прочность, эластин придает эластичность и гликозамингликаны обеспечивают влажность и упругость кожи. Со старением толщина дермального слоя уменьшается, и это считают частично ответственным за образование морщин в случае стареющей кожи. Верхний слой кожи, или эпидермис, который обеспечивает эластичность и барьерные свойства кожи, состоит из множества различных типов клеток, включающих кератиноциты, меланоциты и клетки Лангерганса. Кератиноциты представляют собой преобладающий тип клеток эпидермиса (75-80% от общего числа клеток в человеческом эпидермисе). Richards и др. сообщили, что эстроген стимулирует выделение протеина, пролактина, человеческими дермальными фибробластами и что пролактин затем стимулирует пролиферацию кератиноцитов (Richards и др.. Human Dermal Fibroblasts Express Prolactin In Vitro, J. Invest. Dermatol., 106, 1250 [1996]).

Эстрогены и синтетические соединения, которые действуют подобно эстрогенам, известны в отношении увеличения толщины дермального слоя и уменьшения образования морщин в случае стареющей кожи. Изменения в коже, такие, как сухость кожи, потеря кожей эластичности и упругости, происходящие после менопаузы, приписывают недостатку продуцирования эстрогена. Терапия с использованием эстрогена предотвращает или замедляет многие из этих изменений, связанных со стареющей кожей (Creidi и др., Effect of a conjugated estrogen cream on aging facial skin, Maturitas, Г9, 211 [1994]). Некоторые из воздействий эстрогена на кожу включают: увеличение толщины кожи и исчезновение мелких морщин, возрастание скорости митоза эпидермиса, уменьшение величины и активности сальной железы, замедление скорости роста волос, стимуляция обновления коллагена и увеличение продуцирования гиалуроновой кислоты и гликозаминогликанового синтеза фибробластов (Pugliese, Menopausal Skin. Skin Inc. , март/апрель 1994, с. 69-77).

В последние годы фитоэстрогены (то есть природные соединения, которые обладают эстрогеноподобной активностью и которые обнаружены в растениях) все больше и больше используют в терапевтических целях. Некоторыми из этих описанных применений являются использование в качестве гипохолестеринемических и антиатерогенных агентов, для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, особенно в случае постклимактерических женщин, для лечения остеопороза у пожилых людей и в качестве противоракового средства, главным образом против рака молочной железы, эндометриального и цервикального рака у женщин (Knight и др., Phytoestrogens (краткий обзор), Maturitas, 22, 167-175 [1995]).

В последние годы возрос потребительский спрос на продукты на "натуральной" основе. Потребители воспринимают химический синтез как опасный для окружающей среды. Синтезированный химическим путем ингредиент может содержать "жесткие" химические продукты. Природные продукты воспринимаются как чистые и "мягкие" и превосходящие синтезированные химическим путем продукты. Однако достижение косметического благоприятного воздействия растительных источников не является тривиальным. Для того чтобы получить реальную пользу от "природного" источника, нужно идентифицировать не только растение или часть растения, обладающее (обладающую) удельной активностью, но и нужно установить минимальную концентрацию и/или получить специфический экстракт из этого растения, которая (который) точно оказывает благоприятное косметическое воздействие.

Свыше 500 соединений, присутствующих в растениях, описаны в отношении эстрогенной активности. Эти соединения, в совокупности называемые фитоэстрогенами, обнаружены в некотором количестве разных растений, включая хлебные злаки, бобовые (включая нут обыкновенный) и травы (Price и др., Naturally occurring estrogens in foods, (обзор). Food additives and contaminants, 2, 73-106 [1985]). Их концентрации изменяются в разных частях растений, в зависимости от географического нахождения, года развития и т.д. Двумя основными классами соединений растительного происхождения, которые обладают фитоэстрогенной активностью, являются флавоноиды и куместаны. Некоторыми из обычно описываемых фитоэстрогенных соединений являются генистеин, биоханин А, формононетин, даидзеин и их гликозидные производные (Knight и др., Phytoestrogens (краткий обзор), Maturitas, J. Climacteric, and postmenopause, 22, 167-175 [1995]).

Нут обыкновенный или нут полевой (Cicer arietinum), обыкновенная диетическая чечевица, содержит флавоноиды, включающие даидзеин, формононетин, биоханин А, пратензеин, гомоферреирин, медикарпин, маакиаин, метил-куместрол, медикагол, формононетин-глюкозид и биоханин А-глюкозид (Ingham и др., в "Progress in the chemistry of Organic natural products", том 43, под ред. W. Herz и др., Springer-Verlag, Wien, New York, 1983). Описано, что флавоноиды нута обыкновенного обладают снижающими уровень липидов воздействиями в случае крови и печени крыс. В некоторых исследованиях в отношении питания сообщается о протеине нута обыкновенного для использования в качестве пищевых добавок и путях улучшения качества протеина нута обыкновенного. Vasiliou, патент США 4761285, описывает использование нута обыкновенного в качестве диетической добавки или для внутреннего или локального лечения геморроидальных узлов. В Индии, косметическая маска или обработка кожи, которую осуществляют при использовании порошка нута обыкновенного, смешанного с водой, представляет собой обычный косметический уход за кожей.

В международной заявке 96/38162 описываются различные применения лектинов, происходящих из inter alia нута обыкновенного, включая восстановление внешнего вида морщинистой кожи.

В обсужденном выше уровне техники не описываются органические экстракты нута обыкновенного для ухода за кожей или косметического использования. В уровне техники нет сведений о локальном применении органических экстрактов нута обыкновенного в качестве фитоэстрогена и с установленной эстрогенной активностью.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции для ухода за кожей, включающей:

(I) органический экстракт нута обыкновенного в таком количестве, чтобы обеспечить эстрогенную активность, эквивалентную по крайней мере 1 нмоль эстрадиола, причем эстрогенную активность определяют с помощью теста, описанного в примере 1 описания;

(II) косметически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также относится к способу улучшения или предотвращения состояния морщинистой, со складками, сухой, шелушащейся, старой или фотоповрежденной кожи и улучшения толщины, эластичности, гибкости и упругости кожи, включающему нанесение на кожу композиции согласно изобретению. Композиции согласно изобретению предназначены для локального нанесения на кожу млекопитающего, которая является уже сухой, шелушащейся, со складками, морщинистой, старой, фотоповрежденной, или композиции согласно изобретению можно наносить профилактически на нормальную здоровую кожу с целью предотвращения или уменьшения ухудшающих изменений.

Настоящее изобретение также относится к косметическому способу повышения пролиферации фибробластов и эпидермальных клеток кожи в случае человеческой кожи путем нанесения на кожу композиции согласно изобретению.

Подробное описание изобретения

Нут обыкновенный

Нут обыкновенный пригоден для использования в композициях согласно изобретению в форме органического экстракта. Экстракт нута обыкновенного для использования в настоящем изобретении получают из сухого нута обыкновенного. Сухой нут обыкновенный может быть получен из Arrowhead Mills (мукомольных заводов), магазинов диетических пищевых продуктов или супермаркетов.

Органические экстракты нута обыкновенного получают путем экстракции сухого нута обыкновенного с помощью растворителя путем перемешивания 1 части сухого нута обыкновенного с 2-5 частями растворителя в течение 4-24 часов при комнатной температуре. Пригодные растворители указываются ниже. Экстракты осветляют путем фильтрации и/или центрифугирования, затем высушивают путем выпаривания (необязательно в вакууме) для получения органического экстракта нута обыкновенного.

Пригодные для получения экстракта нута обыкновенного растворители для использования в настоящем случае включают, но не ограничивающим образом, следующие: этанол, метанол, гексан, хлороформ, дихлорметан и этилацетат. Предпочтительными растворителями являются дихлорметан, метанол или этанол, для того, чтобы оптимизировать активность. Экстракт, далее, можно концентрировать, фракционировать, снова экстрагировать или очищать, например, путем экстракции органическим растворителем или путем хроматографии.

Найдено, что составляет часть настоящего изобретения, что для достижения эстрогенной активности органический экстракт нута обыкновенного нужно использовать в специфически минимальном количестве.

Экстракт или порошок нута обыкновенного используют в количестве от 0,0001 до 50%, пока он проявляет эстрогенную активность, эквивалентную по крайней 1 нмоль, обычно в пределах от 1 нмоль до 100 нмоль, эстрадиола. Эстрогенную активность экстракта нута обыкновенного определяют путем сравнения с активностью 1 нмоль эстрадиола при использовании клеток ZR-75 в осуществляемом параллельно эксперименте, как описано в примере 1 - ниже. Предпочтительно, экстракт нута обыкновенного используют в таком количестве, чтобы достигать эстрогенной активности, эквивалентной по крайней мере 2 нмоль эстрадиола.

Косметически приемлемый носитель

Композиция согласно изобретению также включает косметически приемлемый носитель, действующий как разбавитель, диспергатор или носитель для экстракта нута обыкновенного в композиции, также, как для облегчения его распределения, когда композицию наносят на кожу.

Носители, другие, чем вода, или в дополнение к воде, могут включать жидкие или твердые смягчители, растворители, влагоудерживающие вещества, загустители и порошки. Особенно предпочтительным неводным носителем является полидиметилсилоксан и/или полидиметилфенилсилоксан. Согласно настоящему изобретению могут быть использованы силиконы с вязкостью в пределах примерно 10-10000000 сантистокс при температуре 250^oС. Особенно желательными являются смеси силиконов с низкой и высокой вязкостью. Эти силиконы выпускаются фирмой General Electric Company под торговыми названиями Vicasil, SE и SF, и фирмой Dow Corning Company, серии 200 и 550. Количество силикона, которое может быть использовано в композиции настоящего изобретения, колеблется в пределах от 5 до 95 мас.%, предпочтительно, от 25 до 90 мас.%, в расчете на массу композиции.

Косметически приемлемый носитель обычно составляет 5-99,9 мас.%, предпочтительно 25-80 мас. %, по отношению к массе композиции, и, в отсутствие других косметических добавок, может составлять баланс композиции. Предпочтительно, носитель включает по крайней мере 80 мас.% воды, по отношению к массе носителя. Вода предпочтительно составляет по крайней мере 50 мас.% композиции согласно изобретению, более предпочтительно 60-80 мас.%, по отношению к массе композиции.

Дополнительные вещества для оказания благоприятного воздействия на кожу и косметические добавки

Вместе с эмульгатором может присутствовать масло или маслянистое вещество для обеспечения либо эмульсии вода-в-масле, либо эмульсии масло-в-воде, в значительной степени в зависимости от обычного гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) используемого эмульгатора.

Композиции согласно изобретению предпочтительно включают солнцезащитные фильтры. Солнцезащитные фильтры представляют собой вещества, которые обычно используют для блокирования ультрафиолетового света. Иллюстративными соединениями являются производные п-аминобензойной кислоты, циннамат и салицилат. Например, могут быть использованы октилметоксициннамат и 2-гидрокси-4-метоксибензофенон (также называемый как оксибензон). Октилметоксициннамат и 2-гидрокси-4-метоксибензофенон являются коммерчески доступными веществами под торговыми названиями, соответственно, Parsol МСХ и бензофенон-3. Точное количество солнцезащитного фильтра, используемого в эмульсиях, может изменяться в зависимости от желательной степени защиты от солнечного ультрафиолетового излучения.

Смягчители часто включают в состав косметических композиций согласно настоящему изобретению. Содержания таких смягчителей могут колебаться в пределах от 0,5 до 50 мас.%, предпочтительно от 5 до 30 мас.%, по отношению к массе всей композиции. Смягчители могут быть классифицированы по таким общим химическим категориям, как сложные эфиры, жирные кислоты и спирты, полиолы и углеводороды.

Сложные эфиры могут представлять собой сложные моно- или диэфиры. Приемлемые примеры сложных жирных диэфиров включают дибутиладипат, диэтилсебацат, диизопропилдимерат и диоктилсукцинат. Приемлемые эфиры жирных кислот с разветвленной цепью включают 2-этилгексилмиристат, изопропилстеарат и изостеарилпальмитат. Приемлемые эфиры трехосновных кислот включают триизопропилтрилинолеат и трилаурилцитрат. Приемлемые эфиры жирных кислот с линейной цепью включают лаурилпальмитат, миристиллактат и стеарилолеат. Предпочтительные сложные эфиры включают каприлаты/капраты жирных кислот кокосового масла (смесь каприлатов и капратов жирных кислот кокосового масла), ацетат простого миристилового эфира пропиленгликоля, диизопропиладипат и цетилоктаноат.

Пригодные жирные спирты и кислоты включают такие соединения, которые содержат 10-20 атомов углерода. Особенно предпочтительными являются такие соединения, как цетиловый, миристиловый, пальмитиновый и стеариловый спирты и гексадекановая, миристиновая, пальмитиновая и стеариновая кислоты.

Полиолами, которые могут служить в качестве смягчителей, являются алкилполигидроксильные соединения с линейной или разветвленной цепью. Например, предпочтительны пропиленгликоль, сорбит и глицерин. Также могут быть пригодны полимерные полиолы, такие, как полипропиленгликоль и полиэтиленгликоль. Бутиленгликоль и пропиленгликоль также особенно предпочтительны в качестве усилителей проникновения в кожу.

Типичными углеводородами, которые могут служить в качестве смягчителей, являются таковые, углеводородные цепи которых содержат 12-30 атомов углерода. Особые примеры включают минеральное масло, вазелин, сквален и изопарафины.

Другой категорией функциональных ингредиентов в косметических композициях согласно настоящему изобретению являются загустители. Загуститель обычно находится в количествах в пределах 0,1-20 мас.%, предпочтительно примерно 0,5-10 мас.%, по отношению к массе композиции. Типичными загустителями являются сшитые полиакрилатные материалы, выпускаемые в продажу фирмой В.F. Goodrich Company под торговым названием Carbopol. Могут быть использованы смолы, такие, как ксантановая смола, каррагенан, желатина, камедь карайи, пектин и камедь плодов рожкового дерева. В некоторых случаях, функцию загустевания может выполнять вещество, служащее также в качестве силикона или смягчителя. Например, силиконовые смолы с вязкостями выше 10 сантистокс и сложные эфиры, такие, как глицеринстеарат, обладают обоими функциями.

В косметическую композицию согласно изобретению можно вводить порошки. Эти порошки включают мел, тальк, каолин, крахмал, смектитные глины, химически модифицированный алюмосиликат магния, органически модифицированную монтмориллонитовую глину, гидратированный силикат алюминия, дымящий оксид кремния, алюминийоктенилсукцинат крахмала и их смеси.

В косметическую композицию также могут быть включены другие добавочные второстепенные компоненты. Эти ингредиенты могут представлять собой красители, опалесцирующие компоненты и отдушки. Количества этих других добавочных второстепенных компонентов могут колебаться в пределах от 0,001 до 20 мас.%, по отношению к массе композиции.

Применение композиции

Композиция согласно изобретению предназначена главным образом в качестве продукта для локального нанесения на кожу человека, особенно в качестве компонента для кондиционирования, увлажнения кожи и придания ей гладкости, для увеличения ее толщины, гибкости и эластичности и для предохранения от или уменьшения появления морщинистой, со складками или старой кожи.

При применении, небольшое количество композиции, например, 1-100 мл, наносят на подвергаемый воздействию участок кожи, из подходящего контейнера или аппликатора, и, если необходимо, затем ее распространяют по и/или втирают в кожу рукой или пальцами или с помощью подходящего приспособления.

Форма продукта и упаковка

Композиция для локального ухода за кожей согласно изобретению может быть получена в виде лосьона, крема или геля. Композиция может быть упакована в подходящий контейнер, подходящий ее вязкости и предназначенный для использования потребителем. Например, лосьон или крем может быть упакован во флакон или аппликатор с вращающимся шариком, или в устройство для аэрозоля, содержащего пропеллент, или в контейнер, снабженный подходящим насосом для приведения в действие пальцем. Когда композиция представляет собой крем, ее можно просто хранить в недеформируемом флаконе или мягком (легко сжимаемом) контейнере, таком, как туба или баночка с крышкой. Композицию можно также включать в капсулы, такие, как капсулы, описанные в патенте США 5063507, включенный в настоящее описание в виде ссылки. Согласно изобретению также предусматривается закрытый контейнер, содержащий косметически приемлемую композицию, как указанная в настоящем описании.

Следующие особые примеры иллюстрируют далее изобретение, но не ограничивая его объема охраны. Все значения р в примерах рассчитаны с использованием t критерия Стьюдента.

Пример 1

Этот пример иллюстрирует, возможность применения органического экстракта нута обыкновенного в концентрации, обеспечивающей фитоэстрогенную активность, эквивалентную по крайней мере 1 нмоль эстрадиола, согласно настоящему изобретению.

Приготовление экстрактов нута обыкновенного.

Сухой нут обыкновенный получают из мукомольных заводов (Arrowhead Mills) (Hareford, TX) и растирают в порошок в мельнице для сухого помола. Полученный таким образом порошок нута обыкновенного экстрагируют, используя дихлорметан или метанол (1:3 вес/объем), путем перемешивания сухого порошка с растворителем в течение 20 часов при комнатной температуре. Экстракты осветляют путем фильтрации и центрифугирования. Затем экстракты высушивают путем выпаривания в вакууме с получением сухого экстракта. При экстракции 63 г сухого порошка нута обыкновенного дихлорметаном растворяется 1,47 г сухого материала; при экстракции 60 г порошка нута обыкновенного метанолом растворяется 2,434 г сухого материала. Это составляет 2,31% при экстракции дихлорметаном и 4,06% при экстракции метанолом. Этот сухой экстракт затем снова растворяют в диметилсульфоксиде при концентрации 50 мкг/мл для тестирования на клетках.

Методология определения скорости синтеза ДНК в клетках.

Включение ³Н-тимидина культивируемыми клетками используют как тест на пролиферацию клеток (ZR75 или кератиноцитов). Тимидин является одним из четырех дезоксинуклеозидов, которые представляют собой мономерные звенья ДНК. Перед делением соматических клеток в делящихся клетках происходит репликация генома. Это подразумевает синтез ДНК клеткой и позволяет обеим дочерним клеткам получить идентичные копии генетического материала. Когда ³Н-тимидин включают в среду для культивирования клеток, которые синтезируют ДНК перед клеточным делением, тогда меченый тимидин включается во вновь синтезируемую ДНК. Уровень включения ³Н-тимидина в популяцию клеток пропорционален скорости синтеза ДНК этой популяцией клеток и, следовательно, характеризует клеточной пролиферации.

Следующий тест осуществляют для определения, обладают ли органические экстракты нута обыкновенного фитоэстрогенной активностью и эквивалентна ли эта активность по крайней мере 1 нмоль эстрадиола.

Клеточная линия ZR75 представляет собой клеточную линию рака протоков молочной железы, по происхождению изолированную из злокачественного эпителия молочной железы шестидесятитрехлетней жительницы Кавказа (Engel и др., Human breast carcinoma cells in continuous culture (обзор), Cancer Res., 38, 4327-4339 [1978] ). Эта клеточная линия содержит рецепторы для эстрогена, прогестерона и других стероидных гормонов, однако, реагирует посредством увеличения пролиферации только в отношении эстрогена. Клеточная линия содержит высоко аффинные эстроген-специфические рецепторы. Поэтому эту клеточную линию используют для тестирования эстрогеноподобной активности (Markiewicz и др. , In vitro bioassays of non-steroidal phytoestrogens, J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 45, 399-405 [1993]).

1. Клетки ZR75 (Американская коллекция типов культур, Роквилл, Мэриленд) выращивают в среде RPMI 1640 (фирма Gibco Life Technologies) с 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 единицами пенициллина на мл и 100 единицами стрептомицина на мл. Вышеуказанная среда не содержит фенолового красного (слабый эстрогенный миметик). Посев клеток производят при плотности один миллион на 75 см матраса для культивирования клеток. Для эксперимента, посев клеток производят в 24-луночные планшеты в количестве 100000 клеток на мл на лунку.

2. После культивирования в течение 24-х часов среду удаляют, клетки промывают PBS и добавляют 1 мл среды RPMI 1640 без сыворотки (но со стрептомицином и пенициллином). Готовят исходные растворы экстракта нута обыкновенного в диметилсульфоксиде (ДМСО) и эстрадиола в воде. Затем непосредственно в каждую лунку дозируют различные концентрации органического экстракта нута обыкновенного и эстрадиола, как указано в таблице 1. Спустя следующие 24 часа, в каждую лунку добавляют 1 Сi [метил-³Н] тимидина. Среду удаляют спустя 24 часа. Клетки промывают один раз PBS, PBS полностью удаляют и клетки инкубируют на льду 10%-ной трихлоруксусной кислотой (1 мл на лунку) в течение 30 минут. Планшеты промывают 3 раза 5%-ной трихлоруксусной кислотой для удаления всех следов тимидина, который не включился в клетки. В каждую лунку добавляют 500 мкл 0,1 М раствора гидроксида натрия, и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение по крайней мере 30 минут. 250 мкл каждого образца переносят в сцинтилляционные флаконы, добавляют 5 мл сцинтилляционной жидкости и в течение 5 минут просчитывают каждый флакон на содержание радиоактивности за счет фиксации трития. Данные, полученные в трех лунках при трехкратном повторении эксперимента, рассчитывают в виде включения % тимидина в ДНК по сравнению с таковыми в контрольных лунках, в которые не был внесен ни экстракт нута обыкновенного, ни эстрадиол. Значения выражают в виде средней величины, полученной в трех лунках при трехкратном повторении эксперимента, стандартное отклонение.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Как видно из результатов, представленных в таблице 1, 1 нмоль (0,274 нг/мл) или более высокие концентрации эстрадиола повышают синтез ДНК клеток ZR 75. Подобной активности в случае этого особого экстракта нута обыкновенного достигают при концентрации 0,1 мкг/мл или выше.

Органический экстракт нута обыкновенного пригоден для использования в композициях согласно изобретению в таком количестве, чтобы достигать эстрогенной активности, эквивалентной по крайней мере 1 нмоль эстрадиола. В случае тестируемого образца экстракта требуемая активность наблюдается при концентрации 0,1 мкг нута обыкновенного на 1 мл среды.

Пример 2

Дважды повторяют пример 1 с разными концентрациями экстракта нута обыкновенного, как указано в таблице 2.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Из результатов, представленных в таблице 1 (представлен эксперимент 1) и в таблице 2, можно видеть, что в трех разных экспериментах, выполненных в три разных дня при использовании трех различных пассажей клеток ZR 75, органический экстракт нута обыкновенного значительно стимулирует пролиферацию клеток ZR 75.

Пример 3

Этот пример иллюстрирует, что кератиноциты, обработанные органическим экстрактом нута обыкновенного, выделяют вещество, которое стимулирует пролиферацию фибробластов.

Клеточная культура кератиноцитов.

Человеческие кератиноциты, выделенные из неонатальной крайней плоти путем обработки трипсином, культивируют в среде, состоящей из модифицированной Дульбекко среды Игла и среды Хамса F12 в соотношении 3:1, с 5% фетальной телячьей сыворотки в присутствии обработанных митомицином С мышиных фибробластов 3Т3, для образования отдельных колоний кератиноцитов. Клетки культивируют в вышеуказанных условиях до второго пассажа и хранят замороженными для дальнейшего использования. Замороженные кератиноциты для второго пассажа оттаивают, высевают на вышеуказанную среду и культивируют в течение пяти дней. В день 5, когда клетки на 70-80% конфлюентны, их трипсинизируют и высевают в 24-луночные планшеты по 20000-30000 клеток на лунку в бессывороточную среду для культивирования кератиноцитов (KGM, фирма Clonetics, San Diego, CA), содержащую 0,15 ммоль кальция. Клетки культивируют до 80%-ной конфлюентности за 5 дней до эксперимента.

Клеточная культура фибробластов.

Фибробласты человеческой неонатальной крайней плоти, полученные от фирмы Clonetics Corporation (San Diego, CA), культивируют в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (оба продукта получают от фирмы Life Technologies, Grand Island, NY). Эксперименты осуществляют при использовании клеток в их 5-1.5-том пассаже. Клетки пассируют на 24-луночных планшетах по 7000-10000 клеток на лунку и культивируют до 80%-ной конфлюентности за 5 дней до эксперимента.

Приготовление кератиноцитной кондиционированной среды.

Для экспериментов, проводимых с целью исследования взаимодействия кератиноцитов и фибробластов в ответ на обработку экстрактами нута обыкновенного, кератиноцитную кондиционированную среду готовят следующим образом: конфлюентные на 80% кератиноциты, полученные как указано выше, обрабатывают различными концентрациями экстрактов нута обыкновенного (как указано в таблице 3) в течение 24-х часов в среде RPMI без сыворотки и фенолового красного. Собранную с планшетов среду называют как "кератиноцитная кондиционированная среда".

Методология теста.

Кератиноциты и фибробласты дозируют отдельно с различными концентрациями экстракта нута обыкновенного в 1 мл среды RPMI без сыворотки и фенолового красного. Фибробласты также дозируют с 1 мл кератиноцитной кондиционированной среды. Спустя 24 часа, добавляют ³Н-тимидин с 1 Сi на лунку и клетки инкубируют в течение 24-х часов. Количество ³Н-тимидина, включенного в клеточную ДНК, оценивают как описано в стадии 2 примера 1.

Полученные результаты представлены в таблице 3.

Результаты, представленные в таблице 3, показывают, что экстракты нута обыкновенного не оказывают прямого воздействия на пролиферацию или кератиноцита или фибробласта. Однако экстракт нута обыкновенного стимулирует кератиноциты к выделению стимулирующих рост веществ для фибробластов, так как кондиционированная среда с кератиноцитами, подвергнутая воздействию экстракта нута обыкновенного, значительно повышает пролиферацию фибробластов.

Пример 4

Этот пример иллюстрирует, что органические экстракты нута обыкновенного повышают пролиферацию клеток в эпидермальной части кожи поросенка. В этом примере, эстрадиол, чистые фитоэстрогенные соединения и экстракты нута обыкновенного тестируют в отношении их воздействий на пролиферацию эпидермальных клеток.

Органная культура кожи поросенка.

Кожа поросенка морфологически и биохимически подобна коже человека и поэтому обычно ее используют для тестирования воздействий веществ в отношении локального использования для человека. Свежеснятую кожу поросят получают с местной скотобойни, промывают мылом Dove* и дерматомируют до толщины 200 микрон для получения верхнего эпидермиса и дермального слоя. Однородные пункционные биопсии дерматомированной кожи поросенка осуществляют при использовании семимиллиметрового перфоратора. Полученные путем биопсии образцы промывают в среде, содержащей большое количество смеси антибиотика с противогрибковым средством (канамицин и пенициллин и стрептомицин; фирма Gibco) и инкубируют в течение трех дней в среде DMEM с высокой концентрацией глюкозы, содержащей гидрокортизон, L-глутамин, антибиотик и противогрибковое средство, без сыворотки, на планшетах с лунками, по 3 полученных путем биопсии образца на лунку. Среду поддерживают в нижней части лунки так, чтобы эпидермальная сторона образцов, полученных путем биопсии, находилась в контакте с воздухом. На третий день среду заменяют свежей средой и полученные путем биопсии образцы подвергают воздействию разных концентраций различных активных веществ в 1 мкл диметилсульфоксида, как показано в таблице 4. Спустя 3 дня, среду заменяют, снова добавляют активные вещества и полученные путем биопсии образцы метят с помощью 10 Сi ³Н-тимидина на лунку. После промывки полученных путем биопсии образцов в PBS, эпидермис отслаивают от дермы путем инкубации полученных путем биопсии образцов в течение 24-х часов в 2 М растворе бромида натрия при встряхивании. Эпидермис отделяют от дермы с помощью пинцета, растворяют в 1 мл 0,5 н. раствора гидроксида натрия и инкубируют в течение ночи при температуре 60^oС. 200 мкл растворенного эпидермиса используют для сцинтилляционного подсчета радиоактивности с целью определения количества ³Н-тимидина, включенного в эпидермис. Данные рассчитывают как среднее число импульсов в минуту по крайней мере для четырех репликатов, и также рассчитывают как % от контрольных образцов, полученных путем биопсии, к которым не добавлены активные вещества. Полученные результаты представлены в таблице 4.

Из представленных в таблице 4 результатов можно видеть, что в двух отдельных экспериментах эстрадиол в концентрации 10 нмоль увеличивает пролиферацию эпидермальных клеток поросенка (в эксперименте 2 увеличение является статистически значительным). Даидзеин также проявляет это воздействие, причем даидзеин является более эффективным, чем природный гормон эстрадиол. Другой изофлавон, формононетин, не оказывает значительных ростстимулирующих воздействий на эпидермис поросенка. Как метанольный, так и дихлорметановый экстракты нута обыкновенного также оказывают стимулирующее на рост воздействие, причем дихлорметановый экстракт является более эффективным, чем метанольный экстракт. Дихлорметановый экстракт нута обыкновенного даже более эффективен, чем чистые изофлавоиы или эстрадиол. Результаты показывают полезные воздействия органического экстракта нута обыкновенного на клетки кожи в модельной системе, которая имеет очень близкое сходство с кожей человека.

Примеры 5-10 иллюстрируют композиции для ухода за кожей согласно настоящему изобретению. Композиции могут быть получены обычным образом. Они пригодны для косметического использования. В особенности, композиции пригодны для применения в случае морщинистой, со складками, огрубевшей, сухой, шершавой, старой и/или УФ-поврежденной кожи с целью улучшения ее внешнего вида и чувствительности, а также для применения в случае здоровой кожи с целью предохранения или замедления ее ухудшения.

Пример 5

Этот пример иллюстрирует композицию согласно изобретению в форме эмульсии вода-в-масле с высоким содержанием дисперсной фазы, мас.%:

экстракт нута обыкновенного в дихлорметане - 0,5

1,3-диметил-2-имидазолидинон - 0,2

Brij 92* - 5

Bentone 38 - 0,5

MgSO₄7Н₂O - 0,3

бутилированный гидрокситолуол - 0,01

отдушка - достаточное количество

вода - до 100

где*: Brij 92 означает полиоксиэтиленированный 2 молями этиленоксида простой олеиловый эфир

Пример 6

Этот пример иллюстрирует композицию согласно изобретению в форме крема масло-в-воде, мас.%:

экстракт нута обыкновенного в метаноле - 2

минеральное масло - 4

1,3-диметил-2-имидазолидинон - 1

Brij 56 * - 4

Alfol 16RD * - 4

триэтаноламин - 0,75

бутан-1,3-диол - 3

ксантановая смола - 0,3

отдушка - достаточное количество

бутилированный гидрокситолуол - 0, 01

вода - до 100

где *: Brij 56 означает полиоксиэтиленированный 10 молями этиленоксида цетиловый спирт;

Alfol 16RD означает цетиловый спирт

Пример 7

Этот пример иллюстрирует композицию согласно изобретению в форме спиртового лосьона, мас.%:

экстракт нута обыкновенного в метаноле - 5

1,3-диметил-2-имидазолидинон - 0,1

этанол - 40

отдушка - достаточное количество

бутилированный гидрокситолуол - 0,01

вода - до 100

Пример 8

Этот пример иллюстрирует композицию согласно изобретению в форме другого спиртового лосьона, мас.%:

экстракт нута обыкновенного в дихлорметане - 10

1,3-диметил-2-имидазолидинон - 0,01

этанол - 40

антиоксидант - 0,1

отдушка - достаточное количество

вода - до 100

Пример 9

Этот пример иллюстрирует композицию согласно изобретению в форме солнцезащитного крема, мас.%:

экстракт нута обыкновенного в метаноле - 2

1,3-диметил-2-имидазолидинон - 0,2

силиконовое масло, 200 сантистокс - 7,5

глицерилмоностеарат - 3

цетостеариловый спирт - 1,6

полиоксиэтиленированный 20 молями этиленоксида цетиловый спирт - 1,4

ксантановая смола - 0,5

Parsol 1789 - 1,5

октилметоксициннат (PARSOL MCX) - 7

отдушка - достаточное количество

краситель - достаточное количество

вода - до 100

Пример 10

Этот пример иллюстрирует композицию согласно изобретению в форме неводной композиции для ухода за кожей, мас.%:

экстракт нута обыкновенного в дихлорметане - 5

1,3-диметил-2-имидазолидинон - 1

силиконовая смола SE-30¹ - 10

жидкий силикон 345² - 20

жидкий силикон 344³ - 50,26

сквален - 10

линолевая кислота - 0,01

холестерин - 0,03

2-гидрокси-н-октановая кислота - 0,7

линолеат витамина Е - 0,5

масло из травянистого сырья - 0,5

этанол - 2

где: диметилсиликоновый полимер с молекулярной массой по крайней мере 50000 и с вязкостью по крайней мере 10000 сантистокс при температуре 25^oC, выпускаемый фирмой GEC.

диметилсилоксановый циклический пентамер, выпускаемый фирмой Dow Corning Corp.

диметилсилоксановый тетрамер, выпускаемый фирмой Dow Corning Corp.

Следует иметь в виду, что проиллюстрированные и описанные здесь особые варианты изобретения представляют собой только характерные формы. Изменения, включающие, но не ограниченные, в отношении предложенных в настоящем описании вариантов, могут быть сделаны в проиллюстрированных воплощениях изобретения, не отклоняясь от четких пояснений описания. Соответственно, следует обратиться в нижеследующей прилагаемой формуле изобретения, чтобы иметь представление о полном объеме изобретения.