способ определения возраста человека по морфометрическим параметрам гистологических препаратов костной ткани

Формула изобретения

Способ определения возраста человека по морфометрическим параметрам гистологических препаратов костной ткани, отличающийся тем, что дополнительно проводят измерение протяженности зоны активного остеогенеза, соотношения площадей хрящевой и костной тканей в переходной зоне продольного среза III-го ребра, диаметра гаверсовых каналов эндотрабекулярных остеонов в срезе эпифиза большеберцовой кости и количества эндотрабекулярных остеонов в срезе диафиза большеберцовой кости, полученные данные вводят в регрессионные уравнения, в результате расчета которых получают возраст человека.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к судебной медицине, а именно к методам судебно-медицинской идентификации личности. Оно предназначено для определения возраста человека по морфометрическим параметрам гистологических препаратов костной ткани.

В судебно-медицинской практике определение возраста человека производится главным образом с целью установления личности. В случае невозможности определения возраста по макроскопическим признакам, что характерно для случаев поздних трупных изменений, повреждения, расчленения и скелетирования трупов, может быть использовано морфометрическое исследование гистологических препаратов костной ткани как наименее подверженной разрушению.

Как известно, в ходе жизни индивида структура его костной ткани непрерывно перестраивается под влиянием меняющейся механической нагрузки, изменений минерального обмена в организме и необходимости регенерации костной ткани в связи с изнашиванием ее структурных элементов. Следы повторных циклов перестройки сохраняются в микроструктуре костей, и степень ее изменений зависит от количества этих циклов, успевших произойти в изучаемой анатомической области за период жизни индивида. На этой зависимости основан метод количественного изучения гистологических признаков возрастной перестройки и определения возраста по степени выраженности этих признаков.

Метод определения возраста на основании подсчета количества различных микроскопических элементов костной ткани был впервые предложен Kerley E.P. в 1965 г. В дальнейшем многие исследователи работали над усовершенствованием этого метода с целью повышения его точности. В частности в нашей стране в 1965 г. Ю.М. Гладышев создал оригинальную классификацию остеонов и остеонных систем [3] , которая была использована В.Ф. Мордасовым [5] для разработки критериев определения возраста по количеству остеонных структур различных типов, подсчитываемому в препаратах костной ткани. Однако, как показали недавние исследования, этот метод имеет существенный недостаток, состоящий в трудности дифференцировки различных форм остеонов и других исследуемых элементов, следствием которой является неточность их подсчета и соответственно недостоверность результатов [10]. Поэтому возникла необходимость использования таких микроскопических структур костной ткани, которые однозначно и достоверно может определить практический гистолог. Кроме того, имеется нереализованная ранее возможность повысить точность диагностики возраста человека благодаря измерению длин и площадей этих структур.

Для решения аналогичной проблемы Найнис Й.-В. [6] предложил метод установления возраста человека с точностью до 5 лет, основанный на гистологическом и микрорентгенографическом исследовании образцов ткани из бедренной и плечевой кости. Предложенные им критерии определения возраста были достаточно просты и достоверны, однако способ имел существенный недостаток, состоящий в отказе от количественного анализа препаратов и использовании только качественного их описания, что приводило к недостаточной объективности результатов [1, 2] . Тем не менее метод Й.-В. Найниса, а также упоминавшийся выше метод В.Ф. Мордасова можно считать аналогами предлагаемого нами изобретения.

Ближайшим прототипом заявляемого изобретения послужила работа Lozupone Е. et Favia A. [9], в которой впервые в судебно-медицинской практике была сделана попытка использовать для определения возраста принципиально новый набор параметров, в частности характеризующих трабекулярную костную ткань. Однако количество параметров, исследованных авторами цитируемой работы, было недостаточным для разработки на их основе модели определения возраста, пригодной для практического применения.

Кроме того, общепринят тот факт, что наиболее сложным для определения возраста является период с 18 до 50 лет, когда рост кости уже практически закончен, а выраженные проявления возрастной инволюции еще не начались. Все методики упомянутых выше авторов позволяют определять возраст в этом периоде с минимальной точностью, так как пока не найдены оптимальные морфометрические параметры, при измерении которых можно было бы эту точность значительно повысить.

В связи с этим перед нами была поставлена задача найти оптимальные морфометрические параметры, необходимые для точного определения возраста именно в этом диапазоне (18-50 лет), и разработать комплексный эффективный способ определения возраста человека по морфометрическим параметрам гистологических препаратов костной ткани.

В соответствии с литературными данными, согласно которым использование двух и более костей дает более точные результаты, чем исследование одной кости [11] , было выбрано два объекта исследования. Основанием для выбора большеберцовой кости послужил опыт идентификационных работ при массовой гибели людей в зоне локального военного конфликта, в ходе которых выяснилось, что в этих условиях большеберцовая кость сохраняется лучше, чем другие. В качестве второго объекта исследований было использовано ребро, поскольку все процессы в костной ткани, включая возрастную перестройку, наиболее выражены именно на границе костной и хрящевой ткани ребра [7].

Первоначальный набор измерявшихся параметров включал в себя 39 признаков и был разработан на основании литературных данных и результатов собственных исследований возрастных изменений костной ткани. Была создана база данных, содержащая количественные описания гистологических препаратов, изготовленных из образцов костной ткани лиц известного возраста.

В результате статистического анализа были выбраны количественные признаки, имеющие наиболее выраженную зависимость от возраста: толщина кортикального слоя, соотношение площадей миелоидной и жировой ткани в костном мозге, плотность остеоцитов, соотношение площадей хрящевой и костной ткани в переходной зоне, протяженность зоны активного остеогенеза, диаметр гаверсовых каналов и количество эндотрабекулярных остеонов, площадь трабекул в поле зрения, толщина трабекул, диаметр гаверсовых каналов и остеонов, толщина слоев наружной и внутренней генеральных пластинок, общая плотность остеонов, плотности остеонов с перестроенным центральным отделом и остеонов, темно окрашенных ализариновым красным С, и др.).

Также были выбраны качественные признаки, позволяющие до проведения количественных измерений отнести идентифицируемого индивида к определенной возрастной группе. Это такие признаки, как наличие и выраженность слоев хрящевой ткани в переходной зоне ребра, наличие или отсутствие линии роста, наличие или отсутствие синостозирования, толщину костных трабекул, наличие и количество эндотрабекулярных остеонов, толщину субхондральной пластинки в эпифизе большеберцовой кости, соотношение миелоидной и жировой ткани в костно-мозговых полостях ребра.

При анализе первичного набора параметров было выявлено, что в интервале от 18 до 30 лет наибольшие коэффициенты корреляции с возрастом были у таких признаков, как соотношение площадей хрящевой и костной ткани и протяженность зоны активного остеогенеза в переходной зоне продольного среза ребра. Измерение диаметра гаверсовых каналов эндотрабекулярных остеонов эпифиза большеберцовой кости и подсчет эндотрабекулярных остеонов диафиза большеберцовой кости оказались наиболее результативными для периода от 27 до 50 лет.

На основе выбранного набора количественных параметров (см. перечень выше) был разработан комплекс многомерных регрессионных моделей определения возраста человека и, таким образом, получен комплексный способ определения возраста человека по морфометрическим параметрам гистологических препаратов костной ткани.

Для подтверждения эффективности предлагаемого способа было проведено его тестирование на 50 экспертных случаях с достоверно известным возрастом. Точность определения возраста была следующей:

до 1,5 лет - 80% случаев;

от 1,5 до 2 лет - 14% случаев;

от 2 до 3 лет - 6% случаев (гнилостные изменения костной ткани).

По сравнению с существующими аналогами и прототипом предлагаемый способ определения возраста человека обладает следующими преимуществами:

1. Позволяет определять возраст человека (в частности, в интервале от 18 до 30 лет) с точностью до 1,5-2 лет.

2. Позволяет использовать для исследования только те структуры костной ткани, которые поддаются достоверной дифференцировке, что уменьшает вероятность ошибок.

3. Позволяет использовать образцы костной ткани из иных анатомических областей, чем в предшествующих способах (фрагмент третьего ребра из зоны перехода костной ткани в хрящевую слева, а также диафиз и нижний эпифиз большеберцовой кости слева), что особенно важно при отсутствии полного набора костей в случае повреждения или расчленения трупа.

4. Позволяет использовать для измерений и последующих расчетов компьютерную систему анализа изображений, что обеспечивает высокую точность результатов, экономию рабочего времени и широкие возможности документирования и контроля работы экспертов.

Необходимо отметить, что использование оригинальных параметров - соотношения площадей хрящевой и костной ткани и протяженности зоны активного остеогенеза в переходной зоне продольного среза ребра, диаметра гаверсовых каналов эндотрабекулярных остеонов в эпифизе большеберцовой кости, количества эндотрабекулярных остеонов в диафизе большеберцовой кости, характеризующих возрастные изменения костной ткани в интервале от 18 до 50 лет, а также применение вместе с ними комплекса других параметров и предварительная разбивка на возрастные периоды с помощью качественных параметров в литературе не описано и не является очевидным, а предлагаемое нами решение проблемы получено в результате проведения большой серии собственных исследований в соответствии с поставленной целью. Таким образом, предлагаемое изобретение соответствует критериям оригинальности, новизны и изобретательского уровня.

Пример практического применения способа

Для определения возраста человека путем количественного гистологического исследования образцов костной ткани берут фрагменты третьего ребра слева из зоны перехода костной ткани в хрящевую (длиной примерно пять сантиметров), а также дистального эпифиза (включая суставной хрящ) и диафиза (на границе нижней и средней трети) большеберцовой кости слева. Материал фиксируют в 10% нейтральном растворе формалина, после чего из него выпиливают блоки толщиной около 5 мм. При изготовлении продольных срезов эпифиза большеберцовой кости и ребра выпиливают кусочки площадью примерно 1 см², включающие зону перехода костной ткани в хрящевую, а при изготовлении поперечных срезов диафиза большеберцовой кости и ребра - содержащие поперечное сечение полностью.

Далее проводят декальцинацию блоков из нижнего эпифиза и диафиза большеберцовой кости, а также продольных и поперечных срезов ребра в 12% растворе азотной кислоты и стандартную спиртовую проводку. Образцы ребер заливают в парафин, большеберцовой кости - в целлоидин. С помощью санного микротома изготавливают срезы костной ткани толщиной 5-7 мкм для ребер и 10 мкм для большеберцовой кости. Окраску производят гематоксилином и эозином согласно стандартным методикам [4].

Кроме того, из зоны на границе средней и нижней трети диафиза выпиливают поперечный срез толщиной 450-600 мм, из которого далее изготавливают недекальцинированный препарат костной ткани. Для этого после стандартной спиртовой проводки блоки пропитывают смолой или пластмассой, предназначенной для заливки недекальцинированных образцов костной ткани, по стандартной схеме. Из залитых в твердую среду блоков с помощью распиливающего микротома изготовляют срезы толщиной 100 микрометров, освобождают их от заливочной среды, используя специальный растворитель, и окрашивают 0,1% раствором ализаринового красного С в дистиллированной воде, после чего заключают в иммерсионное масло на предметном стекле и покрывают покровным стеклом.

Исследование гистологических препаратов проводят с помощью компьютерной системы анализа изображений, включающей световой микроскоп, допускающий подключение видеокамеры, видеокамеру, компьютер, предназначенный для работы с детализированной графикой, специальную плату, соединяющую компьютер с видеокамерой, принтер, графический редактор, позволяющий осуществлять количественное описание изображений.

Вначале определяют качественные признаки: в переходной зоне ребра - наличие и выраженность слоев хрящевой ткани, в эпифизе большеберцовой кости - наличие или отсутствие линии роста, наличие или отсутствие синостозирования, толщину костных трабекул, наличие и количество эндотрабекулярных остеонов, толщину субхондральной пластинки, соотношение миелоидной и жировой ткани в костно-мозговых полостях ребра. На основании перечисленных качественных признаков индивида относят к определенной возрастной группе (до 18 лет, 18-30 лет, 18-32 года, 27-50 лет, свыше 50 лет).

Количественные измерения проводят с использованием графического редактора (например, Adobe PhotoShop [8] ) по программе первичных признаков, разработанной в соответствии с общепринятыми правилами морфометрических исследований [1, 2] . Измеряют следующие признаки в поле зрения (или отдельные из этих признаков по мере сохранности костных структур).

На поперечном срезе III-го ребра:

1 - длина кортикального слоя;

2 - площадь кортикального слоя;

3 - количество остеоцитов;

4 - площадь миелоидной ткани;

5 - площадь жировой ткани.

На продольном срезе III-го ребра:

6 - площадь хрящевой ткани в переходной зоне;

7 - площадь костной ткани в переходной зоне;

8 - протяженность зоны остеогенеза;

9 - протяженность внутренней поверхности хряща.

На поперечном срезе эпифиза большеберцовой кости:

10 - площадь трабекулярной кости;

11 - длина трабекулярной поверхности;

12 - диаметр гаверсовых каналов эндотрабекулярных остеонов.

На поперечном срезе недекальцинированного диафиза большеберцовой кости:

13 - минимальный диаметр гаверсова канала;

14 - минимальный диаметр остеона;

15 - количество остеонов;

16 - количество остеонов с перестроенным центральным отделом;

17 - количество остеонов, ярко окрашенных ализарином.

На поперечном срезе декальцинированного диафиза большеберцовой кости:

18 - площадь слоя наружных генеральных пластинок;

19 - площадь слоя внутренних генеральных пластинок;

20 -длина кортикального слоя;

21 - количество эндотрабекулярных остеонов.

Начальное поле зрения соответствует левому верхнему участку препарата, далее предметное стекло смещают слева направо и сверху вниз. При этом при перемещении предметного стекла избегают перекрытия с предыдущими полями зрения. Количество исследованных полей зрения для каждого конкретного признака для различных индивидов получается различным, что определяется размерами препарата, морфологическими особенностями строения костной ткани индивида, степенью сохранности измеряемых структур и др.

Так, например, для расчета соотношения площадей хрящевой и костной тканей сначала на препарате продольного среза ребра находят переходную зону. Площади хрящевой и костной тканей измеряют в трабекулах, расположенных вблизи внутренней поверхности хряща, в каждом выбранном поле зрения последовательно. Результаты заносят в базу данных, где рассчитывают среднюю величину каждой площади и затем их соотношение.

Полученный результирующий признак вводят в регрессионное уравнение, рассчитанное для возрастной группы от 18 до 30 лет:

AGE=31,84-0,112Q₃₄-84,67Q₅-0,078Q₇2,048,

где AGE - биологический возраст в годах;

Q₅ - соотношение площадей хрящевой и костной тканей в переходной зоне продольного среза ребра;

Q₃₄ - средняя толщина слоя внутренних генеральных пластинок диафиза большеберцовой кости;

Q₇ - средняя толщина кортикального слоя ребра.

Измерения других параметров проводятся аналогично и для каждого возрастного периода рассчитано свое регрессионное уравнение. Результаты измерений используются для выбора модели определения возраста, соответствующей данному экспертному случаю, а также для вычисления возраста по выбранному регрессионному уравнению.

Экономический эффект предлагаемого метода

Внедрение в практику предлагаемого способа определения возраста человека по морфометрическим параметрам гистологических препаратов костной ткани имеет непосредственный экономический эффект, поскольку приводит к экономии рабочего времени экспертов и обеспечивает получение объективных результатов, снижая потребности в проведении повторных экспертиз.

Источники информации

1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия: Руководство. - М.: Медицина. - 1990 г. - 384 с.

2. Автандилов Г. Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии. - М.: РМАПО. - 1996. - 256 с.

3. Гладышев Ю. М. Микроскопические конструкции костной ткани и их судебно-медицинское значение: Дисс. д-ра мед. наук. - Воронеж. - 1965 г. - 318 с.

4. Микроскопическая техника: Руководство.// Под ред. Д.С. Саркисова и Ю. Л. Перова. - М.: Медицина. - 1996. - С. 7-50.

5. Мордасов В.Ф. Судебно-медицинское установление возраста человека по микроструктуре бедренной кости: Микроскопическое и микрорентгенографическое исследование: Дисс. канд. мед. наук. - Воронеж. - 1988 г. - 286 с.

6. Найнис Й. -В. Идентификация личности по проксимальным костям конечностей. - Вильнюс: Минтис. - 1972 г.

7. Осипенкова-Вичтомова Т.К. Судебно-гистологическая экспертиза костей. - М.: ВИКРА. - 2000. - 144 с.

8. Adobe PhotoShope 4.0. Руководство пользователя. Adobe Systems Inc. 381 P.

9. Lozupone E., Favia A. The structure of spongious trabeculae in relation to age in man.//Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. - 1995. - Vol. 71. - 7-8. - РР. 175-180.

10. Lynnerup N., Thomsen J.L., Frohlich B. Intra- and inter-observer variation in histological criteria used in age at death determination based on femoral cortical bone.// Forensic Science International. - 1998. - Vol. 91. - 3. - PP. 219-230.

11. Stout S.D., Dietze W.H., Iscan M.Y., Loth S.R. Estimation of age at death using cortical histomorphometry of the sternal end of the fourth rib. // J. Forensic Science. - 1994. - Vol. 39. - 3. - РР. 778-784.