способ подбора особей русского осетра acipencer в аквакультуре

Формула изобретения

Способ подбора особей русского осетра Acipencer в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-13t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> в аквакультуре, включающий секвенс-анализ митохондриальной ДНК в области D-петли методом ПЦР-амплификации, отличающийся тем, что в процессе анализа используются прямой (ОS1) и обратный (ОS2) праймеры, имеющие указанную ниже в таблице структуру, а для воспроизводства подбирают особей, различных по длине ПЦР-продуктов мтДНК (см. графическую часть).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к рыбному хозяйству и предназначено для заводского отбора производителей русского осетра Acipencer в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-5t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">

В условиях интенсивного воспроизводства осетровых на рыбоводных заводах возникает проблема подбора производителей, минимизированных по показателям инбридинга (близкородственного скрещивания), особенно в условиях стремительного сокращения их численности.

Поскольку инбридинг не отвечает задаче получения потомства с максимально высоким показателем устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды, клонирование одних и тех же производителей с последующей интродукцией их потомства в природные водоемы наносит большой ущерб природному генофонду (в данном случае - рыб).

Известны способы отбора потенциально рыбоводнопродуктивных производителей по биометрическим (длина тела, масса тела), физиологическим (качество половых продуктов (икры и спермы), созревание производителей после инъекции и пр. ), а также биохимическим показателям (способ индивидуального отбора самок посредством прижизненного определения в крови содержания белка, липидов и холестерина) [1].

Недостатком данных способов является то, что они только выявляют подготовленность мигрантов к размножению, но не могут предотвратить снижения гетерогенности популяции осетровых.

Известен способ подбора производителей карпа из двух искусственно сформированных генетически отдаленных линий (гомозиготных по альбумино-трансферриновому комплексу плазмы крови из чешуйчатой линии (SSnn) и гетерогенному подбору по этому комплексу - разбросанной (SSnn) линии) [2].

Недостатком этого способа является то, что увеличение выживаемости молоди на 20-25%, полученной от межлинейных скрещиваний уже на уровне первого селекционного поколения, носит характер гетерозисного. Как известно, характерной чертой гетерозиса является затухание в ряду поколений [3]. Кроме того, формирование генетически отдаленных линий путем ассортативного отбора - весьма длительный и трудоемкий процесс.

Наиболее близким по технической сущности (прототип) является способ исследования изменчивости митохондриального генома у осетра Acipencer oxyrynchus desotoi [4]. С использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) показано, что 18,5% особей имеют в своих клетках несколько разных по длине вариантов митохондриальной ДНК (мтДНК), т.е. являются гетероплазмичными. Эти варианты обусловлены наличием от 1 до 4 копий последовательности длиной 81 п.н., находящихся в составе D-петли мтДНК. Параметры изменчивости мтДНК у A. oxyrynchus desotoi во многом сходны с таковыми, ранее определенными у белого осетра A. transmontanus [5] и A. в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-6t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">

Недостатком прототипа является невозможность экстраполяции на все виды осетровых ввиду уникальности раметров изменчивости мтДНК у каждого из них (применить использованные праймеры для других видов осетровых).

Цель изобретения - обеспечить решение задачи получения максимально жизнеспособного потомства от генетически удаленных друг от друга родительских линий русского осетра Acipenser в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-7t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> и свести к минимуму генетическую деградацию природных популяций.

Эта цель достигается тем, что подбор производителей Acipenser в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-8t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> осуществляют путем секвенс-анализа мтДНК в области D-петли методом ПЦР-амплификации с использованием прямого (OS1) и обратного (OS2) праймеров, имеющих указанную ниже структуру, а для воспроизводства подбирают особей, различных по длине ПНР-продуктов мтДНК (см. таблицу).

Сущность изобретения состоит в следующем.

Из образцов тканей выделяют ДНК, регион D-петли мтДНК исследуют методом ПЦР-амплификации с использованием прямого (OS1) и обратного (OS2) праймеров, имеющих указанную выше в таблице структуру. В качестве маркеров молекулярной массы ДНК при электрофорезе ПЦР-продуктов различных проб используют "100 Base Pair Ladder" (American Pharmacia). Методом прямого секвенс-анализа полной нуклеотидной последовательности по Сэнгеру выявляют различия в длине подуктов ПЦР-реакции (кратные 82 парам оснований). Подбор производителей русского осетра производят из разных групп, различающихся по кратности повторов 82 пар оснований в области D-петли мтДНК.

Отличительные признаки изобретения состоят в том, что впервые предложен способ подбора производителей осетровых с использованием методов молекулярной генетики, в частности тест-системы митохондриальной ДНК. В эукариотических клетках митохондриальная ДНК является полуавтономным образованием, очень удобным для молекулярно-генетической идентификации. Для этого существует, как минимум, две причины: относительно простая организация митохондриального генома и лучшая сохраняемость митохондриальной ДНК при длительном хранении образцов по сравнению с ядерной ДНК [6].

Эффективность данного способа состоит в следующем.

1. Отбор материала без травмирования производителей.

2. Скорость анализа (9 ч).

3. Возможность использования образцов из генетических коллекций.

4. Возможность консервации образцов для последующего анализа.

Пример осуществления способа.

В тест-системе представлены данные по анализу митохондриальной ДНК от 48 особей Acipenсer в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-9t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> выловленных в Азовском море в 1997-1999 годах ихтиологами АзНИИРХ. Образцы тканей были получены из банка тканей осетровых (АзНИИРХ). ДНК выделяли по стандартной методике [7]. Регион D-петли митохондриальной ДНК был исследован методами анализа продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) для прямого (OS1) и обратного (OS2) праймеров. Структура праймеров была подобрана авторами данного изобретения для региона D-петли митохондриальной ДНК осетровых на основании данных GenBank: AJ249662, AJ249663, представленных A. Ludwig and 1. Jenneckens. Для проведения реакции ПЦР-амплификации использовали наборы реактивов: DNA Sequencing Kit, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Biosystems) и амплификатор GeneAmp PCR System 2400 (РЕ Biosystems) [8]. Предварительные тесты с тотальной ДНК человека из наборов control human DNA 1 (PE Biosystems), control human DNA 3 (PE Biosystems); control human DNA K562 (Promega), продемонстрировали высокую степень специфичности праймеров OS1 и OS2, использованных в данной работе, к митохондриальной ДНК русского осетра.

Проведен анализ продуктов ПЦР-реакции препаратов тотальной ДНК русского осетра азовской популяции с праймерами OS1 (21 пара оснований) и OS2 (23 пары оснований) методом гель-электрофореза [9] (чертеж).

Наши данные наглядно продемонстрировали случаи гетероплазмии длины митохондриальной ДНК Acipencer в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-10t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> в пробах печени, селезенки и икры, взятых от разных особей. По длине амплифицированного участка ПЦР-продукты распределились следующим образом: 4 пробы из 28 имели длину амплифицированного участка, равную 242 парам оснований, 4 пробы из 28 имели длину амплифицированного участка, равную 324 парам оснований, и 20 проб из 28 имели длину амплифицированного участка, равную 406 парам оснований. Таким образом, анализ полной нуклеотидной последовательности методом прямого секвенс-анализа по Сэнгеру [10] позволил уточнить различия в длине продуктов ПЦР-реакции, кратные 82 парам оснований.

Различия между исследованными особями реализовывался по типу "инсерции": 4 особи из 28 исследованных не имели в своем составе ни одного повтора 82 пары нуклеотидов, 4 особи имели в своем составе 1 повтор 82 пары нуклеотидов и 20 особей из 28 исследованных имели в составе исследованного нами участка D-петли митохондриальной ДНК 2 повтора по 82 пары нуклеотидов.

Наглядно продемонстрирована гетерогенность популяции русского осетра Acipencer в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-11t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> Азовского моря, в пределах доступной нам выборки (48 особей), реализованная через существование, как минимум, четырех групп, различающихся по кратности повторов 82 пар оснований, в области D-петли митохондриальной ДНК [5]:

1. Первая группа - 0 повторов - 242 пар оснований.

2. Вторая группа - 1 повтор - 324 пары оснований.

3. Третья группа - 2 повтора - 406 пар оснований.

4. Четвертая группа - 3 повтора - 488 пар оснований.

Подбор производителей должен осуществляться из разных групп, например 1 гр.+2 гр., 1+3, 1+4, 2+3, 2+4, 3+4.

Полученные данные демонстрируют высокопроизводительный и специфичный экспериментальный подход для анализа структуры популяций осетровых как в природных условиях, так и в условиях рыбоводных хозяйств.

Практическое значение изобретения состоит в понижении инбридинга и получении жизнеспособного потомства осетра Acipencer в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-12t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> при искусственном воспроизводстве.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Сборник инструкций и нормативно-методических указаний по промышленному разведению осетровых рыб в Каспийском и Азовском бассейнах. - М.: Всесоюзный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии, 1986, с.36-47.

2. Биологические основы формирования маточных стад карпа в тепловодном рыбоводстве: Автореф. дис. канд. биол. наук / Законнова Л.И. - Тюмень: Тюмен. гос. ун-т, 1999. - 19 с.: ил. -Рус.

3. Инге-Вечтомов С. Г. Генетика с основами селекции. М.: Высшая школа, 1989, с.557-560.

4. Tandem repeat sequence variation and length heteroplasmy in the mitochondrial DNA D-loop of the threatened Gulf of Mexico sturgeon, Acipenser oxyrhynchus desotoi / Miracle A.L., Campton D.E. // J. Hered. - 1995. - 86, N1. - 22-27.

5. Buroker N.E., Brown J.R., Gilbert T.A., O"Hara P.J. end all. Length Heteroplasmy of sturgeon Mitochondrial DNA: An Illegitimate Elongation Model. Genetics 124:157-163 (January, 1990).

6. Holland M.M., Fisher D.L., Roby R.K., Ruderman J., Bryson C., and Weedn W. (1995). Mitochondrial DNA sequence analysis of human remains. Crime Lab. Dig. 22, 109-115.

7. Schneider P.M. Recovery of High-Molecular-Weight DNA from Blood and Forensic Specimens. From: Methods in Molecular Biology, Vol. 98: Forensic DNA Profiling Protocols Edited by: P.J. Lincoln and J. Thomson в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/169.gif" ALIGN="BASELINE">Humana Press Inc., Totowa, NJ, P.P.1-7.

8. Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК. Москва, "Наука", 1999, с.169-175.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Москва, "Мир", 1984.

10. Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci: USA, 74: 5463-5467.