способ генотипической оценки происхождения регенерантов культуры пыльников проса (panicum miliaceum l.)

Формула изобретения

Способ генотипической оценки происхождения регенерантов культуры пыльников проса (Panicum miliaceum L.), основанный на анализе регенерантных растений, отличающийся тем, что для проведения анализа используют пыльники растений-доноров с маркерными генами в гетерозиготном состоянии, по наличию маркерных признаков и расщеплению семей R₁, выращенных в полевых условиях, делают вывод о происхождении регенерантов из пыльцевых зерен, если в семьях R₁ отсутствует расщепление по маркерным признакам, и о происхождении из соматических клеток пыльника, если семьи расщепляются, различные сочетания маркерных признаков у регенерантных растений нерасщепляющихся семей при наличии у растения-донора пыльников более двух маркерных генов свидетельствуют о происхождении регенерантов из различных типов пыльцевых зерен.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию in vitro пыльников злаковых культур, преимущественно проса, и может быть использовано в генетике, селекции, физиологии применительно к представителям однодольных и двудольных видов культурных растений.

Метод культуры пыльников направлен на получение генотипически чистых линий культурных растений, происходящих из пыльцевых зерен. Вследствие того, что пыльник состоит из двух способных к делению типов клеток: соматических и пыльцевых зерен, оценка происхождения регенерантных растений имеет решающее значение. Для оценки происхождения регенерантных растений используют классический метод, основанный на подсчете числа хромосом [1] . Гаплоидный (одинарный) набор хромосом свидетельствует о происхождении регенерантов из пыльцевых зерен, диплоидный - из соматических клеток пыльника.

Этот метод не всегда дает адекватную оценку, потому что он не учитывает процессов, происходящих в период от первичных делений клеток пыльника до регенерации растений. Каллусные ткани, полученные в культуре пыльников, могут содержать клетки одного уровня плоидности, но происходящие из пыльцевых зерен или меристематически активных соматических клеток пыльника.

Клетки каллусной ткани с различными уровнями плоидности могут образовываться в результате слияния клеток пыльцевого зерна [2] или нетипичных митозов (эндомитозов), происходящих в процессе культивирования каллусной ткани [3, 4].

Цель изобретения состоит в определении с использованием генетических маркеров происхождения регенерантных растений из пыльцевых зерен или соматических клеток пыльника.

Предложенный способ оценки происхождения регенерантов, основанный на генотипических различиях пыльцевых зерен и соматических клеток пыльников гибридов с маркерными генами в гетерозиготном состоянии, позволяет дифференцировать регенеранты не только по соматическим половым клеткам-предшественникам, но и типам пыльцевых зерен. Способ применим как к регенерантам с гаплоидным набором хромосом (оценка R₀), так и с более высокими уровнями плоидности - оценка R₀, R₁ (таблица).

Оценка регенерантных растений R₀ позволяет сделать вывод о происхождении растений из пыльцевых зерен, если фенотип регенерантов отличается от фенотипа растения-донора пыльников. Учитывая одинаковое фенотипическое проявление доминантных маркерных генов в гетерозиготном и гомозиготном состоянии в R₀, требуется анализ по маркерным признакам семей R₁.

Оценка семей регенерантов R₁ позволяет по наличию или отсутствию расщепления делать выводы об их происхождении. Расщепляющиеся семьи указывают на происхождение из соматических клеток пыльника. Нерасщепляющиеся семьи с различными наборами маркерных признаков свидетельствуют о происхождении регенерантных растений из пыльцевых зерен. Использование нескольких (более 2-х) маркерных генов позволяет определять происхождение регенерантных растений из различных типов пыльцевых зерен. При этом, чем больше маркерных генов используется в эксперименте, тем более полно выявляется генотипическое разнообразие регенерантов.

Число возможных типов гамет и, следовательно, генотипов регенерантных растений вычисляется по формуле n=2^х, где х - число маркерных генов [5].

В качестве растений-доноров пыльников можно использовать не только гибриды F₁, но и последующие гибридные поколения. При этом во всех опытах по оценке происхождения вместе с семьями регенерантов R₁ рекомендуется выращивать семенное потомство растений-доноров для определения гетерозиготности маркерных генов. Во всех опытах необходимо иметь описание фенотипа растения-донора пыльников по маркерным признакам. Это важно, когда используется донор с несколькими маркерными генами (признаками). В случае, когда нерасщепляющиеся семьи имеют набор признаков, отличный по фенотипу от растения-донора, то отмечается их происхождение из пыльцевых зерен. Задача оценки происхождения при отсутствии семенного потомства растения-донора значительно облегчается, если среди регенерантов R₁ есть расщепляющиеся семьи. По характеру их расщепления легко можно восстановить генотип растения-донора.

Таким образом, способ генотипической оценки регенерантов позволил выделить и направить в селекционный процесс генотипически однородные линии проса.

Пример. Изучали регенеранты 5 каллусных клонов: gml, am26, am129, 2084/34, 2085/26, полученные в культуре пыльников гибридов F₃ от скрещивания форм проса с маркерными признаками. Каждый клон происходил из единственного пыльника. Растения-доноры пыльников клонов gml, am26 были гетерозиготными по 4 маркерным генам (окраска зерна, антоциан, сорго-образная и могарообразная формы метелки), am129 и 2085/26 - по 2 генам (окраска зерна и соргообразная форма метелки), 2084/34 - по 1 маркерному гену (окраска зерна).

Гетерозиготность определялась в результате анализа семей, ведущих происхождение из соматических клеток пыльника. Изучены 37 семей R₁ клона gml, 18 - am26, 13 - am129, 20 - 2084/34 и 4 - 2085/26.

Каллусные клоны были получены на культуральных средах, которые содержали макро- и микросоли по Мурашиге и Скугу (1962) - среда MS, витамины по Гамборгу и Эвелегу (1968) - среда В5, 2 мг/л глицина, 40 г/л сахарозы, 6 г/л агара, 500 мг/л мио-инозитола, 200-500 мг/л L-глутамина, 2 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота). Стимулирование регенерационного процесса происходило на среде с солями MS, витаминами В5, дополненной 2 мг/л глицина, 40 г/л сахарозы, 6 г/л агара, 10 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) и 0,5 мг/л -НУК (-нафтилуксусная кислота).

Получение регенерантных растений в культуре пыльников проса не являлось результатом прямого эмбриогенеза, а включало ряд этапов. Период стимулирования регенерационного процесса эмбриогенных каллусных тканей составлял 50 суток. Продолжительность периода инициации регенерационного процесса, в среднем, составляла 25 суток. В целом, время от посадки экспланта до регенерации корнесобственных растений составляло 75 суток. Регенерантные растения получали в течение 1-2 лет в процессе культивирования регенерирующей каллусной ткани на среде без регуляторов роста.

На регенерантных растениях R₀ были получены всхожие семена. Регенеранты R₁ выращивали в полевых условиях, где проводилась их оценка по наличию маркерных признаков и расщеплению.

Все семьи регенерантов R₁ клонов gml и 2085/26 расщеплялись по 4 маркерным признакам, что указывало на их происхождение из соматических клеток пыльников. Среди регенерантов R₁ клонов аm26, am129 и 2084/34 встречались как нерасщепляющиеся, так и расщепляющиеся семьи, что указывало на их происхождение как из пыльцевых зерен, так и из соматических клеток пыльников. В нерасщепляющихся семьях клонов аm26 и am129 наблюдались различные наборы маркерных признаков, что указывало на участие в процессе пролиферации различных типов пыльцевых зерен. Растения нерасщепляющихся семей клона аm26 были представлены 3 наборами признаков:

а) белая окраска зерна, наличие антоциана, развесистая метелка (38,9%);

б) белая окраска зерна, отсутствие антоциана, развесистая метелка (2,8%);

в) красная окраска зерна, наличие антоциана, димутантная метелка (2,8%).

Растения нерасщепляющихся семей клона am129 имели 2 набора признаков:

а) белая окраска зерна, развесистая метелка (15,4%);

б) красная окраска зерна, развесистая метелка (23,1%).

Растения нерасщепляющихся семей клона 2084/34 были представлены 1 фенотипом с белой окраской зерна (15%).

В эксперименте с культурой пыльников проса растение-донор пыльников у клона 2084/34 было гетерозиготным по 1 маркерному гену, что не позволило проводить дифференциацию типу пыльцевых зерен.

Растение-донор пыльников клона am129 было гетерозиготным по 3 маркерным генам, что согласно формуле n=2^x позволяло выявить 8 типов пыльцевых зерен. Экспериментально получили, что регенеранты представляли только 2 типа. Растение-донор клона аm26 было гетерозиготным по 4 маркерным генам, что позволяло выявить 16 типов пыльцевых зерен. Фактически определено участие в формировании каллусной ткани 3 типов пыльцевых зерен.

Впервые проведено сравнительное испытание гомозиготных линий проса, полученных методом культуры пыльников, в полевых условиях. Это позволяет значительно ускорить селекционный процесс и целенаправленно получать генотипы с заданными признаками.

Источники информации

1. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1980, - 304 с.

2. Raghavan V. Pollen developmental biology in cultured anthers|| Cell culture and somatic cell genetics of plants. - 1986. - V 3. - P. 275-301.

3. Matthews P.S., Vasil I.K. The dynamics of cell proliferation in haploid and diploid tissues of Nicotiana tabacum|| Z. Pflanzenphysiologie. - 1976. - V. 77. - P. 222-236.

4. Vasil I.K., Nitsch C. Experimental production of pollen haploids and their uses|| Z. Pflanzenphysiologie. - 1975. - Bd. 76. - S. 191-212.

5. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. - М.: Высшая школа, 1987, - 591 с.