способ получения сурфактанта из легких крупного рогатого скота

Формула изобретения

Способ получения сурфактанта из легких крупного рогатого скота, характеризующийся тем, что сырье в физиологическом растворе измельчают разрезанием на кусочки со сторонами не более 5 мм с одновременным проточным экстрагированием, фильтруют, фильтрат центрифугируют на проточной центрифуге при 100-150 g и скорости протока 5-6 л/мин, надосадочную жидкость подвергают повторному проточному центрифугированию при 15000-20000 g со скоростью протока 1-1,5 л/мин, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде, образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10000-15000 g в течение 45-60 мин, к осадку добавляют дистиллированную воду, экстрагируют смесью хлороформа и метанола в соотношении 1:1-3:1 в атмосфере аргона, экстракт промывают 0,1%-ным раствором хлорида калия или кальция, суспензию оставляют до разделения фаз, затем нижнюю фазу отбирают и удаляют из нее органические растворители.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к получению лекарственных препаратов из природного сырья, и может найти применение в промышленном производстве природных легочных сурфактантов.

Легочный сурфактант представляет собой природный комплекс веществ, состоящий из фосфолипидов, нейтральных липидов и сурфактант-ассоциированных белков. Он синтезируется в альвеолоцитах второго типа и экскретируется ими на внутреннюю поверхность легких, создавая таким образом высокоспецифическую легочную "смазку". Сурфактант покрывает поверхность альвеолярного эпителия и, обладая способностью резко снижать поверхностное натяжение на границе раздела воздух-вода, способствует нормальной механике дыхания и предотвращает коллапс альвеол в конце выдоха.

С этим свойством сурфактанта связана высокая эффективность его при лечении дыхательных расстройств у новорожденных, в особенности недоношенных, у которых, как известно, наблюдается недостаточность системы легочного сурфактанта. До применения сурфактанта смертность среди таких детей была очень высокой. У тех новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, которых удается спасти без использования в схеме лечения сурфактанта, зачастую формируется бронхо-легочная дисплазия вследствие применения искусственной вентиляции легких (ИВЛ) с использованием газовых смесей с высоким (более 60%) содержанием кислорода. Впоследствии эти дети страдают тяжелыми хроническими заболеваниями легких.

Легочный сурфактант является единственным и чрезвычайно эффективным средством профилактики и лечения синдрома дыхательных расстройств и бронхо-легочной дисплазии новорожденных.

В нашей стране и за рубежом в последние годы легочный сурфактант находит все более широкое применение при лечении дыхательной недостаточности некардиогенной природы у взрослых в критических состояниях, под которыми подразумевают синдром острого повреждения легких (СОПЛ) и его наиболее тяжелую форму - респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ), а также тяжелые двусторонние пневмонии.

Наиболее частыми причинами СОПЛ и РДСВ являются сепсис, тяжелая множественная травма, различные токсические состояния. Развитие СОПЛ и РДСВ может происходить вследствие прямого повреждения легочной паренхимы (пневмония, аспирация желудочного содержимого, горячего пара или воздуха, токсических жидкостей и газов, контузия легкого) или при системном поражении организма (сепсис, множественная травма, например, автомобильная, синдром сдавления, острое лучевое поражение, длительная ИВЛ, осложнения после кардиохирургических операций с длительным применением аппаратов искусственного кровообращения, посттрансфузионный и реперфузионный синдромы). Смертность от РДСВ чрезвычайно высока и зависит от фона, на котором он развивается. При множественной травме и синдроме сдавления смертность составляет 50-60%, при сепсисе - 90%, а в случае развития РДСВ на фоне токсического шока и непроходимости кишечника - 100%.

Основой лечения таких больных долгие годы было применение ИВЛ, обычно с жесткими параметрами, т.е. высоким парциальным давлением кислорода во вдыхаемой смеси (FiО₂=0.8-1.0), высоким пиковым давлением на вдохе (больше 35-40 см водн. ст.), большими объемами подаваемой газовой смеси (12-15 мл/кг массы тела) и обязательным положительным давлением в конце выдоха. Эти так называемые жесткие параметры ИВЛ являются дополнительными мощными факторами для течения СОПЛ и РДСВ и часто ухудшают положение больного. В последние годы в лечении РДСВ дополнительно к ИВЛ стали использовать препараты легочного сурфактанта, хорошо зарекомендовавшие себя при лечении синдрома дыхательных расстройств новорожденных. Реаниматологи в настоящее время придерживаются концепции "безопасной" ИВЛ (концентрация кислорода менее 60%, пиковое давление менее 30 см водн.ст., дыхательный объем 4-6 мл/кг вместо 12-15 мл/кг). Сурфактанты позволяют быстро переходить на режимы "безопасной" ИВЛ.

Известно несколько препаратов сурфактанта: синтетические (Exosurf, Glaxo-Wellcome, США-Великобритания; ALEK, Britanica, Великобритания), полусинтетические (Surfactant-TA, Tokyo Tanabe, Tokyo, Япония; Survanta Ross/Abbout Lab, Chicago, США) и природные (Curosurf, Chiesi Farmaceutici, Farma, Италия; Альвеофакт,ТЬоте GmbH, Biberach, Германия; Infasurf, Forrest Labs, St. Louis, США; CLSE, Rochester, NY, США; Сурфактант-HL и Сурфактант-BL).

Считают, что синтетические сурфактанты менее эффективны, хотя они безусловно более доступны. В то же время эти препараты в отличие от природных не содержат чрезвычайно важных для их свойств сурфактант-ассоциированных белков, которые очень важны для проявления способности фосфолипидов сурфактанта снижать поверхностное натяжение на границе раздела фаз (поверхность альвеол - воздух), в то время как синтетические препараты, в том числе Экзосурф, не содержат этих белков. Снижение же силы поверхностного натяжения на поверхности легочных альвеол, осуществляемое фосфолипидами в кооперации с сурфактант-ассоциированными белками, облегчает процесс раскрытия альвеол во время вдоха, уменьшая необходимое для этого усилие мышц грудной клетки. С этими белками связывают антибактериальную и антивирусную активность сурфактантов, способность этих белков проявлять активность хемиатрактантов по отношению к альвеолярным макрофагам, стимулировать комплемент-зависимый и антитело-зависимый захват патогенных бактерий и вирусов альвеолярными макрофагами и т. д. Они, кроме того, подавляют in vitro способность полиморфно-ядерных лейкоцитов и альвеолярных макрофагов к экскреции (освобождению) цитокинов - молекулярных компонентов провоспалительного каскада. Последние повреждают альвеолокапиллярную мембрану - основное структурное и функциональное звено легочного газообмена.

Наибольшее количество, а именно 2% сурфактант-ассоциированных белков, содержат отечественные природные препараты Сурфактант-HL (патент 2066197) и Сурфактант-BL (патент 2066198).

С использованием этих препаратов (патент 2149015) нами проведено лечение 38 новорожденных с постнатальными пневмониями, что позволило снизить их летальность с 30 до 5%. Кроме того, проведено лечение РДСВ у новорожденных - их число к настоящему времени составляет 480, при этом значительно сокращается время пребывания ребенка на ИВЛ и в 2-3 раза снижается летальность.

Сурфактанты HL и BL используются и для лечения дыхательной недостаточности при критических состояниях у детей (патент 2149017) и позволяют достаточно быстро добиться ее купирования. При этом значительно сокращается время нахождения больного на жестких параметрах ИВЛ - до 2-12 часов (от 12 часов до 13 суток в известных способах) и ее общей продолжительности от 24 до 72 часов, т.е. обеспечивается быстрое устранение ятрогенных (врачебных) факторов повреждения легких, а также факторов повреждения, связанных с течением РДСВ, что является очень важным для профилактики фиброзировання легких - наиболее частого осложнения у выживших больных, число которых, как показывает наш опыт, составляет более 90%. При этом нам удалось снизить количество вводимого препарата сурфактанта до 1.5-2 г на курс лечения, в то время как в известных способах лечения дыхательной недостаточности при критических состояниях используется 18-24 г природных сурфактантов (Infasurf) и 32-64 г полусинтетических (Survanta). Если учесть высокую стоимость препаратов сурфактанта, то уменьшение количества используемого при лечении препарата существенно снижает его стоимость. Стоимость курса лечения с использованием, например, природного сурфактанта Infasurf оценивается в 35000 $ США [Timmons O.D. et al., J. Pediatrics, 1991, V. 119, 896-899].

Следует отметить, что сокращение времени пребывания детей и взрослых на ИВЛ мы объясняем, в первую очередь, осуществлением в наших способах сурфактант-терапии с первых часов развития дыхательной недостаточности, тогда как в известных способах ее начинают через 2-71 день нахождения больного на ИВЛ.

Сурфактанты-BL и HL использованы нами ранее и при лечении острых бронхопневмоний (ОБПН), осложненных ателектазом (AT) (патент 2149014). Частота возникновения AT как осложнения ОБПН у детей составляет 16.7% от всех ОБПН. Экстраполяция на население России позволяет считать, что около 15000 детей ежегодно страдают ОБПН, осложненными AT. При этом традиционные методы лечения стойких AT позволяют лишь в 57-60% случаев добиться полного разрешения AT и требуют для этого многократных (5-6) санационных бронхо- или фибробронхоскопий, что чрезвычайно травматично, а у детей до 10 лет требуют применения общего наркоза. Длительное существование AT нередко (в 10-12% случаев) приводит к фиброзированию участка (сегмента) легкого, персистенции в этой зоне бактериальной (гнойной) инфекции, развитию деформирующего бронхита с участком пневмосклероза или формированию бронхоэктазов.

В последнем случае возникает необходимость оперативного лечения таких больных. Нам удалось с применением Сурфактантов-BL и HL получить положительные результаты в виде полного, в течение 3-5 дней, расправления AT после одно-двукратного введения их в количестве 100-300 мг путем селективной фибробронхоскопии при сроке существования AT до 45 суток.

К настоящему времени при критических состояниях с использованием Сурфактантов-BL и HL прошло лечение более 100 взрослых и детей с получением положительных результатов.

И, наконец, Сурфактант-BL нашел применение для профилактики пневмоний и РДСВ при аспирации желудочного содержимого (АЖС) (патент 2149018). Известно, что АЖС является второй-третьей по частоте причиной РДСВ. Тяжелые пневмонии и РДСВ, развивающиеся вследствие АЖС, являются критическими состояниями, обусловленными дыхательной недостаточностью некардиогенной природы, и требуют для лечения больных применения всего арсенала реанимационных мероприятий, в том числе ИВЛ. Несмотря на это после случившейся АЖС предотвратить развитие пневмонии или РДСВ практически невозможно, что в 90% случаев приводит к летальному исходу. И только применение больному, находящемуся на ИВЛ, препаратов сурфактанта сразу после снятия возникшего у него бронхоспазма болюсно или в виде аэрозоля с помощью ингаляции в течение 4-6 часов ежедневно в течение 2-3 дней не позднее 12 часов после случившейся АЖС позволяет предотвратить развитие пневмонии и РДСВ и тем самым повысить выживаемость.

Подводя итоги вышеописанному, можно констатировать, что сурфактант-терапия при критических состояниях имеет решающее значение для профилактики и лечения возникающих при них СОПЛ и РДСВ. Основные достоинства ее заключаются в том, что именно она обеспечивает

- сокращение срока нахождения больного на ИВЛ до 7 суток (против 20-40 без его применения);

- купирование РДСВ в 85% случаев (против 40% при традиционном лечении);

- летальность больных, отвечающих на введение сурфактанта, а их большинство (86%) составляет 16% (по литературным данным - 60-90%). Летальность среди не отвечающих на препарат - 70-80%.

В 2001 г. в Центральном НИИ туберкулеза РАМН совместно с нами попробовали использовать Сурфактант-BL при лечении туберкулеза (Т) легких у тех больных, которые были невосприимчивы к противотуберкулезной химиотерапии и неожиданно для себя получили настолько хорошие результаты, что исследование в этом направлении продолжили и расширили. К настоящему времени в Центральном НИИ туберкулеза РАМН успешно проведено лечение более 30 больных, при этом Сурфактант-BL вводили в схему стандартной противотуберкулезной терапии как при впервые выявленном распространенном деструктивном Т легких, так и при хронически текущем Т. Хороших результатов удается достичь даже при наличии лекарственной устойчивости, в том числе множественной, - за короткие сроки (2-4 мес) нами получено абациллирование, закрытие полостей распада, оставались лишь незначительные остаточные изменения в легких. Причем, это распространяется на больных, которые 2-6 мес до включения в схему лечения Сурфактанта-BL не имели положительной рентгенологической динамики или с незначительным положительным эффектом. Причем, положительный эффект в виде значительного уменьшения интенсивности бактериовыделения, размеров каверн и рассасывания инфильтрации получен даже у абсолютно безнадежных в плане излечения больных. В связи с этим непонятным нам механизмом воздействия Сурфактанта-BL на течение туберкулезного процесса, но имеющего такой неожиданно высокоэффективный положительный результат, в Институте туберкулеза ставится вопрос о значительном расширении клинических испытаний Сурфактанта-BL в противотуберкулезной терапии, для чего потребуется большое количество препарата.

В настоящее время Сурфактант-BL производится в нашей стране только в ООО "Биосурф" при Центральном научно-исследовательском рентгено-радилогическом институте МЗ РФ. Способ получения Сурфактанта-BL был разработан в лаборатории биотехнологии ЦНИРРИ МЗ РФ и защищен патентом 2066198. В ООО "Биосурф" разработан промышленный регламент получения препарата и налажен серийный выпуск его с мощностью 20000 флаконов в год.

Способ получения Сурфактанта-BL по патенту 2066198 взят нами в качестве прототипа, согласно которому 10 кг легкого быка отмывают водой от крови, освобождают от крупных сосудов, разрезают на куски около 0,5 кг и пропускают через ножевую мясорубку. К измельченным легким добавляют 50 л холодного (+4^oС) физиологического раствора (0,9% раствора хлорида натрия) и перемешивают при +4^oС в течение 15 мин. Гомогенат фильтруют через марлю, осадок выбрасывают, а фильтрат центрифугируют при 150 g в течение 10 мин. Полученный супернатант (51 л) замораживают при -20^oС в течение 60 мин, после чего оттаивают при температуре +4^oС. Полученную суспензию центрифугируют при 3000 g на проточной центрифуге в течение 30 мин при +4^oС. Полученный осадок (12 г) экстрагируют по Блайю и Дайеру. Для этого его ресуспендируют в 240 мл дистиллированной воды, добавляют 900 мл смеси из 300 мл хлороформа и 600 мл метанола и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. После этого добавляют 300 мл хлороформа и 300 мл 0.18% раствора хлорида калия. Суспензию перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре в атмосфере аргона и центрифугируют при 600 g в течение 20 мин. Из образовавшейся двуфазной системы верхнюю отбрасывают, а нижнюю отбирают и удаляют из нее органические растворители на ротационном испарителе RVO-64 при температуре 37^oС. Сухой остаток ресуспендируют в 200 мл дистиллированной воды и лиофилизируют.

Получают 10 г белого с кремоватым оттенком цвета аморфного порошка. Результаты анализа, г:

Фосфолипиды - 8,9

Нейтральные липиды - 0,9

Белок - 0,2

Содержание фосфолипидов определяют по липидному фосфору, анализ которого проводят по методу Васьковского [Vaskovsky V.E. et al., J. Chromatography, 1975, V. 114, Р.129-141], содержание белка определяют по методу Лоури [Lowry O. H. et al., J. Biol. Chem., 1951, V. 193, Р.251-257] после делипидизации материала хроматографией в тонком слое силикагеля. Выявлены группы белков с м.м. 18 кДа и 5-8 кДа, которые специфичны для природного сурфактанта. Других белков не обнаружено. Анализ на содержание ДНК отрицательный.

Подлинность препарата подтверждена

- положительным пенным тестом,

- исследованием фосфолипидного состава с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системах: хлороформ-метанол-7N NH₃ (65:25:5) и хлороформ-ацетон-метанол-уксусная кислота-вода (30: 40: 10:10:5). Согласно анализу, в препарате присутствуют все основные классы фосфолипидов, свойственные природному сурфактанту при выходе конечного продукта 1 г препарата из 1 кг легкого быка.

Однако, в известном способе очень трудоемким по энергозатратам, трудозатратам и времени является этап замораживания и последующего оттаивания. При больших объемах экстракта замораживание его требует не менее 3 суток при температуре -20^oС и столько же времени на оттаивание, что значительно удлиняет процесс получения конечного продукта. Кроме того, измельчение легких с помощью ножевой мясорубки превращает сырье в пастообразную массу, выделение сурфактанта из которой происходит со значительными его потерями. Указанная технология приводит к получению субстанции сурфактанта, загрязненной тканевыми липидами.

Таким образом, в настоящее время отсутствует высокотехнологичный, нетрудоемкий способ, позволяющий получить не только очищенную субстанцию, но и с высоким выходом целевого продукта, отвечающего требованиям Временной Фармакопейной статьи.

В предлагаемом изобретении поставлена и решена задача получения легочного сурфактанта из природного сырья, сохраняющего нативные свойства и высокую биологическую активность. Указанные свойства предполагают возможность его эффективного использования в медицинской практике как при острой дыхательной недостаточности критических состояний новорожденных и взрослых, так и при других заболеваниях легких.

Способ, являющийся предметом настоящего изобретения, основан на использовании новейших технологических приемов, обеспечивающих минимальные трудозатраты, быстроту манипуляций и промышленно значимый выход высококачественного продукта.

Эта задача реализована способом, заключающимся в том, что легкие крупного рогатого скота в физиологическом растворе измельчают разрезанием на кусочки со сторонами не более 5 мм с одновременным проточным экстрагированием, фильтруют, фильтрат центрифугируют на проточной центрифуге при 100-150 g и скорости протока 5-6 л/мин, надосадочную жидкость подвергают повторному проточному центрифугированию при 15000 - 20000 g со скоростью протока 1-1,5 л/мин, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде, образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10000-15000 g в течение 45-60 мин, к осадку добавляют дистиллированнную воду, экстрагируют смесью хлороформа и метанола в соотношении 1:1-3:1 в атмосфере аргона, экстракт промывают 0,1% раствором хлорида калия или кальция, суспензию оставляют до разделения фаз, затем нижнюю фазу отбирают и удаляют из нее органические растворители.

Измельчение легкого разрезанием его на кусочки с размерами сторон не более 5 мм максимально сохраняет целостность клеток, что уменьшает выход в экстракт клеточных липидов, от которых затем необходимо длительно очищать получаемый сурфактант. При такой нарезке сырья в сочетании с проточным экстрагированием его практически получается лаважная жидкость, что в дальнейшем облегчает очистку конечного продукта.

Совмещение нарезки сырья с проточным экстрагированием сырья значительно сокращает время очистки препарата и уменьшает его потери. Этот прием позволяет исключить операцию по замораживанию с последующим оттаиванием экстракта, что значительно сокращает время всей процедуры выделения сурфактанта и делает способ технологичным.

При центрифугировании экстракта на низких оборотах (100-150 g) происходит практически полное освобождение от обрывков ткани легкого и клеток, а центрифугирование полученного супернатанта при высоких оборотах (15000-20000 g) обеспечивает осаждение сурфактанта со значительно меньшим количеством примесей.

Последующее промывание его водой и центрифугирование получаемой суспензии обеспечивает дополнительную очистку сурфактанта от пигментов и нелипидных примесей.

Заявленный способ позволяет получать сурфактант (Сурфактант-BL) в течение 7 рабочих дней и с выходом более 2 г из 1 кг сырья.

Сурфактант-BL разрешен Приказом МЗ РФ 261 от 14.07.2000 г. к медицинскому применению, одновременно на него утверждена ВФС 42-3120-98.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. 10 кг легкого крупного рогатого скота отмывают холодной водой от крови, загружают в реактор, снабженный роторно-статорным измельчителем, добавляют 50 л холодного +4^oС физиологического раствора, измельчают разрезанием легкого на кусочки с размерами сторон не более 5 мм с одновременным проточным экстрагированием при +4^oС и фильтруют через сетчатый фильтр. Осадок выбрасывают, а фильтрат центрифугируют на проточной центрифуге при 150 g и скорости протока 6 л/мин. Надосадочную жидкость (50 л) подвергают повторному проточному центрифугированию при 15000 g со скоростью протока 1 л/мин. Полученный осадок ресуспендируют в 6 л дистиллированной воды и образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10000 g в течение 60 мин при +4^oС.

К полученному осадку (24 г) добавляют 640 мл дистиллированнной воды и экстрагируют 3600 мл смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1, в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. Для удаления нелипидных примесей хлороформно-метанольный экстракт промывают 0,1% раствором хлорида калия. Образовавшуюся суспензию оставляют при комнатной температуре до разделения фаз. Нижнюю фазу отбирают и удаляют из нее органические растворители. Получено 22.5 г препарата, т.е. 2.25 г из 1 кг исходного сырья. Сухой остаток ресуспендируют в 800 мл дистиллированной водой. После определения содержания фосфолипидов, которая составила 28,1 мг/мл, полученную эмульсию разливают по 2,67 мл во флаконы (по 75 мг фосфолипидов в каждом флаконе) и лиофилизируют. Всего получено 300 флаконов.

Анализ полученного препарата проводят на содержание фосфолипидов по Васьковскому и белка - по Лоури. Количество белка в каждом флаконе - 1.5 мг. Препарат отвечает требованиям ВФС, согласно которой содержание фосфолипидов должно быть от 68 до 82 мг, белка - от 1,5 до 2,3 мг во флаконе.

Пример 2. 10 кг легкого крупного рогатого скота отмывают холодной водой от крови, загружают в реактор, снабженный роторно-статорным измельчителем, добавляют 45 л холодного +4^oС физиологического раствора, измельчают разрезанием легкого на кусочки с размерами сторон не более 5 мм с одновременным проточным экстрагированием при +4^oС и фильтруют через сетчатый фильтр. Осадок выбрасывают, а фильтрат центрифугируют на проточной центрифуге при 100 g и скорости протока 5 л/мин. Надосадочную жидкость (45 л) подвергают повторному проточному центрифугированию при 20000 g со скоростью протока 1,5 л/мин. Полученный осадок ресуспендируют в 5 л дистиллированной воды и образовавшуюся суспензию центрифугируют при 15000 g в течение 45 мин при +4^oС.

К полученному осадку (22,5 г) добавляют 480 мл дистиллированнной воды и экстрагируют 2400 мл смеси хлороформа и метанола в соотношении 3:1, в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. Для удаления нелипидных примесей хлороформно-метанольный экстракт промывают 0,1% раствором хлорида кальция. Образовавшуюся суспензию оставляют при комнатной температуре до разделения фаз. Нижнюю фазу отбирают и удаляют из нее органические растворители. Получено 22 г сурфактанта-BL, который ресуспендируют в 800 мл дистиллированной воды. После определения содержания фосфолипидов, которая составила 27.5 мг/мл, полученную эмульсию разливают по 2.73 мл во флаконы (по 75 мг фосфолипидов в каждом флаконе) и лиофилизируют. Всего получено 293 флакона.

Количество белка в каждом флаконе - 1,5 мг. Препарат отвечает требованиям ВФС.

Пример 3. 10 кг легкого обрабатывают аналогично примеру 2. Полученный осадок (24 г) экстрагируют смесью хлороформа и метанола в соотношении 1:1. Получено 20.8 г сурфактанта-BL, который ресуспендируют в 800 мл дистиллированной воды. После определения содержания фосфолипидов, которая составила 26,0 мг/мл, полученную эмульсию разливают по 2,9 мл во флаконы (по 75 мг фосфолипидов в каждом флаконе) и лиофилизируют. Всего получено 275 флаконов.

Количество белка в каждом флаконе - 1,5 мг. Препарат отвечает требованиям ВФС.