способ подготовки биоткани для ксенопротезирования

Формула изобретения

Способ подготовки биоткани для ксенопротезирования путем обработки биоткани ферментом в буферном растворе, последовательной отмывки в кислотном растворе, в растворе гидрокарбоната натрия и растворах хлорида натрия, выдержки в многократно заменяемых растворах глутарового альдегида с возрастающей концентрацией и стерилизации, отличающийся тем, что перед ферментативной обработкой биоткань в течение 15-72 ч выдерживают в гипертоническом растворе хлорида натрия 1-10%-ной концентрации, ферментативную обработку проводят при 32-37^oС в боратном буферном растворе, а при отмывке в качестве кислотного раствора используют 0,6-6%-ный раствор уксусной кислоты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к протезированию клапанов сердца.

Известны способы обработки биоткани с целью подавления ее минерализации путем контактирования ткани с водным раствором четвертичной аммонийной соли, в составе которой есть, по крайней мере, один из алкильных радикалов, содержащих 7-15 атомов углерода (Авт. св. СССР 4405327, МКИ 6 А 61 F 2/24, 1983), а также способ, включающий обработку биоткани 2-5%-ным раствором диглицидилового эфира этиленгликоля с последующей обработкой раствором гепарина с концентрацией не менее 100 МЕ/мл (Пат. РФ 2008767 С1, МКИ 6 А 01 N 1/00, 1994).

Недостатком этих способов является тот факт, что обработка раствором четвертичной аммониевой соли либо последовательная обработка биоткани раствором диглицидилового эфира этиленгликоля и гепарином лишь экранируют поверхность биоткани, ограничивая, таким образом, доступ минеральных (кальциевых и форфатных) соединений, а при малейшем нарушении этого "экрана" процесс минерализации развивается. Кроме того, отсутствие ферментативной обработки не обеспечивает снижения иммуногенности.

Наиболее близким к заявляемому является способ подготовки биоткани для ксенопротезирования путем ферментативной обработки террилитином в фосфатном буферном растворе (из расчета 30 протолитических единиц на 1 г веса влажной ткани ПЕ/г) в течение 4 ч при 43^oС, последовательной отмывки в кислотном растворе (20 г лимонной кислоты, 100 г хлорида натрия и 1 л воды), в 1 М растворе гидрокарбоната натрия и растворах хлорида натрия, выдержки в многократно заменяемом растворе глутарового альдегида в буферном растворе с возрастающей концентрацией и стерилизации (Авт. св. СССР 1398855, МКИ 6 А 61 F 2/24, 1988).

Недостатками данного способа являются высокая концентрация фермента, вызывающая разрушение коллагеноэластической основы биоткани, высокая температура ферментативной обработки, что может привести к снижению активности фермента, а также использование фосфатного буферного раствора в качестве растворителя фермента и лимонной кислоты для создания кислой среды при отмывке, что приводит к образованию нерастворимых фосфатов и цитратов и дальнейшей минерализации биоткани.

Предлагаемый способ устраняет указанные недостатки.

Целью данного технического решения является уменьшение расхода фермента и предотвращение минерализации биоткани.

Сущность способа состоит в том, что биоткань для ксенопротезирования перед ферментативной обработкой выдерживают в течение 15-72 ч в гипертоническом растворе хлорида натрия 1-10%-ной концентрации, обрабатывают ферментом в боратном буферном растворе при 32-37^oС, отмывают сначала в 0.6-6%-ном растворе уксусной кислоты, затем в растворе гидрокарбоната натрия и растворах хлорида натрия, выдерживают в многократно заменяемом растворе глутарового альдегида в буферном растворе с возрастающей концентрацией и стерилизуют.

Отличие заявляемого способа состоит в том, что перед ферментативной обработкой биоткань в течение 15-72 ч выдерживают в гипертоническом растворе хлорида натрия 1-10%-ной концентрации, ферментативную обработку проводят при 32-37^oС в боратном буферном растворе, а при отмывке в качестве кислотного раствора используют 0,6-6%-ный раствор уксусной кислоты.

Ферментативная обработка биоткани необходима для разрушения клеточных элементов (иммуногенных компонентов).

Отмывка после ферментативной обработки биоткани в кислотном растворе инактивирует проникающий в биоткань фермент и предотвращает ее дальнейшее разрушение.

Раствор гидрокарбоната натрия нейтрализует оставшуюся после инактивации кислоту, а солевые растворы хлорида натрия вымывают продукты протеолиза после ферментативной обработки.

Помещение биоткани в раствор глутарового альдегида необходимо для дубления биоткани для ее структурной стабилизации и увеличения иммуногенности.

Последовательное увеличение концентрации альдегида позволяет провести дубление сначала в более мягких условиях и дать возможность проникнуть во внутренние слои биоткани, образуя внутренние сшивки, а затем закрепить эффект, увеличив число сшивок в поверхностных слоях.

Выдерживание биоткани перед ферментативной обработкой в растворе хлорида натрия сохраняет структуру биоткани и ускоряет разрушение иммуногенных клеточных элементов, что позволяет понизить концентрацию фермента в 1,5-3 раза по сравнению с прототипом, сократив, таким образом, его расход.

Выбор концентрации солевого раствора предварительной обработки обусловлен тем, что растворы с концентрацией, близкой к изотонической (0,85-1%), практически не влияют на состояние волокон и клеточных элементов биоткани, в гипотонических растворах (менее 0,85%) происходит набухание биоткани, что нарушает ее структуру. Превышение 10%-ной концентрации растворов хлорида натрия может вызвать разрушение структуры коллагеновых волокон.

Выдержка биоткани в гипертоническом растворе менее 15 ч не обеспечивает необходимого эффекта, солевая обработка более 72 ч не имеет смысла, так как за это время процесс разрушения иммуногенных клеточных элементов полностью завершен.

Проведение ферментативной обработки выше 37^oС может привести к разрушению коллагеноэластической структуры биоткани, уменьшение температуры ниже 32^oС не гарантирует сохранность биоткани.

Замена фосфатного буферного раствора на боратный в качестве растворителя фермента, так же как и замена лимонной кислоты на уксусную при постферментативной обработке биоткани, позволяет избежать образования нерастворимых соединений кальция.

Концентрация раствора уксусной кислоты менее 0,6% полностью не инактивирует фермент, более 6% разрушает биоткань.

Способ подготовки биоткани для ксенопротезирования осуществляется следующим образом.

Образец биоткани помещают в банку с раствором хлорида натрия 1-10%-ной концентрации из расчета 10 мл раствора на 1 г биоткани, закрывают крышкой и оставляют на 15-72 ч. После чего образец вынимают, промывают проточной водой и помещают в раствор фермента террилитина на боратном буфере (из расчета 3 мл боратного буфера и 10-20 ПЕ на 1 г влажной биоткани) и выдерживают при 32-37^oС в течение 4 ч. По истечении указанного времени биоткань извлекают из раствора, промывают проточной водой и погружают на 20 м в кислотный раствор (6-60 г уксусной кислоты, 100 г хлорида натрия и 894-840 г воды). После кислотной отмывки образец промывают проточной водой и переносят сначала на 20 мин в 0,1 М раствор гидрокарбоната натрия, а затем, после промывки проточной водой, последовательно помещают в 2 и 7%-ные растворы хлорида натрия на 17 и 6 ч соответственно. Количественное соотношение масс образца биоткани и растворов для постферментативной отмывки составляет не менее 1:10. После извлечения образца биоткани из солевого раствора и промывки в проточной воде биоткань выдерживают в многократно заменяемых растворах глутарового альдегида с увеличивающейся концентрацией и стерилизуют.

Примеры конкретного выполнения способа даны в таблице.

Применение заявляемого способа позволяет сократить расход дорогостоящих реактивов и уменьшить вероятность минерализации биоткани.