способ размножения стромальных клеток тестикул (семенников), мужских половых зародышевых клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов

Формула изобретения

Способ размножения стромальных клеток тестикул (семенников), мужских половых зародышевых клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов, включающий их выделение, адаптацию и культивирование, а также интеграцию (вшивание) в них генетического вектора, отличающийся тем, что размножение осуществляют в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота (КРС), энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для размножения зародышевых клеток, внедрения (вшивания) генетического вектора нужной направленности и получения сперматозоидов с дополнительной генетической информацией для последующего получения трансгенных животных.

Известен способ получения мышиных сперматогоний в течение четырех месяцев в культуре клеток in vitro, с последующим продолжением сперматогенеза после трансплантации этих клеток в семенные канальцы реципиента (Nagano M., Avarbock MR, Leonida ЕВ, Brinster C.J., Brinster RL, "Culture of mouse spermatogonial cells". 1: Tissue Cell 1998 Aug, 30 (4): 389-97). Однако указанный способ не обеспечивает однотипность сперматогоний и сформировавшихся сперматозоидов, поскольку они смешиваются со сперматозоидами реципиента, требует предварительного подавления иммунологической реактивности организма реципиента для профилактики отторжения донорских клеток, а также указанный способ не позволяет получать в промышленных масштабах указанные клетки.

Целью заявляемого изобретения является накопление пула зародышевых клеток, внедрения генетического вектора нужной направленности в процессе их размножения и получения сперматозоидов с дополнительной генетической информацией для последующего получения трансгенных животных. Указанная цель достигается тем, что размножение клеток осуществляют в биреакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота (КРС), энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Берут семенники у эмбрионов и/или у молодых, и/или половозрелых особей с соблюдением асептики. Ткани семенников и придатков измельчают и диспергируют в солевом буферном растворе без кальция и магния и помещают в культуральные флаконы или биореакторы с культуральной средой следующего состава (в об%): фетальная сыворотка КРС - 5,0; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) - 0,015; фактор роста (ИФР-1) - 0,015; соматомедин - А 0,001; аденозиндифосфат (АДФ) - 0,001; аденазинтрифосфат (АТФ) - 0,015; соматомедин В - 0,001; соматомедин С - 0,001; глюкоза - 0,1; 20% - водно-спиртовой экстракт тканей семенников, взятых в период наступления половой зрелости - 3,0 и среда 199 - остальное до 100. Культивируют смесь тестикулярных клеток эмбрионов, молодых и половозрелых особей и параллельно ведут раздельное культивирование клеток тестикул этих особей. Культивирование проводят при температуре 3438^oС; рН 7,07,4 ед.; рО₂ 3050% насыщения и еН 180-220 мВ. Продолжительность первого этапа культивирования зависит от начала появления сперматогоний в популяции клеток. Обычно на это уходит 72-96 часов. Деление мужских зародышевых клеток может происходить как в полисистеме (смесь тестикулярных клеток эмбрионов, молодых и половозрелых особей), так и в моносистеме (раздельное культивирование клеток тестикул этих особей).

Пример 2. На втором этапе культивирование осуществляют в обогащенной питательной среде следующего состава (в об%): среда Игла - 40,0; фетальная сыворотка КРС - 10,0; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) - 0,03; фактор роста (ИФР-2) - 0,03; инсулин 40 м. ед. на 1 л среды, глюкоза 0,15; лактоза 0,05; аденозинтрифосфат (АТФ) - 0,02; аденозиндифосфат (АДФ) - 0,02 и среда 199 - остальное до 100. Обеспечивают поверхность субстрата для опорозависимых клеток путем добавления макро- и/или микроносителей. Культивирование проводят при температуре 3438^oС; рН 7,07,4 ед. ; рО₂ 3050% насыщения и еН 140180 мВ. В процессе культивирования проводят микроскопический контроль состава клеточной популяции. Продолжительность второго этапа культивирования зависит от степени репродукции и накопления сперматогоний.

При достижении концентрации сперматогоний не менее 0,2 млн. в 1 мл среды и появлении сперматоцитов проводят интеграцию (вшивание) генетического вектора нужной направленности путем адсорбации вектора на поверхность сперматогоний и сперматоцитов с последующим проникновением в клетки.

Пример 3. На третьем этапе культивирования используют среду следующего состава (в об%): среда 199-50; среда RPMJ - 1640-20; фетальная сыворотка КРС - 20; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) - 0,015; фиторостовой фактор (ФРФ) - 0,015; фактор роста-2 (ИФР 2) - 0,015; фетуин - 0,015; трансферин - 0,015; глюкоза - 0,15; лактоза - 0,05; сахароза - 0,05; аденозинтрифосфат (АТФ) - 0,001; аденозиндифосфат (АДФ) - 0,001; сыворотка крови самцов соответствующего вида в период наступления половой зрелости 4,0; среда Игла - остальное до 100,0. Культивирование проводят при температуре 3335^oС; рН 7,0-7,4 ед; pО₂ 30-50% насыщения и еН 140-180 мВ. Культивирование осуществляют в течение 15-45 суток.

Регулярно через 48 часов проводят микроскопический и генетический контроль популяции клеток. При достижении концентрации сперматоцитов не менее 0,2 млн. в 1 мл среды и при обнаружении генетического вектора нужной направленности не менее чем у 90% клеток переходят к четвертому этапу культивирования.

Пример 4. Сперматоциты концентрируют не менее чем в 10 раз и культивируют до полной дифференции клеток в зрелые сперматозоиды. Культивирование проводят в питательной среде следующего состава (в об%): среда 199-50; среда RPMJ-1640-20; фетальная сыворотка КРС - 20; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) - 0,015; фиторостовой фактор (ФРФ) - 0,015; фактор роста 2 (ИФР-2) - 0,015; лактоза - 0,05; сахароза - 0,05; аденозинтрифосфат (АТФ) - 0,001; аденозиндифосфат (АДФ) - 0,001; сыворотка крови самцов соответствующего вида в период наступления половой зрелости - 4,0; триптозофосфатный бульон - 0,5; эмбриональный экстракт - 0,5; среда Игла - остальное до 100.

Культивирование проводят при температуре 33-35^oС; рН 7,0-7,4 ед.; рО₂ 30-50% насыщения и еН 140-180 мВ.

В процессе четвертого этапа культивирования проводят микроскопический контроль популяции клеток. При морфологической зрелости спрематозоидов не менее чем в 90% случаев их концентрируют не менее чем в 10 раз и используют для формирования криобанка спермы с генетическим вектором.

Сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности можно использовать для получения трансгенных животных.

Преимущества заявляемого способа:

1. Заявляемый способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма.

2. Заявляемый способ позволяет получить однородные популяции сперматозоидов с генетическим вектором нужной направленности и избежать феномена иммунологического отторжения донорских сперматогоний в организме реципиента.